Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Abstract

Serebellar dış granül tabakası (EGL) gelişmekte olan beyinde büyük Transit büyütme site ve nöronal çoğalmasını ve farklılaşmasını çalışmak için mükemmel bir model. Buna ek olarak, çoğalma yeteneği evrimsel değişiklikler beyinciği omurgalı beynin evo-devo çalışmaları için mükemmel bir model haline amniotları serebellar büyüklükte dramatik genişleme sorumlu olmuştur. EGL kurucu hücreleri, serebellar granül ataları da, Medulloblastoma için en yaygın pediatrik nöronal tümör kökenli önemli bir hücreyi temsil etmektedir. Transit amplifikasyon ardından, granül öncüleri olgun memeli beyninde büyük nöronal nüfusu temsil beyincik iç granüler tabaka içine radyal göç. Civciv, EGL çoğalması pik gebelik ikinci hafta sonuna doğru ortaya çıkar. Bu tabakaya genetik değişimine hedeflemek içinproliferasyonunun en yüksek, embriyonik gün 14 civciv embriyolarından serebellum dilimleri ex vivo elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyonu için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, in vivo granül nöron geliştirme birkaç önemli yönlerini özetlediği ve beyincik granül hücre çoğalması ve farklılaşması tam bir anlayış oluşturmada yararlı olacaktır ve böylece beyincik geliştirme, evrim ve hastalığın.

Introduction

Beyincik Beyin ön ucunda oturur ve olgun beyindeki duyu ve motor işleme entegrasyonu sorumlu yanı sıra yüksek bilişsel süreçleri 1 düzenleyen olduğunu. Memeliler ve kuşlar, bu yetişkin beyindeki nöronların yarıdan fazlası ürettiği gelişimi sırasında, atalarıdır geniş geçiş amplifikasyon ürünü ayrıntılı bir morfoloji sahip ve ağır foliated edilir. Beyincik yüzyıllardır Nörobiyologlar ve moleküler çağda çalışmanın konusu olmuştur aynı şekilde önemli dikkat çekmiştir. Bu, özünde ilginç biyoloji, ama aynı zamanda ağır gibi en yaygın pediatrik beyin otizm spektrum bozuklukları 2 ve en belirgin serebellar kanser, medulloblastoma 3 gibi gelişimsel genetik bozukluklar da dahil olmak üzere insanlara hastalık bulaştıran gerçeği değil sadece ilgilidir tümör. Önemlisi, bu wh içinde mükemmel bir model sistemich beyin gelişimi 4 sırasında kaderi tahsisi ve nörogenezi incelemek için. Son yıllarda, aynı zamanda omurgalı phylogeny 5-10 arasında görülen serebellar formların büyük çeşitlilik nedeniyle, beyin gelişiminin karşılaştırmalı çalışma için bir model sistem olarak kurulmuştur.

Beyincik Beyin 11'de rhombomere 1 dorsal yarısından itibaren gelişir ve gelişimsel iki ana progenitör popülasyonları, eşkenar dudak ve ventriküler zon oluşur. Eşkenar dudak çatı plakası sınırındaki Beyin ve neuroepithelium dorsal bölgenin çevresinde uzanır. Bu beyincik 12-14 glutamaterjik eksitatör nöronların doğduğu yerdir. Ventriküler bölge en belirgin inhibitör GABAerjik serebellar nöronların, büyük Purkinje nöronları 14,15 yol açar. Daha sonra geliştirme (fare embriyonik gün 13.5 ila yaklaşık, civciv 16 e6), glutamaterjik ProGenitors eşkenar dudaktan teğet göç ve atalarıdır bir pial bir tabaka oluşturur: ikincil progenitör bölgesi dış granül tabakası (EGL) çağırdı. Olgun beyinde bulunan granül nöronların büyük sayılara neden kapsamlı geçiş amplifikasyon uğrar bu tabakadır.

EGL çoğalma uzun hücre döngüsü çıkışı ve ortasına dış EGL katmandan kendi çıkış ile bağlantılıdır progenitörlerin nöronal farklılaşma anahtarıyla, eşkenar dörtgen şeklinde dudak 17 Tanjansiyal göç kaynaklanan alt Pial konumu ile bağlantılı olmuştur EGL 18. Medial-lateral ekseninde post-mitotik granül hücrelerinin Geniş teğet göç olgun serebellar korteksin iç granül tabakası içine son radyal göç öncesi, orta ve iç EGL 19 oluşur. Serebellar yüzey üzerinde eşkenar dudak hücrelerin göç pia 20-22 den CXCL12 sinyalizasyon bağlıdır 23-25 ​​göç neokortikal teğet o böylece anımsatıyor. Şaşırtıcı, elektron mikroskobik çalışmalar 17 proliferatif morfolojiye sahip EGL hücreleri memeli korteks 26 bazal atalarıdır anımsatan tarzda çoğalma yeteneği ile hücre davranışını bağlayan, pial temas halinde olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu 18 imzaların granül ön farklı gen ekspresyonunu sahip farklı hücre dışı durumlar tarafından tanımlanan üç alt katmanlar halinde EGL yukarıda belirtilen tabakalaşma yansıtılır.

OEGL progenitörlerin Çoğalma atalarıdır bireysel genetik fare embriyonik gelişim sonunda etiketli, onlar 250-500 postmitotic g medyan ortalama doğuran şekilde klon boyutları normal dağılım oluşurranule nöronlar 27,28. Çoğalma Purkinje nöronları 29-32, altta yatan mitojenik SHH sinyallemesinin bağlıdır. SHH'nin cevap verme transkripsiyon faktörünün Atoh1 hücre bağımsız ekspresyonu üzerine tamamen bağlı olduğu gösterilmiştir, in vitro ve in vivo 33 34,35 hem de. Benzer şekilde, hücre döngüsü çıkışı ve farklılaşması olasılıkla Atoh1 37 doğrudan bir bastırıcısıdır alt transkripsiyon faktörü NeuroD1 36, ifadesine bağımlı olduğu gösterilmiştir.

Hücre döngüsü çıkışına 38-42 hücre biyolojik temelini çözmekte bu ilerleme ve önemli ilerleme olmasına rağmen, karar altında yatan temel moleküler mekanizma (lar) hücre döngüsünü çıkmak için bir ayırt nöron bir progenitör geçiş için, ve İç EGL de ilişkili postmitotic teğet göç yanı sıra, daha sonra anahtarradyal göç, anlaşılan eksik kalır. Bu, EGL deneysel inatçılığı büyük ölçüde: geç gelişen ve aynı nörojenik moleküllerin pek çoğu önemli önceki granül öncülerinin hayatta eşkenar paralel dudak altındadır beri genetik hedef zordur. Bu sorunu aşmak için, sayısız yazar kemirgenler 43-48 doğum sonrası beyincik hedeflemek için bir yöntem olarak in vivo ve ex vivo elektroporasyon gelişmiştir. Burada, maliyet ve kolaylık açısından önemli avantajlar temsil EGL, incelemek için civciv ex vivo elektroporasyon kullanımını öncülük. Elektroporasyon ve civciv serebellar doku ex vivo dilim kültürü Bizim yöntemi 14 civciv EGL çoğalması zirvesinde embriyonik Gün doku disseke kullanır. Bu yöntem, eşkenar dudak bağımsız EGL genetik hedefleme izin verir ve granül geçişin genetik diseksiyon için sahne koyacaktırbeyincik postmitotic granül nöron progenitör.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bütün deneyler King College London, İngiltere ve İngiltere Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun gerçekleştirilmiştir.

E14 Serebellumunda 1. Diseksiyon

  1. Embriyonik Gün 14-38 ° C'de kahverengi döllenmiş tavukların yumurtalarını kuluçkaya yatmaktadır.
  2. Kullanımı yumurta makas ovo civciv embriyo başını kesmek ve buz PBS (Şekil 1A) içeren bir Petri baş kaldırmak.
  3. Standart forseps kullanarak, gözleri ve üst çene kaldırma, doku içinden her gözün arkasında tüm yol kesiler yapmak. Tüm yol alt çene (Şekil 1B) çıkarılması farenks yoluyla ikinci bir kesi yapmak.
  4. Standart forseps kullanarak, (Şekil 1C) onu uzak soyulması ile kafatası yüzeyinden tüm cilt kaldırmak ve beyin açığa frontal ve parietal kemikler çıkarın.
  5. Ventral açıdan, yutak kıkırdak ve yardımcı mezenşimi çıkarın.
  6. Bir dorsal itibaren dikkatlily pia ve ayrı tüm beyin (Şekil 1D) zarar vermemeye Beyin alarak bakım mezenşimin dorsal çıkarın.
  7. Tüm yol orta beyin ve arka beyin ve beyincik (Şekil 1E) da dahil olmak üzere ayrı Beyin arasındaki doku içinden kesi yapmak.
  8. Tüm yol beyincik ve Beyin alar levhanın her iki yanal kavşaklarında doku içinden kesiler yaparak, diseksiyon boyunca pia bütünlüğünü (Şekil 1F) korumak için özen tüm beyincik çıkarın. Oluşturan koroid pleksusu (Şekil 1G) sökün.
  9. Buz gibi soğuk HBSS içine disseke beyincik taşıyın.

E14 Serebellumunda 2. Dilim Kültür

  1. Bir spatula ya da ucu ile 3 ml'lik Pasteur pipeti kullanarak Doku Chopper steril platforma bütün beyincik transfer diyafram genişletmek için kesilmiş. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın.
  2. T tüm tüm beyincik CutO maksimum% 50 bir kesim hızı ayarlamak doku kıyıcı kullanarak 300 mikron kalınlığında yönünü gerekli. Doku bütünlüğü en kolay sagital bölümde korunur; Bununla birlikte, yönlendirme hücre analizi için önemli bir husustur (granül hücre aksonları enine çalıştırırken, Purkinje hücresi dendritler sagital Purkinje hücresi dendritler düzlemine dik olan, hizalanmaktadır).
  3. 3 ml Pasteur pipet kullanarak, buz dilimlenmiş serebellum soğuk HBSS kapsamaktadır.
  4. Kesme ucu ile 3 mi bir Pasteur pipeti kullanılarak buz gibi soğuk taze HBSS içeren bir 60 mm Petri kabı, HBSS içinde dilimleri aktarın.
  5. Bir fiber optik ışık kaynağı ile aydınlatılan bir mikroskop altında, saatçilik forseps kullanılarak her dilim ayrılmasını sağlamak. Dilimleri belirleyin onların doku bütünlüğü ve medio-lateral pozisyonda dayalı, electroporated edilecek.
    Not: kültür ortamında inkübasyon dilim yoluyla embriyo Her diseksiyon yaklaşık 10-20 dk bağlı UPO alırn deneyim. Bu cerebella Dekapitasyon ve ex vivo kültür arasındaki minimum zaman miktarda harcama sağlamak için bir seferde diseksiyonlara birini gerçekleştirin.

Dilimleri 3. elektroporasyonu

  1. Yalıtım bandı ile 60 mm Petri kabı tabanına bir Elektroporatör anot sabitleme tarafından bir elektroporasyon odasını oluşturun. Elektrot karşılamak için HBSS yaklaşık 1 ml ilave edilir.
  2. HBSS kaplı elektrodun üstünde 0,4 um kültürü eki yerleştirin. Kültür insert elektrot her zaman uç ile elektrot arasında orada temasa olduğundan emin yapma dinlenmek için izin verin.
    Not: Bu ayarda, dilim kültür eklemek devresini korumak ama katot mekansal hedefleme sağlayan, çözüm yüzey üzerine duracaktır.
  3. Aktarım tespit dilimleri (kültür insert başına beş adede kadar) kesme ucu ile 3 ml Pasteur pipeti kullanarak kültür eklemek üzerine. Ayrı bir sagitt kültür insert üzerine yerleşmek için izinal yönelim.
  4. Dilimler, artık çözelti içinde kalmış, böylece, bir pipet kullanarak, fazla HBSS çıkarın.
  5. Bir dilim hedeflenen bölgenin yüzeyi üzerinde 20% hızlı yeşil ile seyreltildi (1 ug / ul bir konsantrasyonda) P10 pipet, pipet DNA kullanılarak. % 20 hızlı yeşil viskoz DNA çözümü sağlar ve prohibitively DNA'nın geniş dağılma önler. Her bir dilim (Şekil 2B), yaklaşık 5 ul DNA / hızlı yeşil bir çözelti ekleyin.
  6. İstediğiniz hedeflenen doku üzerinde katot yerleştirin ve 3 x 10 V, 10 msn süreli darbeleri ile electroporate. Doku ile katot doğrudan temastan kaçının. Bunun yerine, iletkenlik korumak (aslında doku dokunmadan mümkün olduğunca dokuya yakın katot yerleştirin) sıvının yüzey gerilimi yararlanın.
  7. Istediğiniz gibi her serebellar dilim EGL birden bölgelerine DNA teslimat ve elektroporasyon tekrarlayın.
  8. Elektroporasyon tamamlanması, devir kültür INSE üzerine30 mm Petri kabı rt.
  9. Glikoz,% 1 B27 takviyesi, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin - (+) - her bir kültür için, önceden ısıtılmış bir kültür ortamı (Basal Medium Eagle 1 ml% 0.5 (w / v) D ekleme Kültür uç ortamı ile temas halindedir, ancak dilimleri içinde banyo değildir, öyle ki kültür eklemek altında 100 ug / ml streptomisin).
  10. Kadar 3 gün boyunca 37 ° C /% 6 CO2 kültürlerin inkübe edin. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış ortam ile, her 24 saat tüm değiştirin.
  11. Kültür no kültür ortamı taze bir 30 mm çanak (4 ° C de veya O / N)% 4 paraformaldehid içinde 1 saat süre ile ekler kültürün ardından, dilimleri düzeltin.

Serebellar Dilimleri 4. Görüntüleme

  1. Tespit sonra, PBS içinde 5 dakika boyunca dilimleri 3 kez yıkayın.
  2. Bir jilet kullanarak, dilim etrafında kesme ve dilim ve yapıştırılan parçanın bölgesini kaldırarak kültür insert her Electroporated ve kültürlü serebellar dilim teşrih. Yapmakkültür insert yüzeyinden dilim çıkarmayı denemeyin.
  3. Bir lamel alarak bakım altında (istenirse) DAPI içeren montaj orta yaklaşık 1 ml Mount dilimleri kabarcıkları tanıtmak için değil, ve görüntü lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak.
    Not: Görüntüleme parametreler elektropore yapılara göre farklılık ve bireysel kullanıcı takdirine edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu bölüm, embriyonik gün 14 hatundan kesit elektroporasyon ve beyincik kültürü kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Beyincik diseksiyon Şekil 1 içinde tasvir edilmektedir ve ayarlamak elektroporasyon haznesi, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Bu başarılı in vitro (Şekil 3A), yapı ve hücresel morfolojik korumak kültür serebellar dilimleri, elektroporasyona ve mümkün olduğunu göstermektedir. Bireysel Folia Hedefli elektroporasyon kolayca (Şekil 3B) elde edilir. Biz başarıyla, ii) beyincik hücrelerde işlevselliği için olası genomik bölgeleri test) EGL hücrelerine farklı plazmid bir dizi electroporate ve muhabir davranışlarını (Şekil 3C gözlemlemek yapıları ile hücreleri etiketlemek için) mümkün i olduğunu göstermek (Şekil 3D ) ve iii) genetik olarak manipüleÇevrede (Şekil 3E) proteinlerini misexpressing ile EGL hücreler. Buna ek olarak, elektroporasyona dilim farmakolojik manipülasyonlar (sonuçlar gösterilmemiştir) da mümkündür. Kültürlendikten sonra bu tür immünohistokimya veya proliferasyon deneyleri (Şekil 3F) gibi ek doku analizini gerçekleştirmek mümkündür. Biz Kalbindin ve PH3 immün doku sağlık analizi gerçekleştirmek ve doku bütünlüğü kültürden sonra en az 3 div (Şekil 4) muhafaza olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, EGL tamamen incelenmiş ve genetik olarak civciv model sistemde değiştirilebilir erişilebilir ve kolay elde edilebilir yapısı şimdi olduğunu göstermektedir.

figür 1
E14 civciv embriyolarının beyincik Şekil 1. Diseksiyon. (A) yumurta civciv başını kesmek ve kafa int kaldırmakbuz PBS ile oa petri. Alt çene ve gözleri ve farenks (kesikli çizgi) arkasında kesi yaparak gözleri çıkarın. (B) kafatasının yüzeyine deri çıkarın. (C) onu çevreleyen mezenşimin ve kıkırdaktan beyin kaldırmak frontal ve parietal kemik ve (D) sökün. Bir mikroskop altında (E), beyin arka sonunda beyincik konumunu belirlemek. Orta beyin ve arka beyin (kesik çizgiler) arasında kesin beyincik ve ventral Beyin sol edilecek. (F) Beyin (kesikli çizgi) beyincik ayırmak için beyincik yanal kavşaklar (pedinküller) de kesiler olun. Ekli pia ile bir bütün dokunulmamış beyincik sol kadar (G) beyincik ventral tarafında koroid pleksusu (yıldız) sökün. Bir doku Chopp ile dilimleri hazırlamadan önce buz HBSS içine beyincik aktarıner. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Elektroporasyon odasının 2. Şekil kurdu. (A) ısmarlama elektroporasyon odasının bir resmi. Odası 60 mm Petri kabı tabanı üzerine güvenli bir şekilde yerleştirilmiş bir elektro-bir anot içerir. Bulaşık elektrot karşılamak için HBSS yaklaşık 1 ml içerir. Kültür insert devresi koruyarak ama elle manipüle katot, mekansal hedefleme sağlayan, insert ve elektrot arasındaki sürekli temas ile elektrot üzerinde durmalıdır. Dilim (B) Bir resim electroporated edilir. Dilimler, DNA / hızlı yeşil bir çözelti ile kaplanmıştır. Dilimler arzu olarak electroporated edilird: elektroporasyon, bir veya birden fazla folium'dan konumlara hedeflenebilecektir. Elektroporasyondan sonra uç inkübatör önceden ısıtılmış kültür ortamı ve kültürlenmiş bir 30 mm Petri tabağına yerleştirilir. 1. anot 2. 1 ml HBSS 5. Diseksiyon mikroskobu doku kıyıcı 6. Bireysel dilim hızlı yeşil boya ile 7. DNA solüsyonu ile katot 3. Kültür insert 4. Petri. Tıklayınız Bu büyük bir versiyonunu görmek için rakam.

Şekil 3,
Şekil 3. Temsilcisi sonuçları. (A) birden fazla yerde EGL içine RFP kodlama plazmid kontrol elektroporasyon düşük büyütme resim. Doku yapısını muhafaza eden ve Elektroporasyona tabi tutulan hücreler açık beyincik kalın subpial tabakada görebilir. (B) birBir kontrol GFP plazmidi ile hedeflenen bir elektroporasyon, örneğin. Hedeflenen folium bir yıldızla gösterilir. Ölçek çubuğu AB 500 mikron =. (C) Atoh1 arttırıcı tarafından tahrik edilen bir konstrukt kodlayan GFP EGL elektropore edilmiş bir örnek. Atoh1 ekspresyonu EGL olan granül hücre öncülerinin tanımlar. Çeşitli hücre morfolojisi açık 3 div de görebilir ve hücre davranışı izlenebilir. (D) sürüş GFP NeuroD1 geninin varsayılan bir korunmuş kodlayıcı olmayan elemanı (CNE) ihtiva eden bir yapının aşağıdaki elektroporasyon etiketleme bir örnek. CNE gelişiminin bu cne aktif bir rolü olduğunu düşündürmektedir endojen NeuroD1 ifade göre beklenen hücrelerde aktivitesi rapor eder. NeuroD1 sentezleme granül hücre farklılaşmasının başlatılması ile ilişkilidir. (E) ya da doku genetik NeuroD1 proteininin misexpression ve granül hücre Behav bir değişiklik ile manipüle edilebilir bir örnekgelmeleri gözlenebilir. (F) içinde elektroporasyona tabi dokusu (GFP plazmidi kontrol), sabit ve phosphohistone H3 (PH3) halinde çoğalan hücrelere belirteçleri için renklendirilebilirliğinin bulunması, bir örnek. Ölçek çubuğu CF = 50 um bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Kültürde 4. Doku bütünlüğü ve çoğalmasını Şekil. (A - C) in vitro (div) 1-3 gün kontrol GFP plazmid ile elektropore E14 serebellar doku Calbindin boyama. Kalbindin boyama doku bütünlüğü en az 3 div kültür içinde muhafaza edildiğini göstermektedir. Purkinje hücresi tabakası civciv gelişme, bu aşamada, bir tek tabaka oluşturmayan ancak açık bir şekilde altında bir tabaka oluşturucu görülürGranül hücreleri (yeşil) yer almaktadır EGL. 2 div kültüre serebellar doku üzerinde (D) Phosphohistone H3 (PH3) boyama. PH3 boyama EGL (oklar) görünür ama aynı zamanda diğer beyincik bölgelerinin (ok başları) bulunmaktadır. Bu boyama incelenen kültür içinde her aşamada (1-3 div) temsilcisidir. Ölçek çubuğu AD = 50um bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada rapor edilen protokol kesme electroporating ve piliç embriyonik gün 14 beyincik dilimleri kültürlenmesi için bir yöntemi anlatmaktadır. Bu protokol, bireysel serebellar lob izole hedefleme dahil EGL küçük odak bölgelerinde, elektroporasyon hedefleme sağlar. Bu yüksek çözünürlük ve kolaylık genetik analiz ve görüntüleme sağlar ve düşük maliyetle kemirgenler 43-47 kurulan tekniklere göre. Böyle bir analiz sonucu değişiklikler EGL etkileyebilir demektir uzatılmış gelişim süre, fare EGL özgü genetik hedefleme olanakları yetersizdir ve eşkenar dudak ve EGL arasındaki moleküler mekanizmaların commonality, in vivo mümkün değil Onlar eşkenar dudak nörogenezi etkileyen ve EGL oluşumunu 49 abrogate beri biyoloji sık analiz edilemez. Sistemimiz böylece EGL s genetik modifikasyon hedef anlamında büyük bir ilerlemeyi temsilpecifically ve biz civciv dışındaki diğer türlere geçerli olacak tahmin belki böyle olmayan model memeliler ve sürüngenler olarak karşılaştırmalı ilgi evi.

Dilim kültür elektroporasyon tekniği uygulanırken, teknik konularla ilgili bir sayıda büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, dilim sağlamlığı kapsamlı hücre ölümü geçiren bir yandan olmayan ya da diğer kaybetme yapısal bütünlüğü ile kültür içinde hayatta kalmak için elimizde 300 um dilimin kalınlığı sınırlar. İkinci bir önemli husus, genetik modifikasyon görebilir veya ilgili seviyelerini indüklemek için yeterince yüksek olan konsantrasyonlarda DNA elektroporasyon sağlayan DNA solüsyonu, viskozitesidir. Erken dönemde embriyo Beyin enjekte DNA çözeltilerinin ovo elektroporasyon olarak, yaklaşık% 1 hızlı yeşil boya konsantrasyonları tipiktir. Bununla birlikte, protokolde, genellikle% 20 hızlı yeşil konsantrasyonları kullanırlar. Bu yeterince vis sağlarcous DNA solüsyonu pipetleme ama elektroporasyon önce aşağıdaki DNA yayılmasını önlemek için, ama yeterince verimli elektrik iletimi arabuluculuk birini sulandırmak.

Bu teknik değerlendirmeler yanında, biz ex vivo gözlemlemek proliferatif davranışı gözlendi yapar pial bütünlük doku hazırlanması tarafından kesintiye olmanın muhtemelen in vivo çalışmalar tahmin değil kesin maç. GFP ekspresyon yapısı, elektroporasyona zaman Bu koşullar altında, elektroporate edilmiş hücrelerde büyük bir kısmı PH3 boyama (Şekil 3F) ile değerlendirildiği gibi, kültür sadece bir gün sonra hücre döngüsü yazılmıştır görünmektedir. Bu fare ve civciv hem de klonlar çoğalması büyük bir zaman diliminde 27 boyunca uzanır beklenen EGL proliferatif davranışları ile ilişkili değildir. Pia çoğalmasını modüle ima gözlem tarafından desteklenen bir muhabir konstrukta electroporate zamanİn vivo koşullarında, bu yapı 36,37 post-mitotik olan iç EGL hücreleri işaretleme endojen NeuroD1 ifade aynalar GFP Bir günlük kültürden (Şekil 3D). sonuçta Elektroporasyona tabi tutulan hücreler eksprese GFP NeuroD1 düzenleyici element tahrik ifade t, tam uzunluktaki NeuroD1 hücre farklılaşmasını (Şekil 3E) çalıştırmak için yeterli olduğu görülmektedir. Bu, in vivo olarak eşdeğer bir aşamada, dış EGL olduğu gibi, belirli koşullar altında, hücrelerin çoğalma kapasitesi muhafaza edilemez olduğunu göstermektedir. PH3 boyama, ancak sık sık EGL alanına (Şekil 4D) lokalize kültürde çoğalması bir sürü olduğunu düşündürmektedir. EGL dışında Kapsamlı çoğalması muhtemelen beyaz cevher pax2 GABAerjik öncüleri gliogenesis veya çoğalmasını gelişmiş gösterir. Ima herhangi bir deneysel prosedür yorumlanması hesabına yukarıdaki proliferativ içine almak zorunda olmasıdıre davranışı, Purkinje hücreleri, normal gelişim civciv ve E18 kadar tek tabaka oluşturacak yok aslında (nedeniyle vb lifleri tırmanma ile etkileşim eksikliği, gibi) dilim hazırlandıktan sonra bozulabilir

Bu kısıtlamalara rağmen, bizim protokol granül hücre biyolojisi birçok yönünü inceleyerek ilgili atılmış önemli bir adımı temsil etmektedir. Eşkenar dudak farklı olarak mekansal ve zamansal EGL özel etiketleme sağlayan en önemli avantajı, granül atalarıdır hücre biyolojisi hem de in vivo şu anda mümkün olmayan bir şekilde onu destekleyen genetik düzenlemenin birden sınavları kolaylaştıracaktır. Civciv Bizim tekniği kemirgenler 43-48 mevcut ex vivo kültür ve elektroporasyon protokolleri tamamlayacak ve maliyet ve civciv ile ilişkili kolaylık önemli avantajlar taşır olacaktır. Buna ek olarak, bu üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsilkültürleme granül progenitörlerin 39, mevcut teknikleri. O tamamlayacak ziyade ikincisi yerini alacak olsa da, bizim protokol ilaç tedavileri çok çeşitli ve civciv mümkündür hücre özerk genetik manipülasyonlar çeşitliliği granül nöron farklılaşma kontrolünü açılacaktır. Bu eşi görülmemiş detaylı granül hücre biyolojisi incelenmesi için bir temel sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu makalede sunulan yöntem BBSRC BB / tarafından finanse edilen çalışma ortaya çıktı I021507 / 1 (TB, RJTW) ve MRC doktora öğrencilik (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
  2. Becker, E. B., Stoodley, C. J. Autism spectrum disorder and the cerebellum. International Review of Neurobiology. 113, 1-34 (2013).
  3. Hatten, M. E., Roussel, M. F. Development and cancer of the cerebellum. Trends in Neurosciences. 34, 134-142 (2011).
  4. Butts, T., Green, M. J., Wingate, R. J. Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain. Development. 141, 4031-4041 (2014).
  5. Rodriguez-Moldes, I., et al. Development of the cerebellar body in sharks: spatiotemporal relations of Pax6 expression, cell proliferation and differentiation. Neuroscience Letters. 432, 105-110 (2008).
  6. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 29, 6142-6153 (2009).
  7. Chaplin, N., Tendeng, C., Wingate, R. J. Absence of an external germinal layer in zebrafish and shark reveals a distinct, anamniote ground plan of cerebellum development. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 3048-3057 (2010).
  8. Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
  9. Butts, T., Modrell, M. S., Baker, C. V., Wingate, R. J. The evolution of the vertebrate cerebellum: absence of a proliferative external granule layer in a non-teleost ray-finned fish. Evolution & Development. 16, 92-100 (2014).
  10. Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M., Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development. 133, 1811-1821 (2006).
  11. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development. 126, 4395-4404 (1999).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  14. Yamada, M., et al. Specification of spatial identities of cerebellar neuron progenitors by ptf1a and atoh1 for proper production of GABAergic and glutamatergic neurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 4786-4800 (2014).
  15. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  16. Wilson, L. J., Wingate, R. J. Temporal identity transition in the avian cerebellar rhombic lip. Developmental Biology. 297, 508-521 (2006).
  17. Hausmann, B., Sievers, J. Cerebellar external granule cells are attached to the basal lamina from the onset of migration up to the end of their proliferative activity. The Journal of Comparative Neurology. 241, 50-62 (1985).
  18. Xenaki, D., et al. F3/contactin and TAG1 play antagonistic roles in the regulation of sonic hedgehog-induced cerebellar granule neuron progenitor proliferation. Development. 138, 519-529 (2011).
  19. Komuro, H., Yacubova, E., Yacubova, E., Rakic, P. Mode and tempo of tangential cell migration in the cerebellar external granular layer. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 527-540 (2001).
  20. Klein, R. S., et al. SDF-1 alpha induces chemotaxis and enhances Sonic hedgehog-induced proliferation of cerebellar granule cells. Development. 128, 1971-1981 (2001).
  21. Zhu, Y., et al. Role of the chemokine SDF-1 as the meningeal attractant for embryonic cerebellar neurons. Nature Neuroscience. 5, 719-720 (2002).
  22. Hagihara, K., et al. Shp2 acts downstream of SDF-1alpha/CXCR4 in guiding granule cell migration during cerebellar development. Developmental Biology. 334, 276-284 (2009).
  23. Borrell, V., Marin, O. Meninges control tangential migration of hem-derived Cajal-Retzius cells via CXCL12/CXCR4 signaling. Nature Neuroscience. 9, 1284-1293 (2006).
  24. Paredes, M. F., Li, G., Berger, O., Baraban, S. C., Pleasure, S. J. Stromal-derived factor-1 (CXCL12) regulates laminar position of Cajal-Retzius cells in normal and dysplastic brains. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 9404-9412 (2006).
  25. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 1613-1624 (2008).
  26. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  27. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 2301-2312 (2008).
  28. Legue, E., Riedel, E., Joyner, A. L. Clonal analysis reveals granule cell behaviors and compartmentalization that determine the folded morphology of the cerebellum. Development. 142, 1661-1671 (2015).
  29. Dahmane, N., Ruizi Altaba,, A, Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  30. Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Current Biology : CB. 9, 445-448 (1999).
  31. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
  32. Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270, 393-410 (2004).
  33. Zhao, H., Ayrault, O., Zindy, F., Kim, J. H., Roussel, M. F. Post-transcriptional down-regulation of Atoh1/Math1 by bone morphogenic proteins suppresses medulloblastoma development. Genes & Development. 22, 722-727 (2008).
  34. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  35. Klisch, T. J., et al. In vivo Atoh1 targetome reveals how a proneural transcription factor regulates cerebellar development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3288-3293 (2011).
  36. Miyata, T., Maeda, T., Lee, J. E. NeuroD is required for differentiation of the granule cells in the cerebellum and hippocampus. Genes & Development. 13, 1647-1652 (1999).
  37. Butts, T., Hanzel, M., Wingate, R. J. Transit amplification in the amniote cerebellum evolved via a heterochronic shift in NeuroD1 expression. Development. 141, 2791-2795 (2014).
  38. Rios, I., Alvarez-Rodriguez, R., Marti, E., Pons, S. Bmp2 antagonizes sonic hedgehog-mediated proliferation of cerebellar granule neurones through Smad5 signalling. Development. 131, 3159-3168 (2004).
  39. Anne, S. L., et al. WNT3 inhibits cerebellar granule neuron progenitor proliferation and medulloblastoma formation via MAPK activation. PloS One. 8, e81769 (2013).
  40. Chedotal, A. Should I stay or should I go? Becoming a granule cell. Trends in Neurosciences. 33, 163-172 (2010).
  41. Penas, C., et al. Casein Kinase 1delta Is an APC/C(Cdh1) Substrate that Regulates Cerebellar Granule Cell Neurogenesis. Cell Reports. 11, 249-260 (2015).
  42. Penas, C., et al. GSK3 inhibitors stabilize Wee1 and reduce cerebellar granule cell progenitor proliferation. Cell Cycle. 14, 417-424 (2015).
  43. Yang, Z. J., et al. Novel strategy to study gene expression and function in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience Methods. 132, 149-160 (2004).
  44. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nature Neuroscience. 10, 559-567 (2007).
  45. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 16182-16187 (2007).
  46. Famulski, J. K., et al. Siah regulation of Pard3A controls neuronal cell adhesion during germinal zone exit. Science. 330, 1834-1838 (2010).
  47. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. 14, 973-983 (2011).
  48. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. , (2014).
  49. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 106 beyincik geliştirme civciv dış granül tabakası dilim kültürü granül hücreleri Purkinje hücreleri elektroporasyon.
<em>Ex Vivo</em> Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter