Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ex vivo Culture of Chick lillehjernen Slices og Romlig Målrettet Electroporation av granulat Cell Forstadier

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

Lillehjernen eksterne granulat laget er åsted for det største transitt forsterkning i utviklingen av hjernen. Her presenterer vi en protokoll for å målrette genmodifisering til dette laget på toppen av spredning ved hjelp av ex vivo elektroporering og kulturen i lillehjernen skiver fra embryonale Day 14 kyllingfoster.

Abstract

Lillehjernen eksterne granule lag (EGL) er stedet for den største transitt forsterkning i utviklingen av hjernen, og en utmerket modell for å studere neuronal spredning og differensiering. I tillegg er det evolusjonære modifikasjoner av den proliferative evne vært ansvarlig for den dramatiske utvidelse av lillehjernen størrelse i amniotes, noe som gjør cerebellum en utmerket modell for evo-Devo studier av virveldyr hjernen. Konstituerende cellene i EGL, lillehjernen granule stamfedre, også representerer en betydelig celle utstedt medulloblastoma, den mest utbredte pediatrisk nevronale svulst. Etter sin vei forsterkning, granule forløpere migrere radielt inn i den indre granulære lag av lillehjernen, hvor de representerer den største neuronal populasjon i den modne hjernen hos pattedyr. I chick, oppstår toppen av EGL proliferasjon mot slutten av den andre uken av drektighetsperioden. For å målrette genetisk modifisering av dette lag vedtoppen av spredning, har vi utviklet en metode for genetisk manipulasjon gjennom ex vivo elektroporering av lillehjernen skiver fra embryonale Day 14 kyllingfoster. Denne metoden sammenfatter flere viktige sider ved in vivo granule neuron utvikling og vil være nyttig i å generere en grundig forståelse av cerebellar granule celleproliferasjon og differensiering, og dermed av cerebellum utvikling, evolusjon og sykdom.

Introduction

Lillehjernen sitter på fremre enden av hindbrain og er ansvarlig for integrering av sensorisk og motorisk behandling i modne hjernen samt regulere høyere kognitive prosesser 1. I pattedyr og fugler, besitter det en forseggjort morfologi og er tungt foliert, et produkt fra transitt omfattende forsterkning av progenitorceller under utvikling som produserer over halvparten av nervecellene i den voksne hjernen. Lillehjernen har vært gjenstand for studier for nevrobiologer i århundrer og i molekylær epoken har også fått betydelig oppmerksomhet. Dette gjelder ikke bare for sin iboende interessant biologi, men også til det faktum at det er sterkt implisert i human sykdom inkludert utviklings genetiske lidelser så som autisme 2 og er mest fremtredende i cerebellar kreft, medulloblastom 3, som er den mest utbredte pediatriske hjerne svulst. Viktigst er det en utmerket modell system innen which å studere skjebnen tildeling og neurogenesis under hjernens utvikling 4. I de senere årene har det også blitt etablert som et modellsystem for sammenlignende studie av hjernens utvikling, på grunn av den enorme mangfoldet av lillehjernen former sett over virveldyr fylogeni 5-10.

Lillehjernen utvikler seg fra rygghalvparten av rhombomere en i hindbrain 11 og utviklingsmessig består av to primære progenitor populasjoner, rombe leppen og ventrikulær sone. Den rhombic leppe strekker seg rundt rygg regionen i neuroepithelium av hindbrain på grensen med taket plate. Det er fødestedet til de glutamaterge eksitatoriske nevroner i lillehjernen 12-14. Ventrikulære sonen gir opphav til de hemmende gabaergic cerebellare nevroner, mest fremtredende de store Purkinje nevroner 14,15. Senere i utvikling (fra ca embryonale dag 13,5 i mus, e6 i chick 16), glutamatergic Progenitors migrere tangentielt fra rhombic leppe og danne et pial lag av stamfedre: en sekundær stamfar sone kalt ekstern granulat lag (EGL). Det er dette laget som gjennomgår omfattende transitt forsterkning som fører til det store antallet granule nevroner som finnes i den modne hjernen.

Spredning i EGL har lenge vært knyttet til sub-pial sted at resultatene fra tangential migrasjon fra rhombic leppe 17, med bryteren til cellesyklusen exit og nevronale differensiering av stamceller bli assosiert med sin exit fra det ytre EGL lag i midten EGL 18. Omfattende tangentiell migrering av post-mitotiske granule celler i medial-lateral akse forekommer i den midtre og indre EGL 19, før den endelige radial migrering inn i det indre granulat laget av modne lillehjernen cortex. Migrering av celler fra rombisk leppen over cerebellar overflaten er avhengig av signalering fra CXCL12 pia 20-22 23-25. Forbløffende nok elektron mikroskopiske studier 17 har antydet at EGL celler med en proliferativ morfologi opprett pial kontakt, linking celle atferd med proliferativ kapasitet på en måte som minner om de basale stamfedre av pattedyr cortex 26. Dette gjenspeiles i den ovenfor nevnte lagdeling av EGL i tre sjikt som er definert av forskjellige ekstracellulære omgivelser og hvor granule forløpere adskilte genekspresjon 18 signaturer.

Proliferasjon av progenitorceller i oEGL oppstår med en normal fordeling av klone størrelser, slik at når forløpere er individuelt genetisk merket i enden av embryoutvikling i mus, gir de opphav til en median gjennomsnitt på 250-500 g postmitoticranule nevroner 27,28. Spredning er avhengig mitogent SHH signale fra underliggende Purkinjefibrene nevroner 29-32. Evnen til å reagere på SHH har vist seg å være helt avhengig av celleautonome ekspresjonen av transkripsjonsfaktor Atoh1, både in vitro og 33 in vivo 34,35. Likeledes har cellesyklus utgang og differensiering blitt vist å være avhengig av ekspresjonen av den nedstrøms transkripsjonsfaktor NeuroD1 36, som mest sannsynlig et direkte repressor av Atoh1 37.

Til tross for denne utviklingen, og et betydelig fremskritt i å tyde cellen biologisk basis av cellesyklus utgang 38-42, til den grunnleggende molekylære mekanismen (e) som ligger til grunn for avgjørelsen avslutter cellesyklus og å gå over fra en progenitor til en differensierende neuron, og tilhørende postmitotic tangentiell migrasjon i den indre EGL, så vel som den senere bryterentil radial migrasjon, forblir ufullstendig forstått. Dette er i stor grad på grunn av den eksperimentelle intractability av EGL: det er forsinket utvikling, og er vanskelig å målrette genetisk siden mange av de samme nevrogene molekyler er også avgjørende tidligere i livet av granule forløpere ved rhombic leppe. For å overvinne dette problemet, har mange forfattere utviklet in vivo og ex vivo elektroporering som en metode for å målrette barsel cerebellum hos gnagere 43-48. Her har vi pioner bruk av ex vivo elektroporering i chick å studere EGL, som representerer betydelige fordeler i form av pris og brukervennlighet. Vår metode for elektroporering og ex vivo skive kultur av chick lillehjernen vev anvendelser vev dissekert fra embryonale Day 14 unger på toppen av EGL spredning. Denne metoden gjør genetisk målretting av EGL uavhengig av rhombic leppe og vil sette scenen for genetisk disseksjon av overgangen fra granulatstamfar til postmitotic granulat nevron i lillehjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle forsøkene ble utført med henhold til Kings College London, UK og retningslinjene UK hjemmekontoret dyr omsorg.

1. Disseksjon av e14 lillehjernen

  1. Inkuber brune befruktede hønseegg ved 38 ° C til embryonale dag 14.
  2. Bruke egg saks halshogge chick embryo i ovo og fjerne hodet til en petriskål med iskald PBS (figur 1A).
  3. Ved hjelp av standard tang, lage snitt bak hvert øye hele veien gjennom vevet, fjerne øyne og øvre kjeve. Foreta en andre snitt hele veien gjennom svelget fjerne underkjeven (figur 1B).
  4. Ved hjelp av standard tang, fjerne all huden fra overflaten av hodeskallen etter peeling det bort (figur 1C) og fjern frontpartiet og parietalbena, avslører hjernen.
  5. Fra en ventral aspekt, fjerne svelget brusk og hjelpe mesenchyme.
  6. Fra en rygg aspekt, forsiktigly fjerne mesenchyme rygg til hindbrain tar seg ikke å skade pia, og separat hele hjernen (figur 1D).
  7. Gjør snitt hele veien gjennom vevet mellom midthjernen og hindbrain og separat hindbrain inkludert cerebellum (figur 1E).
  8. Ved å gjøre snitt hele veien gjennom vevet på begge side veikryssene cerebellum og alar plate av hindbrain, fjerne hele cerebellum, ta vare å opprettholde integriteten til pia gjennom disseksjon (figur 1F). Fjern forming årehinnen plexus (figur 1G).
  9. Flytt dissekert cerebellum i iskald HBSS.

2. Slice Culture of e14 lillehjernen

  1. Overfør hele cerebellum til det sterile planet av en Tissue helikopter ved hjelp av en spatel, eller en 3 ml Pasteur pipette med spissen skåret bort for å utvide åpningen. Fjern overflødig væske ved hjelp av en pipette.
  2. Skjær hele hele cerebellum i than ønsket retning ved 300 mikrometer tykkelse ved hjelp av vev chopper satt med en skjærehastighet på 50% av det maksimale. Tissue integritet er lettest bevart i sagittal delen; imidlertid, er orienteringen også en viktig faktor for celleanalyse (Purkinje-celle dendritter er sagittally innrettet, mens granuler celle aksoner løpe transversalt, perpendikulært til planet av Purkinje-celle dendritter).
  3. Ved hjelp av en 3 ml Pasteur pipette, dekke skiver cerebellum i iskald HBSS.
  4. Overfør skivene i HBSS til en 60 mm petriskål med iskald frisk HBSS med en 3 ml Pasteur pipette med kuttspiss.
  5. Under et disseksjonsmikroskop belyst med en fiberoptisk lyskilde, atskillelse av individuelle stykker ved hjelp av urmaker tang. Identifisere skiver som skal elektroporert, basert på deres vev integritet og Karakter-lateral stilling.
    Merk: Hver disseksjon fra embryo gjennom å skjære inkubasjon i kulturmediet tar rundt 10-20 min avhengig upon opplevelse. Utfør dissections en om gangen for å sikre at cerebella bruke minimum av tid mellom halshugging, og ex vivo kultur.

3. Electroporation av Slices

  1. Konstruere en elektroporasjon skammer ved å feste anoden i en electroporator til bunnen av en 60 mm petriskål med isolasjonstape. Tilsett ca 1 ml HBSS for å dekke elektroden.
  2. Plasser en 0,4 mikrometer kultur innsats på toppen av elektroden dekket i HBSS. Tillat innsatsen kultur å hvile på elektroden og pass på at det ikke alltid er kontakt mellom innsatsen og elektroden.
    NB: I dette oppsettet blir kulturen innsatsen med skivene hviler på overflaten av oppløsningen, opprettholdelse av kretsen, men tillater romlige målretting av katoden.
  3. Overfør identifisert skiver (opptil fem per kultur innsats) på kulturinnsats bruker 3 ml Pasteur pipette med kuttspiss. Separat og la til å bosette seg på kultur innsats i en sagittal orientering.
  4. Ved hjelp av en pipette, fjerne overflødig HBSS slik at skivene ikke lenger er badet i oppløsning.
  5. Ved hjelp av en P10 pipettespiss, pipette DNA (ved en konsentrasjon på 1 pg / pl) ble fortynnet med 20% fast grønn over overflaten av målregionen i et stykke. 20% fast grønn viskøs at DNA-oppløsningen og hindrer prohibitivt bred spredning av DNA. Legg ca 5 mL DNA / rask grønn løsning til hver skive (figur 2B).
  6. Plasser katoden løpet ønsket målrettet vev og electroporate med 3 x 10 V, 10 ms varighet pulser. Unngå direkte kontakt av katoden med vevet. I stedet benytte seg av overflatespenningen i væsken for å opprettholde ledningsevnen (plassere katoden så nær vevet som mulig uten å berøre vevet).
  7. Gjenta DNA levering og elektroporering til flere regioner av EGL på hver enkelt lillehjernen skive som ønsket.
  8. Ved ferdigstillelse av elektroporering, overføring kultur insert til 30 mm petriskål.
  9. Til hver kultur, tilsett 1 ml forvarmet kulturmedium (Basal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - glukose, 1% B27 supplement, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) under kultur innsatsen slik at innsatsen kulturen er i kontakt med mediet, men skiver er ikke badet i den.
  10. Inkuber kulturer ved 37 ° C / 6% CO2 i opp til 3 dager. Erstatte alle kulturmediet hver 24 timer med frisk forvarmet medium.
  11. Etter kultur, fikse skiver på kultur setter inn for en time i 4% paraformaldehyde (eller O / N ved 4 ° C) i en fersk 30 mm tallerken med ingen kultur media.

4. Imaging av lillehjernen Slices

  1. Etter fiksering vaskes skiver 3 ganger i 5 minutter i PBS.
  2. Ved hjelp av et barberblad, dissekere hver elektroporert og kultivert lillehjernen stykke fra innsatsen kultur ved å kutte rundt stykket og fjerne skive og regionen innsatsen det er overholdt. GjøreIkke prøv å fjerne skive fra kultur innsatsen overflaten.
  3. Mount skiver i ca 1 ml montering medium som inneholder DAPI (hvis ønskelig) under en dekk tar seg ikke å innføre bobler, og bildet ved hjelp av laser-scanning konfokalmikroskopi.
    Merk: Imaging parametre kan varieres i henhold til de konstruerer elektroporerte, og ved skjønn av den enkelte bruker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne delen viser eksempler på resultater som kan oppnås ved hjelp av slice elektroporering og kulturen i lillehjernen fra embryonale Dag 14 chick. Disseksjon av lillehjernen er illustrert i figur 1 og elektroporering kammeret satt opp er vist i figur 2. Vi viser at det er mulig å electroporate og hell kultur cerebellare stykker, som beholder sin struktur og cellulære morfologi in vitro (figur 3A). Målrettet elektroporering til individuelle Folia er lett oppnås (Figur 3B). Vi har med hell electroporate en rekke forskjellige plasmider inn i EGL celler, og viser at det er mulig i) å merke celler med reporter-konstruksjonene for å observere deres oppførsel (figur 3C), ii) for å teste mulige genomiske regioner for funksjonalitet i lillehjernen celler (figur 3D ), og iii) for å manipulere genetisk denceller i EGL etter misexpressing proteiner av interesse (Figur 3E). I tillegg farmakologiske manipulasjoner på elektroporerte skivene er mulig (resultater ikke vist). Etter dyrking er det mulig å utføre ytterligere vev analyse som immunhistokjemi eller proliferasjonsanalyser (figur 3F). Vi vev helse analyse utføre ved calbindin og PH3 farging og vise at vev integritet opprettholdes i minst 3 div etter kultur (figur 4). Disse resultater viser at den EGL er nå et tilgjengelig og lett manipuleres struktur som kan bli fullt ut undersøkt og genetisk endret i dama modellsystemet.

Figur 1
Figur 1. Disseksjon av lillehjernen fra E14 kyllingfoster. (A) halshogge dama i egget og fjerne hodet intoa petriskål med iskald PBS. Fjern underkjeven og øynene ved å gjøre innsnitt bak øynene og svelget (stiplet linje). (B) Ta skinnet fra overflaten av skallen. (C) Fjern frontal og parietalbena og (D) fjerne hjernen fra mesenchyme og brusk som omgir den. (E) Under et disseksjonsmikroskop identifisere plasseringen av lillehjernen ved den bakre enden av hjernen. Skjær mellom midthjernen og hindbrain (stiplede linjer) for å sitte igjen med lillehjernen og ventral hindbrain. (F) Lag snitt på side veikryss (Peduncles) av lillehjernen å skille lillehjernen fra hindbrain (stiplet linje). (G) Fjern årehinnen plexus (stjerne) fra ventral side av lillehjernen til du sitter igjen med et helt intakt cerebellum med pia vedlagt. Overfør lillehjernen i iskald HBSS før forbereder skiver med en vev choppeh. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. elektroporering kammeret satt opp. (A) Et bilde av skreddersydde elektroporering kammeret. Kammeret består av en anode av et electroporator plasseres sikkert på basis av en 60 mm petriskål. Fatet inneholder ca 1 ml HBSS for å dekke elektroden. Innsatsen kulturen skal hvile på elektroden med konstant kontakt mellom innsatsen og elektroden opprett kretsen men tillater romlige målretting av katoden, som er manipulert for hånd. (B) Et bilde av skiver blir elektroporert. Skiver er dekket med DNA / fast grønn løsning. Sektorene er elektroporert som ønsked: elektroporering kan være rettet mot én folium eller flere steder. Etter elektroporering innsatsen er plassert i en 30 mm petriskål med forvarmet kulturmedium og dyrket i inkubator. 1. anode 2. katode 3. Kultur innsats 4. petriskål med 1 ml HBSS 5. disseksjonsmikroskop 6. Individuelle skiver fra vev chopper 7. DNA løsning med rask grønt fargestoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 3
Figur 3. Representative resultater. (A) En lav forstørrelse bilde av en kontroll electroporation av en RFP koding plasmid inn i EGL på flere steder. Vevet beholder sin struktur og elektroporerte celler er klart synlige i et tykt lag subpial av lillehjernen. (B) Eneksempel på en målrettet elektroporering med en kontroll GFP plasmid. Målrettet folium er merket med en stjerne. Scale bar AB = 500 mikrometer. (C) Et eksempel hvor en konstruksjon som koder GFP drevet av en Atoh1 enhancer er blitt elektroporert inn i EGL. Ekspresjon av Atoh1 definerer granule celleforløpere i EGL. Forskjellige celle morfologi er klart synlig 3 div og celle oppførsel kan overvåkes. (D) Et eksempel på merking etter elektroporering av en konstruksjon inneholdende en antatt konservert ikke-kodende element (CNE) av NeuroD1 genet drivende GFP. CNE rapporterer aktivitet i cellene forventet basert på endogen NeuroD1 uttrykk foreslå en aktiv rolle i denne CNE i utvikling. NeuroD1 uttrykk korrelerer med igangsettingen av granulen celledifferensiering. (E) Et eksempel hvor vev kan være genetisk manipulert ved misexpression av NeuroD1 protein og en endring i granule celle Behaviour kan observeres. (F) Et eksempel hvor elektroporert vev (kontroll GFP plasmid) kan bli fiksert og farget for markører prolifererende celler, så som phosphohistone H3 (PH3). Scale bar CF = 50 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Tissue integritet og spredning i kultur. (A - C) Calbindin farging av E14 lillehjernen vev elektroporert med en kontroll GFP plasmid på 1-3 dager in vitro (div). Calbindin farging viser at vevet integritet opprettholdes i kultur i minst 3 div. Den Purkinje cellelaget ikke danner et monolag på dette stadiet i kylling utviklingen, men det er tydelig sett danner et lag på undersiden avEGL hvor granule celler (grønn) er plassert. (D) Phosphohistone H3 (PH3) flekker på lillehjernen vev dyrket i 2 div. PH3 farging er synlig i EGL (piler), men også i andre regioner lillehjernen (pilspisser). Dette farging er representative for alle stadier i kultur undersøkt (1-3 div). Scale bar AD = 50 pm Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen rapportert her beskriver en metode for å dissekere, electroporating og dyrking skiver av embryonale Dag 14 cerebellum fra dama. Denne protokollen muliggjør målretting av elektroporering til små fokus regioner av EGL, inkludert isolerte målretting av individuelle lillehjernen fliker. Det gjør det mulig genetisk analyse og bildebehandling med høy oppløsning og bekvemmelighet, og til en lav pris i forhold til etablerte teknikker i gnagere 43-47. En slik analyse er foreløpig ikke mulig in vivo på grunn av den utvidede utviklings tidsperiode, det sparsommelige EGL-spesifikke genetiske målretting muligheter i mus, og felles av molekylære mekanismer mellom rhombic leppe og EGL, som betyr at endringer som kan påvirke EGL biologi ofte ikke kan analyseres fordi de påvirker rhombic leppe neurogenesis og oppheve EGL formasjon 49. Vårt system representerer således et stort fremskritt i forhold til målgruppe genmodifisering til EGL specifically, og vi regner med det vil være aktuelt for andre arter utover dama som kanskje av komparativ interesse, slik som ikke-modell pattedyr og krypdyr.

I å utføre skive kultur elektroporering teknikk, en rekke tekniske betraktninger er det viktigste. For det første, til robusthet av skiver overlever i kultur uten på den ene side under omfattende celledød eller på den andre miste strukturelle integritet begrenser tykkelsen av skive til 300 pm i våre hender. Et annet viktig hensyn er viskositeten av DNA-oppløsningen, som sikrer elektroporering av DNA ved konsentrasjoner som er høye nok til å indusere synlige eller relevante nivåer for genetisk modifisering. I in ovo elektroporering av DNA-løsninger som injiseres i den tidlige embryo hindbrain, konsentrasjoner av fast grønt fargestoff på omtrent 1% er typiske. Men i vår protokoll, vi bruker vanligvis konsentrasjoner av rask grønn på 20%. Dette sikrer en tilstrekkelig viscous DNA-løsning for å hindre spredning av DNA følgende pipettering men før elektroporering, men en tilstrekkelig fortynnet til å mediere en effektiv elektrisk ledning.

I tillegg til disse tekniske hensyn, observerte vi at proliferative oppførsel som vi observerer ex vivo ikke nøyaktig stemmer overens med forutsies fra in vivo studier, sannsynligvis på grunn av pial integritet forstyrres av vevspreparatet. Under slike forhold, når en GFP uttrykk konstruksjon blir elektroporert, vises en stor andel av elektroporerte celler for å ha forlatt cellesyklusen etter bare en dag av kulturen bedømt ved PH3 farging (figur 3F). Dette betyr ikke korrelerer med forventet EGL proliferativ atferd, hvor spredning av kloner i både mus og dama strekker seg over et stort tidsrom 27. Implikasjonen at pia modulerer spredning støttes av den observasjon at når vi electroporate en reporter bygt med en NeuroD1 regulerende element kjøring uttrykk for GFP alle elektroporerte celler uttrykker GFP etter en dag i kultur (Figur 3D). In vivo, speiler denne konstruksjonen endogen NeuroD1 uttrykk i merking cellene i indre EGL som er post-mitotisk 36,37, mens full lengde NeuroD1 er tilstrekkelig til å drive celledifferensiering (figur 3E). Dette tyder på at under visse forhold, den proliferative kapasiteten til celler kan ikke bli opprettholdt som den er i den ytre EGL ved ekvivalente trinn i vivo. PH3 farging har imidlertid antyde at det er mye proliferasjon i kultur, ofte lokalisert til området EGL (figur 4D). Omfattende spredning utenfor EGL indikerer muligens forbedret gliogenesis eller spredning av Pax2 gabaergic forløpere i hvit substans. Implikasjonen er at tolkningen av noen eksperimentelle prosedyren vil måtte ta hensyn til de ovennevnte proliferative oppførsel, kan det faktum at Purkinje celler som ikke danner et monolag til E18 kylling, og at normal utvikling kompromitteres skive etter fremstillingen (for eksempel på grunn av mangel på interaksjon med klatre fibre etc.)

Til tross for disse begrensningene, representerer vår protokoll et betydelig skritt fremover i forhold til å studere mange aspekter av granulat cellebiologi. Det avgjørende fordelen at romlig og tidsmessig bestemt merking av EGL til forskjell fra rhombic leppe vil lette flere undersøkelser av både cellebiologi granule stamfedre og genetisk regulering underbygger det på en måte som ikke er mulig i dag in vivo. Vår teknikk i chick vil utfylle eksisterende ex vivo kultur og electroporation protokoller i gnagere 43-48 og bærer betydelige fordeler i pris og brukervennlighet som er forbundet med dama. Dessuten representerer den et betydelig fremskritt i forhold tileksisterende teknikker for dyrking granule stamfedre 39. Selv om det vil utfylle heller enn å erstatte den sistnevnte, vil vår protokoll åpne styring av nevron granule differensiering til et bredt utvalg av farmasøytiske behandlinger og til mangfoldet av celleautonome genetiske manipulasjoner som er mulig i kylling. Det gir grunnlag for å undersøke granule cellebiologi i enestående detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Metoden som presenteres i denne artikkelen oppsto fra arbeid finansiert av BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) og en MRC doktorgradsstudent (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
  2. Becker, E. B., Stoodley, C. J. Autism spectrum disorder and the cerebellum. International Review of Neurobiology. 113, 1-34 (2013).
  3. Hatten, M. E., Roussel, M. F. Development and cancer of the cerebellum. Trends in Neurosciences. 34, 134-142 (2011).
  4. Butts, T., Green, M. J., Wingate, R. J. Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain. Development. 141, 4031-4041 (2014).
  5. Rodriguez-Moldes, I., et al. Development of the cerebellar body in sharks: spatiotemporal relations of Pax6 expression, cell proliferation and differentiation. Neuroscience Letters. 432, 105-110 (2008).
  6. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 29, 6142-6153 (2009).
  7. Chaplin, N., Tendeng, C., Wingate, R. J. Absence of an external germinal layer in zebrafish and shark reveals a distinct, anamniote ground plan of cerebellum development. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 3048-3057 (2010).
  8. Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
  9. Butts, T., Modrell, M. S., Baker, C. V., Wingate, R. J. The evolution of the vertebrate cerebellum: absence of a proliferative external granule layer in a non-teleost ray-finned fish. Evolution & Development. 16, 92-100 (2014).
  10. Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M., Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development. 133, 1811-1821 (2006).
  11. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development. 126, 4395-4404 (1999).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  14. Yamada, M., et al. Specification of spatial identities of cerebellar neuron progenitors by ptf1a and atoh1 for proper production of GABAergic and glutamatergic neurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 4786-4800 (2014).
  15. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  16. Wilson, L. J., Wingate, R. J. Temporal identity transition in the avian cerebellar rhombic lip. Developmental Biology. 297, 508-521 (2006).
  17. Hausmann, B., Sievers, J. Cerebellar external granule cells are attached to the basal lamina from the onset of migration up to the end of their proliferative activity. The Journal of Comparative Neurology. 241, 50-62 (1985).
  18. Xenaki, D., et al. F3/contactin and TAG1 play antagonistic roles in the regulation of sonic hedgehog-induced cerebellar granule neuron progenitor proliferation. Development. 138, 519-529 (2011).
  19. Komuro, H., Yacubova, E., Yacubova, E., Rakic, P. Mode and tempo of tangential cell migration in the cerebellar external granular layer. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 527-540 (2001).
  20. Klein, R. S., et al. SDF-1 alpha induces chemotaxis and enhances Sonic hedgehog-induced proliferation of cerebellar granule cells. Development. 128, 1971-1981 (2001).
  21. Zhu, Y., et al. Role of the chemokine SDF-1 as the meningeal attractant for embryonic cerebellar neurons. Nature Neuroscience. 5, 719-720 (2002).
  22. Hagihara, K., et al. Shp2 acts downstream of SDF-1alpha/CXCR4 in guiding granule cell migration during cerebellar development. Developmental Biology. 334, 276-284 (2009).
  23. Borrell, V., Marin, O. Meninges control tangential migration of hem-derived Cajal-Retzius cells via CXCL12/CXCR4 signaling. Nature Neuroscience. 9, 1284-1293 (2006).
  24. Paredes, M. F., Li, G., Berger, O., Baraban, S. C., Pleasure, S. J. Stromal-derived factor-1 (CXCL12) regulates laminar position of Cajal-Retzius cells in normal and dysplastic brains. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 9404-9412 (2006).
  25. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 1613-1624 (2008).
  26. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  27. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 2301-2312 (2008).
  28. Legue, E., Riedel, E., Joyner, A. L. Clonal analysis reveals granule cell behaviors and compartmentalization that determine the folded morphology of the cerebellum. Development. 142, 1661-1671 (2015).
  29. Dahmane, N., Ruizi Altaba,, A, Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  30. Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Current Biology : CB. 9, 445-448 (1999).
  31. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
  32. Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270, 393-410 (2004).
  33. Zhao, H., Ayrault, O., Zindy, F., Kim, J. H., Roussel, M. F. Post-transcriptional down-regulation of Atoh1/Math1 by bone morphogenic proteins suppresses medulloblastoma development. Genes & Development. 22, 722-727 (2008).
  34. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  35. Klisch, T. J., et al. In vivo Atoh1 targetome reveals how a proneural transcription factor regulates cerebellar development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3288-3293 (2011).
  36. Miyata, T., Maeda, T., Lee, J. E. NeuroD is required for differentiation of the granule cells in the cerebellum and hippocampus. Genes & Development. 13, 1647-1652 (1999).
  37. Butts, T., Hanzel, M., Wingate, R. J. Transit amplification in the amniote cerebellum evolved via a heterochronic shift in NeuroD1 expression. Development. 141, 2791-2795 (2014).
  38. Rios, I., Alvarez-Rodriguez, R., Marti, E., Pons, S. Bmp2 antagonizes sonic hedgehog-mediated proliferation of cerebellar granule neurones through Smad5 signalling. Development. 131, 3159-3168 (2004).
  39. Anne, S. L., et al. WNT3 inhibits cerebellar granule neuron progenitor proliferation and medulloblastoma formation via MAPK activation. PloS One. 8, e81769 (2013).
  40. Chedotal, A. Should I stay or should I go? Becoming a granule cell. Trends in Neurosciences. 33, 163-172 (2010).
  41. Penas, C., et al. Casein Kinase 1delta Is an APC/C(Cdh1) Substrate that Regulates Cerebellar Granule Cell Neurogenesis. Cell Reports. 11, 249-260 (2015).
  42. Penas, C., et al. GSK3 inhibitors stabilize Wee1 and reduce cerebellar granule cell progenitor proliferation. Cell Cycle. 14, 417-424 (2015).
  43. Yang, Z. J., et al. Novel strategy to study gene expression and function in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience Methods. 132, 149-160 (2004).
  44. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nature Neuroscience. 10, 559-567 (2007).
  45. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 16182-16187 (2007).
  46. Famulski, J. K., et al. Siah regulation of Pard3A controls neuronal cell adhesion during germinal zone exit. Science. 330, 1834-1838 (2010).
  47. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. 14, 973-983 (2011).
  48. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. , (2014).
  49. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).

Tags

Developmental Biology lillehjernen utvikling chick ekstern granulat lag skive kultur granule celler Purkinje celler elektroporering.
<em>Ex vivo</em> Culture of Chick lillehjernen Slices og Romlig Målrettet Electroporation av granulat Cell Forstadier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter