Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ex Vivo Kultur Chick cerebellare Skiver og Rumligt Målrettet Elektroporation af granulat celleforstadier

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

Den cerebellar eksterne granulat lag er stedet for den største transit forstærkning i den udviklende hjerne. Her præsenterer vi en protokol til at målrette genetisk modifikation til dette lag på toppen af spredning ved hjælp af ex vivo elektroporation og kultur i cerebellare skiver fra embryonale Dag 14 kyllingeembryoer.

Abstract

Den cerebellar eksterne granulat lag (EGL) er stedet for den største transit forstærkning i den udviklende hjerne, og en fremragende model til at studere neuronal proliferation og differentiering. Desuden har evolutionære ændringer af dets proliferative kapacitet været ansvarlig for en dramatisk udvidelse af cerebellar størrelse i amniotes, gør lillehjernen en fremragende model for evo-Devo undersøgelser af hvirveldyrs hjerne. De konstituerende celler i EGL, cerebellare granula stamfædre, også udgøre en betydelig celle af oprindelse for medulloblastom, den mest udbredte pædiatriske neuronal tumor. Efter amplifikation transit, granulat forstadier vandrer radialt i det indre granulære lag af cerebellum, hvor de udgør den største neuronal population i den modne pattedyrs hjerne. I chick, toppen af ​​EGL proliferation forekommer i slutningen af ​​den anden uge af svangerskabet. For at målrette genetisk modifikation dette lag påtoppen af spredning, har vi udviklet en metode til genetisk manipulation gennem ex vivo elektroporation af cerebellum skiver fra embryonale Dag 14 kyllingeembryoer. Denne metode rekapitulerer flere vigtige aspekter af in vivo granulat neuron udvikling og vil være nyttige i generering af en grundig forståelse af cerebellar granula celleproliferation og differentiering, og dermed cerebellum udvikling, evolution og sygdom.

Introduction

Lillehjernen sidder ved den forreste ende af baghjerne og er ansvarlig for integration af sensoriske og motoriske forarbejdning i den modne hjerne samt regulering højere kognitive processer 1. Hos pattedyr og fugle, det er i besiddelse af en omfattende morfologi og er stærkt folieret, et produkt af omfattende transit opformering af stamceller under udviklingen, der producerer over halvdelen af ​​de neuroner i den voksne hjerne. Lillehjernen har været genstand for undersøgelse for neurobiologer i århundreder, og i den molekylære æra har ligeledes fået betydelig opmærksomhed. Dette vedrører ikke kun dens iboende interessant biologi, men også det faktum, at det er stærkt impliceret i human sygdom, herunder udviklingsmæssige genetiske sygdomme, såsom autisme spektrum forstyrrelser 2 og mest fremtrædende i cerebellar cancer, medulloblastom 3, som er den mest udbredte pædiatriske hjernen svulst. Vigtigt er det, det er en fremragende model system i WHich at studere skæbnen allokering og neurogenese under hjernens udvikling 4. I de senere år er det også blevet etableret som et modelsystem for sammenlignende undersøgelse af hjernens udvikling, på grund af den enorme mangfoldighed af cerebellare former ses på tværs af hvirveldyr fylogeni 5-10.

Lillehjernen udvikler sig fra den dorsale halvdel af rhombomere 1 i baghjerne 11 og udviklingsmæssigt består af to primære progenitorpopulationer, at rhombisk læbe og den ventrikulære zone. Den rhombisk læbe strækker sig rundt om dorsale region af neuroepithelium af baghjerne ved grænsen med taget pladen. Det er fødestedet for de glutamaterge excitatoriske neuroner i cerebellum 12-14. Den ventrikulære zone giver anledning til hæmmende GABAerge cerebellare neuroner, mest fremtrædende de store Purkinje neuroner 14,15. Senere i udvikling (fra omkring embryonale dag 13.5 i mus, e6 i chick 16), glutamaterg Progenkondensatorerne migrere tangentielt fra rombisk læbe og danner et pial lag af forfædre: en sekundær stamfader zone kaldes det ydre granulat lag (EGL). Det er dette lag, der gennemgår den omfattende transit forstærkning, der fører til det store antal granula neuroner findes i den modne hjerne.

Proliferation i EGL har længe været forbundet med sub-pial beliggenhed, at resultaterne fra tangential overgang fra rhombiske læbe 17, med kontakten til cellecyklus exit og neuronal differentiering af progenitorer er forbundet med deres udgang fra det ydre EGL laget i midten EGL 18. Omfattende tangential migration af post-mitotiske celler i granuleceller medial-laterale akse forekommer i mellemøret og det indre EGL 19, før den endelige radial migration ind i det indre granulat lag af det modne cerebellare cortex. Migration af celler fra rhombisk Lip over cerebellar overflade er afhængig CXCL12 signalering fra pia 20-22 23-25. Interessant, elektron mikroskopiske undersøgelser 17 har antydet, at EGL celler med en proliferativ morfologi opretholde pial kontakt, der forbinder celle adfærd med proliferativ kapacitet på en måde, der minder om de basale stamfædre af pattedyrs cortex 26. Dette afspejles i den førnævnte lagdeling af EGL i tre underlag, der er defineret ved distinkte ekstracellulære miljøer og hvor granula-forstadier har forskellige genekspression signaturer 18.

Proliferation af progenitorer i oEGL forekommer med en normal fordeling af klon størrelser således, at når stamfædre er individuelt genetisk mærket ved udgangen af ​​fosterudviklingen i musen, de giver anledning til en median gennemsnit på 250-500 g postmitotiskeranule neuroner 27,28. Spredning er afhængig af mitogen SHH signalering fra underliggende Purkinje neuroner 29-32. Evnen til at reagere på SHH har vist sig at være helt afhængig celleautonom ekspression af transkriptionsfaktoren Atoh1, både in vitro 33 og in vivo 34,35. Ligeledes har cellecyklus exit og differentiering vist sig at være afhængig af ekspressionen af nedstrøms transkriptionsfaktor NeuroD1 36, hvilket sandsynligvis en direkte repressor Atoh1 37.

Trods disse fremskridt og en betydelig fremgang i dechifrere cellen biologiske grundlag for cellecyklus exit 38-42, at den grundlæggende molekylære mekanisme (r), der ligger bag beslutningen forlade cellecyklen og til at skifte fra en progenitor til en differentierende neuron, og associerede postmitotiske tangential migration i den indre EGL samt senere switchradial migration, forbliver ufuldstændigt forstået. Dette er i vid udstrækning på grund af den eksperimentelle intractability af EGL: det er sent udvikling, og vanskelige at målrette genetisk da mange af de samme neurogene molekyler er også afgørende tidligere i livet af granula-forstadier ved rhombisk Lip. For at overvinde dette problem har adskillige forfattere udviklet in vivo og ex vivo elektroporation som en metode til at målrette den postnatale cerebellum hos gnavere 43-48. Her har vi pioner brugen af ex vivo elektroporation i chick at studere EGL, som repræsenterer betydelige fordele med hensyn til omkostninger og bekvemmelighed. Vores metode til elektroporation og ex vivo-skive kultur chick cerebellar væv anvendelser væv dissekeret fra embryonale Dag 14 kyllinger på toppen af EGL spredning. Denne metode gør det muligt genetisk målretning af EGL uafhængigt af rombisk læbe og vil sætte scenen for genetisk dissektion af overgangen fra granulatprogenitor til postmitotiske granulat neuron i cerebellum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle forsøg blev udført med henhold til Kings College London, UK og dyrs pleje retningslinjer det britiske indenrigsministerium.

1. Dissektion af E14 Cerebellum

  1. Inkuber brune befrugtede hønseæg ved 38 ° C til embryonale Dag 14.
  2. Brug af æg saks halshugge chick embryo in ovo og fjern hovedet på en petriskål indeholdende iskold PBS (figur 1A).
  3. Anvendelse af standard pincet, gør indsnit bag hvert øje hele vejen gennem vævet, fjernelse af øjne og overkæben. Foretag en anden snit hele vejen gennem svælget fjerne underkæben (figur 1B).
  4. Ved hjælp af standard pincet, fjerne alle hud fra overfladen af kraniet ved at trække den væk (figur 1C) og fjern frontale og parietale knogler, afslørende hjerne.
  5. Fra en ventral aspekt fjerne svælg brusk og hjælpeudstyr mesenchyme.
  6. Fra en dorsal aspekt omhyggeligly fjern mesenkym dorsale til baghjerne pas på ikke at beskadige pia, og separat hele hjernen (figur 1D).
  7. Gør snit hele vejen gennem vævet mellem midthjernen og baghjernen og separat baghjernen herunder cerebellum (figur 1E).
  8. Ved at gøre indsnit hele vejen igennem vævet ved begge laterale kryds af cerebellum og alar plade af baghjernen, fjerne hele cerebellum, idet man bevare integriteten af pia hele dissektion (figur 1F). Fjern danner choroid plexus (figur 1G).
  9. Flyt dissekeret lillehjernen i iskold HBSS.

2. Slice Kultur E14 Cerebellum

  1. Overfør hele lillehjernen til sterile platform på en vævshakker med en spatel eller en 3 ml Pasteur-pipette med spidsen skåret bort for at udvide åbningen. Fjern overskydende væske ved hjælp af en pipette.
  2. Skær hele hele lillehjernen i tHan krævede orientering ved 300 um tykkelse ved hjælp af vævshakker sæt med en skærehastighed på 50% af det maksimale. Tissue integritet er lettest bevaret i sagittale snit; imidlertid orientering er også en vigtig overvejelse for celleanalyse (Purkinje celle dendritter sagittalt linie, mens granulat celle axoner køre på tværs vinkelret på planet af Purkinje celle dendritter).
  3. Ved hjælp af en 3 ml Pasteur-pipette, dække skiver lillehjernen i iskold HBSS.
  4. Overfør skiverne i HBSS til en 60 mm petriskål indeholdende iskold frisk HBSS ved hjælp af en 3 ml Pasteur-pipette med skåret spids.
  5. Under et dissektionsmikroskop belyst med en fiberoptisk lyskilde, sikre en adskillelse af de enkelte skiver ved hjælp urmager pincet. Identificer skiver, der skal elektroporeres, baseret på deres væv integritet og medio-lateral position.
    Bemærk: Hver dissektion fra foster gennem at skære inkubation i dyrkningsmedium tager omkring 10-20 min afhængig upon oplevelse. Udfør dissektioner én ad gangen for at sikre, at cerebella tilbringe minimum af tid mellem halshugning og ex vivo-kultur.

3. Elektroporation af Slices

  1. Konstruere en elektroporation kammer ved fastsættelse anoden af ​​en elektroporator til bunden af ​​en 60 mm petriskål med isolering tape. Der tilsættes ca. 1 ml HBSS til at dække elektroden.
  2. Placer en 0,4 um kultur insert oven på elektroden dækket i HBSS. Tillad kulturen indsatsen til hvile på elektroden sikre, at der altid er kontakt mellem indsatsen og elektroden.
    Bemærk: I denne opsætning vil kulturen indsatsen med skiverne hvile på overfladen af ​​opløsningen, fastholde kredsløbet men tillader rumlige målretning af katoden.
  3. Overfør identificerede skiver (op til fem pr kultur insert) på kultur insert hjælp 3 ml Pasteur pipette med snittet spids. Separat og lad rette på kultur insert i en sagittal orientering.
  4. Ved hjælp af en pipette, fjerne overskydende HBSS så skiverne ikke længere badet i opløsning.
  5. Ved hjælp af en P10 pipettespids, pipette DNA (i en koncentration på 1 pg / pl) fortyndet med 20% fast green over overfladen af ​​target-området af et udsnit. 20% fast green sikrer viskos DNA-opløsning og forhindrer uoverkommeligt stor spredning af DNA. Tilsæt ca. 5 pi DNA / fast green løsning på hver skive (figur 2B).
  6. Placer katoden i ønskede målrettede væv og elektroporere med 3 x 10 V, 10 ms varighed pulser. Undgå direkte kontakt af katoden med vævet. I stedet udnytte overfladespænding af væsken til at opretholde ledningsevne (placere katoden så tæt på vævet som muligt uden faktisk at berøre vævet).
  7. Gentag DNA levering og elektroporering til flere regioner i EGL på hver enkelt skive cerebellar som ønsket.
  8. Ved afslutningen af ​​elektroporation, overførsel kultur Insert til 30 mm petriskål.
  9. Til hver kultur, tilsættes 1 ml forvarmet dyrkningsmedium (Basal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - glucose, 1% B27 supplement, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) under kulturen indsatsen, således at kulturen insertet er i kontakt med mediet, men skiver er ikke badet i det.
  10. Inkuber kulturer ved 37 ° C / 6% CO2 i op til 3 dage. Erstatte alle dyrkningsmediet hver 24 timer med frisk forvarmet medium.
  11. Efter kultur, løse skiver på kulturen indsætter i 1 time i 4% paraformaldehyd (eller O / N ved 4 ° C) i en frisk 30 mm skål uden dyrkningsmediet.

4. Imaging af cerebellare Skiver

  1. Efter fiksering, vask skiver 3 gange i 5 minutter i PBS.
  2. Ved hjælp af et barberblad, dissekere hver elektroporeret og dyrkes cerebellar skive fra kulturen indsatsen ved at skære omkring skive og fjerne skive og regionen indsatsen det overholdes. Gøreikke forsøge at fjerne skive fra kulturen insert overflade.
  3. Mount skiver i ca 1 ml af montering medium indeholdende DAPI (hvis det ønskes) under et dækglas pas på ikke at indføre bobler, og billedet ved hjælp af laser-scanning konfokal mikroskopi.
    Bemærk: Billedbehandling parametre kan varieres i henhold til de konstruktioner elektroporerede og skøn den enkelte bruger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette afsnit viser eksempler på resultater, der kan opnås ved hjælp af slice elektroporation og kultur lillehjernen fra embryonale Dag 14 kylling. Dissektion af cerebellum er illustreret i figur 1 og elektroporation kammer oprettet er vist i figur 2. Vi viser, at det er muligt at elektroporere og med held kultur cerebellare skiver, som bibeholder deres struktur og cellulære morfologier in vitro (figur 3A). Målrettet elektroporering til individuelle Folia let opnås (figur 3B). Vi har med held elektroporere en række forskellige plasmider i EGL celler og viser, at det er muligt i) at mærke cellerne med reporter-konstruktioner at observere deres adfærd (figur 3C), ii) til at teste mulige genomiske regioner for funktionalitet i cerebellare celler (figur 3D ), og iii) at manipulere genetisk denceller i EGL ved misexpressing proteiner af interesse (Figur 3E). Derudover er mulige farmakologiske manipulationer på elektroporerede skiver (resultater ikke vist). Efter dyrkning er det muligt at udføre yderligere vævsanalyse såsom immunohistokemi eller proliferation assays (figur 3F). Vi udfører væv sundhed analyse ved calbindin og PH3 immunfarvning og vise, at væv integritet bevares i mindst 3 div efter kultur (figur 4). Disse resultater viser, at EGL er nu en tilgængelig og let kan manipuleres struktur, der kan være fuldt undersøgt og genetisk ændret i chick modelsystemet.

Figur 1
Figur 1. Dissektion af lillehjernen fra E14 kyllingeembryoer. (A) halshugge den kylling i ægget, og fjern hovedet intOA petriskål med iskold PBS. Fjern den nederste kæbe og øjne ved at gøre indsnit bag øjnene og svælget (stiplet linie). (B) Fjern skindet fra overfladen af kraniet. (C) Fjern frontale og parietale knogler og (D) at fjerne hjernen fra mesenkym og brusk omkring den. (E) under et dissektionsmikroskop identificere placeringen af cerebellum ved den bageste ende af hjernen. Skær mellem midthjernen og baghjerne (stiplede linjer) for at stå tilbage med lillehjernen og ventrale baghjernen. (F) Gør indsnit i det laterale kryds (stilke) i cerebellum at adskille cerebellum fra baghjerne (stiplet linie). (G) Fjern choroid plexus (stjerne) fra den ventrale side af lillehjernen, indtil du står tilbage med en hel intakt lillehjernen med pia vedlagt. Overfør lillehjernen i iskold HBSS før forberede skiver med en serviet ChoppER. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. elektroporation kammer oprettet. (A) Et billede af specialfremstillet elektroporation kammer. Kammeret består af en anode af et elektroporator placeret sikkert på bunden af ​​en 60 mm petriskål. Skålen indeholder ca. 1 ml HBSS til at dække elektroden. Kulturen indsatsen bør hvile på elektroden med konstant kontakt mellem indsatsen og elektroden, opretholdelse af kredsløb, men tillader rumlige målretning af katoden, som er manipuleret med hånden. (B) Et billede af skiver bliver elektroporeret. Skiver er dækket med DNA / hurtig grøn løsning. Skiverne elektroporeret som ønsketd: elektroporering kan målrettes til en folium eller flere steder. Efter elektroporation indsatsen er placeret i en 30 mm petriskål med foropvarmet dyrkningsmedium og dyrkes i inkubatoren. 1. Anoden 2. Katoden 3. Kultur indsats 4. petriskål med 1 ml HBSS 5. dissektionsmikroskop 6. Individuelle skiver fra vævshakker 7. DNA-opløsning med hurtig grønt farvestof. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3. Repræsentative resultater. (A) En lav forstørrelse billede af en kontrol elektroporering af en RFP koder plasmidet i EGL på flere steder. Vævet bibeholder sin struktur og elektroporerede celler er klart synlige i et tykt lag af subpial cerebellum. (B) Eneksempel på en målrettet elektroporation med en kontrolgruppe GFP plasmid. Den målrettede folium er angivet med en asterisk. Målestokken AB = 500 um. (C) Et eksempel, hvor en konstruktion, der koder GFP drevet af en Atoh1 enhancer er elektroporeret ind EGL. Ekspressionen af Atoh1 definerer granula celleprecursorer i EGL. Forskellige celle morfologier er klart synlige på 3 div og celle adfærd kan overvåges. (D) Et eksempel på mærkning efter elektroporering af en konstruktion indeholdende en formodet bevaret ikke-kodende element (CNE) af NeuroD1 genet kørsel GFP. CNE rapporterer aktiviteten i cellerne forventede baseret på endogen NeuroD1 udtryk antyder en aktiv rolle i denne CNE i udvikling. NeuroD1 udtryk korrelerer med indledningen af ​​granula celledifferentiering. (E) Et eksempel, hvor vævet kan være genetisk manipuleret af misexpression af NeuroD1 protein og en ændring i granula celle Behavførsel kan observeres. (F) Et eksempel, hvor elektroporerede væv (kontrollere GFP plasmid) kan fikseres og farves for markører for prolifererende celler, såsom phosphohistone H3 (PH3). Målestok CF = 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Tissue integritet og proliferation i kultur. (A - C) calbindin farvning af E14 cerebellar væv elektroporeret med en kontrol GFP plasmid på 1-3 dage in vitro (div). Calbindin farvning viser, at vævsintegritet opretholdes i kultur i mindst 3 div. Purkinje cellelaget ikke danner et monolag på dette stadium chick udvikling, men det ses tydeligt dannelse af et lag nedenunderEGL hvor granulerede celler (grøn) er placeret. (D) Phosphohistone H3 (PH3) farvning på cerebellare væv dyrket i 2 div. PH3 farvning er synlig i EGL (pile), men også i andre cerebellare regioner (pilespidser). Denne farvning er repræsentativ for alle faser i kultur undersøgte (1-3 div). Målestok AD = 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen rapporteret her beskriver en metode til at dissekere, elektroporering og dyrkning skiver af embryonale Dag 14 lillehjernen fra chick. Denne protokol muliggør målretning af elektroporation til små fokale områder af EGL, herunder isolerede målretning af individuelle cerebellare lapper. Det gør det muligt genetisk analyse og billeddannelse med en høj opløsning og bekvemmelighed til en lav pris sammenlignet med etablerede teknikker i gnavere 43-47. Sådanne analyser er i øjeblikket ikke muligt in vivo på grund af den forlængede udviklingsmæssige tidspunkt, knapheden på EGL-specifikke genetiske targeting muligheder i musen og ensartethed i molekylære mekanismer mellem rhombisk læbe og EGL, hvilket betyder, at ændringer, der kan påvirke EGL biologi ofte ikke kan analyseres, da de påvirker rombiske læbe neurogenese og ophæver EGL dannelse 49. Vores system repræsenterer således et stort fremskridt i forhold til at målrette genetisk modifikation til EGL specifically, og vi forventer at det vil være gældende for andre arter uden for chick at måske sammenlignende interesse, såsom ikke-model pattedyr og krybdyr.

Ved udførelse af skive kultur elektroporation teknik, en række tekniske overvejelser er altafgørende. For det første, at robustheden af ​​skiver overleve i kultur uden på den ene side undergår omfattende celledød eller på den anden miste strukturelle integritet begrænser tykkelsen af ​​skive til 300 um i vores hænder. En anden vigtig overvejelse er viskositeten af ​​DNA-opløsningen, hvilket sikrer elektroporation af DNA ved koncentrationer, der er høje nok til at inducere synlige eller relevante niveauer af genetisk modifikation. I in ovo elektroporering af DNA-opløsninger injiceres i tidlige embryonale baghjerne, koncentrationer af fast green farvestof på ca. 1% er typiske. Men i vores protokol, vi bruger typisk koncentrationer af fast green på 20%. Dette sikrer en tilstrækkelig viscous DNA-opløsning for at forhindre spredning af DNA efter pipettering men før elektroporation, men en tilstrækkeligt fortyndet en til at mægle en effektiv el-ledning.

Ud over disse tekniske overvejelser, observerede vi, at proliferativ adfærd, som vi observerer ex vivo ikke præcist match, forudsiges ud fra in vivo-undersøgelser sandsynligvis på grund af pial integritet bliver forstyrret af vævspræparatet. Under sådanne betingelser, når en GFP ekspressionskonstruktion er elektroporeret, en stor del af elektroporerede celler synes at have forladt cellecyklus efter kun en dags kultur som bedømt ved PH3 farvning (figur 3F). Dette ikke korrelerer med forventet EGL proliferativ adfærd, hvor spredning af kloner i både mus og kylling strækker sig over et stort tidsrum 27. Implikationen at pia modulerer spredning understøttes af den observation, at når vi elektroporere en reporter konstrukt med en NeuroD1 regulatorisk element driver ekspression af GFP alle elektroporerede celler udtrykker GFP efter en dag i kultur (figur 3D). In vivo, denne konstruktion spejle endogen NeuroD1 ekspression i mærkningen celler i den indre EGL, der er post-mitotiske 36,37, mens fuld længde NeuroD1 er tilstrækkelig til at drive celledifferentiering (figur 3E). Dette antyder, at under visse betingelser, den proliferative evne af celler kan ikke opretholdes, som den er i den ydre EGL på tilsvarende trin i vivo. PH3 farvning betyder dog foreslå, at der er en masse af proliferation i kultur, ofte lokaliseret til EGL-området (figur 4D). Omfattende spredning uden for EGL indikerer muligvis forbedret gliogenesis eller proliferation af Pax2 GABAerge forstadier i hvid substans. Implikationen er, at fortolkningen af ​​enhver eksperimentelle procedure bliver nødt til at tage hensyn til de ovennævnte proliferative adfærd, kan det faktum, at Purkinjeceller ikke danner et monolag, indtil E18 i chick og at den normale udvikling blive kompromitteret efter fremstilling skive (f.eks på grund af mangel på interaktion med klatring fibre etc.)

På trods af disse begrænsninger, vores protokol er et vigtigt skridt fremad i forhold til at studere mange aspekter af granula cellebiologi. Den afgørende fordel, at rumligt og tidsligt specifik mærkning af EGL til forskel fra rombiske læbe vil lette flere undersøgelser af både cellens biologi granula stamfædre og den genetiske regulering underbygger det på en måde, som ikke er muligt på nuværende tidspunkt in vivo. Vores teknik chick vil supplere de eksisterende ex vivo kultur og elektroporation protokoller gnavere 43-48 og bærer de betydelige fordele i omkostninger og bekvemmelighed, der er forbundet med kylling. Derudover er det udgør et betydeligt fremskridt i forholdeksisterende teknikker til dyrkning granula-progenitorer 39. Selv om det vil supplere snarere end erstatte sidstnævnte, vil vores protokol åbner kontrollen med granulat neuron differentiering til en lang række farmaceutiske behandlinger og mangfoldigheden af ​​celleautonom genetiske manipulationer, der er mulige i chick. Det giver et fundament for behandlingen af ​​granula cellebiologi i hidtil uset detalje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Den præsenteres i denne artikel metode opstod fra arbejde finansieret af BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) og en MRC ph.d. studentship (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
  2. Becker, E. B., Stoodley, C. J. Autism spectrum disorder and the cerebellum. International Review of Neurobiology. 113, 1-34 (2013).
  3. Hatten, M. E., Roussel, M. F. Development and cancer of the cerebellum. Trends in Neurosciences. 34, 134-142 (2011).
  4. Butts, T., Green, M. J., Wingate, R. J. Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain. Development. 141, 4031-4041 (2014).
  5. Rodriguez-Moldes, I., et al. Development of the cerebellar body in sharks: spatiotemporal relations of Pax6 expression, cell proliferation and differentiation. Neuroscience Letters. 432, 105-110 (2008).
  6. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 29, 6142-6153 (2009).
  7. Chaplin, N., Tendeng, C., Wingate, R. J. Absence of an external germinal layer in zebrafish and shark reveals a distinct, anamniote ground plan of cerebellum development. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 3048-3057 (2010).
  8. Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
  9. Butts, T., Modrell, M. S., Baker, C. V., Wingate, R. J. The evolution of the vertebrate cerebellum: absence of a proliferative external granule layer in a non-teleost ray-finned fish. Evolution & Development. 16, 92-100 (2014).
  10. Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M., Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development. 133, 1811-1821 (2006).
  11. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development. 126, 4395-4404 (1999).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  14. Yamada, M., et al. Specification of spatial identities of cerebellar neuron progenitors by ptf1a and atoh1 for proper production of GABAergic and glutamatergic neurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 4786-4800 (2014).
  15. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  16. Wilson, L. J., Wingate, R. J. Temporal identity transition in the avian cerebellar rhombic lip. Developmental Biology. 297, 508-521 (2006).
  17. Hausmann, B., Sievers, J. Cerebellar external granule cells are attached to the basal lamina from the onset of migration up to the end of their proliferative activity. The Journal of Comparative Neurology. 241, 50-62 (1985).
  18. Xenaki, D., et al. F3/contactin and TAG1 play antagonistic roles in the regulation of sonic hedgehog-induced cerebellar granule neuron progenitor proliferation. Development. 138, 519-529 (2011).
  19. Komuro, H., Yacubova, E., Yacubova, E., Rakic, P. Mode and tempo of tangential cell migration in the cerebellar external granular layer. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 527-540 (2001).
  20. Klein, R. S., et al. SDF-1 alpha induces chemotaxis and enhances Sonic hedgehog-induced proliferation of cerebellar granule cells. Development. 128, 1971-1981 (2001).
  21. Zhu, Y., et al. Role of the chemokine SDF-1 as the meningeal attractant for embryonic cerebellar neurons. Nature Neuroscience. 5, 719-720 (2002).
  22. Hagihara, K., et al. Shp2 acts downstream of SDF-1alpha/CXCR4 in guiding granule cell migration during cerebellar development. Developmental Biology. 334, 276-284 (2009).
  23. Borrell, V., Marin, O. Meninges control tangential migration of hem-derived Cajal-Retzius cells via CXCL12/CXCR4 signaling. Nature Neuroscience. 9, 1284-1293 (2006).
  24. Paredes, M. F., Li, G., Berger, O., Baraban, S. C., Pleasure, S. J. Stromal-derived factor-1 (CXCL12) regulates laminar position of Cajal-Retzius cells in normal and dysplastic brains. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 9404-9412 (2006).
  25. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 1613-1624 (2008).
  26. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  27. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 2301-2312 (2008).
  28. Legue, E., Riedel, E., Joyner, A. L. Clonal analysis reveals granule cell behaviors and compartmentalization that determine the folded morphology of the cerebellum. Development. 142, 1661-1671 (2015).
  29. Dahmane, N., Ruizi Altaba,, A, Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  30. Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Current Biology : CB. 9, 445-448 (1999).
  31. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
  32. Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270, 393-410 (2004).
  33. Zhao, H., Ayrault, O., Zindy, F., Kim, J. H., Roussel, M. F. Post-transcriptional down-regulation of Atoh1/Math1 by bone morphogenic proteins suppresses medulloblastoma development. Genes & Development. 22, 722-727 (2008).
  34. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  35. Klisch, T. J., et al. In vivo Atoh1 targetome reveals how a proneural transcription factor regulates cerebellar development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3288-3293 (2011).
  36. Miyata, T., Maeda, T., Lee, J. E. NeuroD is required for differentiation of the granule cells in the cerebellum and hippocampus. Genes & Development. 13, 1647-1652 (1999).
  37. Butts, T., Hanzel, M., Wingate, R. J. Transit amplification in the amniote cerebellum evolved via a heterochronic shift in NeuroD1 expression. Development. 141, 2791-2795 (2014).
  38. Rios, I., Alvarez-Rodriguez, R., Marti, E., Pons, S. Bmp2 antagonizes sonic hedgehog-mediated proliferation of cerebellar granule neurones through Smad5 signalling. Development. 131, 3159-3168 (2004).
  39. Anne, S. L., et al. WNT3 inhibits cerebellar granule neuron progenitor proliferation and medulloblastoma formation via MAPK activation. PloS One. 8, e81769 (2013).
  40. Chedotal, A. Should I stay or should I go? Becoming a granule cell. Trends in Neurosciences. 33, 163-172 (2010).
  41. Penas, C., et al. Casein Kinase 1delta Is an APC/C(Cdh1) Substrate that Regulates Cerebellar Granule Cell Neurogenesis. Cell Reports. 11, 249-260 (2015).
  42. Penas, C., et al. GSK3 inhibitors stabilize Wee1 and reduce cerebellar granule cell progenitor proliferation. Cell Cycle. 14, 417-424 (2015).
  43. Yang, Z. J., et al. Novel strategy to study gene expression and function in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience Methods. 132, 149-160 (2004).
  44. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nature Neuroscience. 10, 559-567 (2007).
  45. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 16182-16187 (2007).
  46. Famulski, J. K., et al. Siah regulation of Pard3A controls neuronal cell adhesion during germinal zone exit. Science. 330, 1834-1838 (2010).
  47. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. 14, 973-983 (2011).
  48. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. , (2014).
  49. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).

Tags

Developmental Biology lillehjernen udvikling chick ekstern granulat lag skive kultur granula celler Purkinjeceller elektroporation.
<em>Ex Vivo</em> Kultur Chick cerebellare Skiver og Rumligt Målrettet Elektroporation af granulat celleforstadier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter