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Developmental Biology

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen.

Abstract

Die Kleinhirn externen Körnerschicht (EGL) ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn, und ein hervorragendes Modell für neuronale Proliferation und Differenzierung des Studiums. Darüber hinaus evolutionären Modifikationen ihrer Proliferationsfähigkeit wurden für die dramatische Ausweitung der Kleinhirngröße in den Amnioten verantwortlich, so dass das Kleinhirn ein hervorragendes Modell für Evo-Devo-Studien des Wirbeltiergehirns. Die konstituierenden Zellen der EGL, Kleinhirn-Körnervorläuferzellen, auch einen signifikanten Zellherkunfts stellen für Medulloblastom, die am häufigsten pädiatrischen neuronalen Tumor. Nach dem Transit-Amplifikation, Granulat Vorstufen migrieren radial in die innere Körnerschicht des Kleinhirns, wo sie den größten neuronalen Population im reifen Gehirn von Säugetieren dar. In chick, der Höhepunkt der EGL Proliferation tritt gegen Ende der zweiten Woche der Schwangerschaft. Um genetische Veränderung auf diese Schicht bei Targetder Peak der Proliferation, haben wir ein Verfahren zur genetischen Manipulation durch ex vivo-Elektroporation von Cerebellum Scheiben aus embryonalen Tag 14 Kükenembryos entwickelt. Dieses Verfahren faßt einige wichtige Aspekte der in vivo Granulatneuronenentwicklung und ist nützlich bei der Erzeugung ein gründliches Verständnis der Kleinhirn-Körnerzellproliferation und -differenzierung sein, und damit der Kleinhirn-Entwicklung, Evolution und Krankheit.

Introduction

Das Kleinhirn sitzt am vorderen Ende der Hinterhirn und ist für die Integration von sensorischen und motorischen Verarbeitung im reifen Gehirn verantwortlich sowie die Regelung höhere kognitive Prozesse 1. In Säugetieren und Vögeln, eine aufwendige Morphologie besitzt sie und ist stark blättrigen, ein Produkt der umfangreichen Transit Amplifikation von Vorläuferzellen während der Entwicklung, die mehr als die Hälfte der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn produziert. Das Kleinhirn ist für Neurobiologen seit Jahrhunderten und in der molekularen Ära ein Thema der Studie hat ebenfalls erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Dies bezieht sich nicht nur auf ihre inhärent interessante Biologie, sondern auch auf die Tatsache, dass es stark in menschlichen Erkrankungen einschließlich Entwicklungs genetische Störungen wie Autismus 2 und am deutlichsten Kleinhirnkrebs, Medulloblastom 3, die die häufigste pädiatrische Gehirn beteiligt ist Tumor. Wichtig ist, dass es ein ausgezeichnetes Modellsystem im which dem Schicksal Allokation und Neurogenese während der Gehirnentwicklung 4 studieren. In den letzten Jahren hat es sich auch als Modellsystem für die vergleichende Untersuchung der Entwicklung des Gehirns festgestellt wurde, auf Grund der großen Vielfalt von Formen für die Kleinhirnwirbel phylogeny 5-10 ersichtlich.

Das Kleinhirn entwickelt sich von der dorsalen Hälfte Rhombomer 1 im Hinterhirn 11 und entwicklungs besteht aus zwei primären Vorläuferpopulationen, die Rautenlippe und der ventrikulären Zone zusammen. Die rhombische Lippe erstreckt sich um den dorsalen Bereich des Neuroepithels des Rautenhirns an der Grenze mit dem Dachblech. Es ist der Geburtsort der glutamatergen erregenden Neuronen des Kleinhirns 12-14. Die ventrikuläre Zone führt zu den inhibitorischen GABAergen Neuronen des Kleinhirns, allen voran die großen Purkinje Neuronen 14,15. Später in der Entwicklung (von etwa embryonalen Tag 13,5 in Maus; e6 in chick 16), glutamatergen PROGENitors tangential wandern von der Rautenlippe und bilden eine Schicht der Pia-Vorläuferzellen: eine sekundäre Vorläuferzone genannt externen Körnerschicht (EGL). Es ist diese Schicht, die den umfangreichen Transit Verstärkung, die auf die große Zahl von Körnerzellen im reifen Gehirns führt erfährt.

Proliferation im EGL seit langem zum Teil pial Platz, in tangentiale Migration vom rhombischen Lippe 17 führt in Verbindung gebracht worden, wobei der Schalter auf den Zellzyklus verlassen und die neuronale Differenzierung von Vorläufern mit ihrem Austritt aus dem Außen EGL Schicht in der Mitte zugehörigen EGL 18. Umfangreiche tangentiale Migration von postmitotischen Körnerzellen im medial-laterale Achse erfolgt in der mittleren und inneren EGL 19, vor dem abschließenden radialen Wanderung in die innere Körnerschicht des reifen Kleinhirnrinde. Migration von Zellen aus dem rhombischen Lippe über der Kleinfläche abhängt CXCL12 Signalisierung vom pia 20-22 23-25. Interessanterweise elektronenmikroskopischen Untersuchungen 17 haben vorgeschlagen, dass die EGL-Zellen mit einer proliferativen Morphologie beizubehalten Pia-Kontakt, die Verknüpfung Zellverhalten mit proliferative Fähigkeit in einer Art und Weise erinnert an die basalen Vorläuferzellen der Säugetier Cortex 26. Dies wird in der vorgenannten Schichtung der EGL in drei Unterschichten, die durch verschiedene extrazelluläre Umgebungen und wo Körnchen Vorstufen haben verschiedene Genexpressions 18 definiert sind, reflektiert wird.

Proliferation von Vorläufern im oEGL tritt mit einer Normalverteilung von Klon Größen, so dass zu einem Medianwert von 250-500 g postmitotischen wenn Progenitoren einzeln genetisch am Ende der Embryonalentwicklung der Maus markiert, sie gebenranule Neuronen 27,28. Proliferation ist abhängig von mitogenen SHH-Signalisierung von der zugrunde liegenden Purkinje Neuronen 29-32. Die Fähigkeit, auf Shh antworten hat sich gezeigt, völlig abhängig von zellautonomen Expression des Transkriptionsfaktors Atoh1 zu sein, sowohl in vitro als auch in vivo 33 34,35. Ebenso Zellzyklus verlassen und Differenzierung wurde gezeigt, abhängig von der Expression des Downstream-Transkriptionsfaktor NeuroD1 36, die wahrscheinlich eine direkte Repressor Atoh1 37 sein.

Trotz dieser Fortschritte und erheblichen Fortschritt in der Entzifferung der zellbiologischen Grundlagen der Zellzyklus-Ausgang 38-42, die grundlegende molekulare Mechanismus (n), die die Entscheidung zugrunde liegen, die den Zellzyklus zu verlassen und von einem Stammvater zu einem differenzierenden Neuronen übergehen, und die assoziierten postmitotischen tangentiale Migration im inneren EGL sowie die später Schalterum die radiale Migration, bleiben unvollständig verstanden. Dies ist zu einem großen Teil aufgrund der experimentellen intractability der EGL: es spät entwickelnden und genetisch schwer gezielt da viele der neurogenen Moleküle sind auch entscheidend früher im Leben der Granulat Vorstufen am rhombischen Lippe. Um dieses Problem zu überwinden, wurden zahlreiche Autoren in vivo und ex vivo Elektroporation als eine Methode, um die postnatale Kleinhirn bei Nagern 43-48 Ziel entwickelt. Hier haben wir Pionierarbeit in der Verwendung von ex vivo Elektroporation in Küken, die EGL, die erhebliche Vorteile in Bezug auf Kosten und Bequemlichkeit stellt studieren. Unsere Methode der Elektroporation und ex vivo Schnittkultur von Chick Kleinhirngewebe verwendet Gewebe aus embryonalen Tag seziert 14 Küken auf dem Höhepunkt der EGL Verbreitung. Diese Methode ermöglicht es genetische Targeting des EGL unabhängig rhombischen Lippe und die Bühne für Genetik der Übergang vom Granulat eingestelltVorläufer zu postmitotischen Granulat Neuronen im Kleinhirn.

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Protocol

Hinweis: Alle Experimente wurden mit entsprechend den Kings College London, Großbritannien und die britische Innenministerium Tierpflege-Richtlinien durchgeführt.

1. Präparation der e14 Cerebellum

  1. Braun befruchteten Hühnereiern Inkubation bei 38 ° C zu embryonalen Tag 14.
  2. Mit Ei Schere enthaupten Hühnerembryo in ovo, und entfernen Sie den Kopf auf eine Petrischale mit eiskaltem PBS (Abbildung 1A).
  3. Verwendung von Standard-Pinzette, machen Einschnitte hinter jedem Auge den ganzen Weg durch das Gewebe, das Entfernen der Augen und Oberkiefer. Einen zweiten Schnitt ganz durch den Rachen Entfernen des Unterkiefers (Abbildung 1B).
  4. Verwendung von Standard-Pinzette, entfernen Sie die Haut von der Oberfläche des Schädels durch Abziehen es weg (Abbildung 1c), und entfernen Sie frontalen und parietalen Knochen und enthüllt Gehirn.
  5. Aus einer ventralen Seite, entfernen Rachen Knorpel und Hilfs Mesenchym.
  6. Aus einer dorsalen, vorsichtigly entfernen Mesenchym dorsal der Hinterhirn dabei nicht pia und separate gesamte Gehirn (1D) beschädigen.
  7. Machen Einschnitt den ganzen Weg durch das Gewebe zwischen Mittelhirn und Hinterhirn und Hinterhirn separaten einschließlich Kleinhirn (1E).
  8. Durch Einschnitte den ganzen Weg durch das Gewebe an beiden seitlichen Übergängen von Kleinhirn und Flügelplatte des Hinterhirn, entfernen gesamte Kleinhirn, kümmert sich um die Integrität der Pia gesamten Dissektion (1F) zu halten. Entfernen Sie die bildenden Plexus (1G).
  9. Bewegen Sie den seziert Kleinhirn in eiskaltes HBSS.

2. Scheibe Kultur von e14 Cerebellum

  1. Übertragen die gesamte Kleinhirn in den sterilen Plattform einer Tissue Chopper mit einem Spatel oder ein 3 ml Pasteurpipette mit der Spitze weggeschnitten ist, um die Öffnung zu erweitern. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette.
  2. Schneiden gesamte Ganze Kleinhirn in ter benötigt Orientierung bei 300 & mgr; m Dicke mit dem Gewebe Chopper mit einer Schnittgeschwindigkeit eingestellt auf 50% des Maximums. Gewebeintegrität wird am einfachsten im Sagittalschnitt bewahrt; jedoch ist die Orientierung auch ein wichtiger Gesichtspunkt für die Zellanalyse (Purkinjezelle Dendriten sagittal ausgerichtet sind, während die Körnerzell Axone verlaufen quer, senkrecht zur Ebene der Purkinje Zelle Dendriten).
  3. Mit einem 3 ml Pasteurpipette, decken Sie die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn in eiskaltem HBSS.
  4. Übertragen Sie die Scheiben in HBSS auf eine 60 mm Petrischale mit Eis kalte Frisch HBSS mit einem 3 ml Pasteurpipette mit geschnittenen Spitze.
  5. Unter einem Binokular mit einem faseroptischen Lichtquelle beleuchtet wird, sicherzustellen, Trennung der einzelnen Scheiben mit Uhrmacher Pinzette. Identifizieren Scheiben elektroporiert werden, auf der Grundlage ihrer Gewebeintegrität und medio-laterale Position.
    Hinweis: Jeder Dissektion vom Embryo bis zur Inkubation in Kulturmedium in Scheiben schneiden dauert etwa 10-20 min je upon-Erlebnis. Zuführen Dissektionen eine zu einem Zeitpunkt, um sicherzustellen, dass cerebella verbringen minimalen Zeitspanne zwischen Dekapitation und ex vivo-Kultur.

3. Elektroporation von Slices

  1. Konstruktion eines Elektroporationskammer durch Fixieren der Anode einer Elektroporator auf der Basis einer 60 mm Petrischale mit Isolierband. In etwa 1 ml HBSS, um die Elektrode zu bedecken.
  2. Legen Sie eine 0,4 um Kultureinsatz an der Spitze der Elektrode in HBSS bedeckt. Lassen Sie das Kultureinsatzes auf die Elektrode dafür sorgen, gibt es immer zwischen dem Einsatz und der Elektrode kontaktieren ausruhen.
    Hinweis: In dieser Konfiguration wird der Kultureinsatz mit den Scheiben auf die Oberfläche der Lösung liegen, die Aufrechterhaltung der Schaltung, sondern ermöglicht räumliche Ausrichtung der Kathode.
  3. Transfer identifizierten Scheiben (bis zu fünf pro Kultureinsatz) auf Kultureinsatz mit 3 ml Pasteurpipette mit dem Schnitt Spitze. Separate und lassen Sie sie in einem sagitt auf Kultureinsatzes absetzenal Ausrichtung.
  4. Mit einer Pipette entfernen überschüssiges HBSS, so dass Scheiben sind in der Lösung nicht mehr gebadet.
  5. Verwendung einer P10-Pipettenspitze, einer Pipette DNA (bei einer Konzentration von 1 ug / ul) mit 20% Fast Green über die Oberfläche der Zielregion einer Scheibe verdünnt. 20% schnell grün sorgt für viskose DNA-Lösung und verhindert, dass übermäßig breite Streuung der DNA. In etwa 5 & mgr; l DNA / schnell grün Lösung für jede Scheibe (2B).
  6. Legen Sie die Kathode über gewünschte Zielgewebe und elektroporieren mit 3 x 10 V, 10 ms Dauer Impulse. Vermeiden Sie direkten Kontakt der Kathode mit dem Gewebe. Stattdessen profitieren Sie von der Oberflächenspannung der Flüssigkeit, um Leitfähigkeit zu halten (platzieren Sie die Kathode so nah an das Gewebe wie möglich, ohne zu berühren das Gewebe).
  7. Wiederholen DNA Lieferung und Elektroporation, um mehrere Regionen der EGL auf jedem einzelnen Kleinhirn Scheibe nach Wunsch.
  8. Nach Abschluss der Elektroporation, Transfer Kultur insert bis 30 mm Petrischale.
  9. Zu jeder Kultur, 1 ml der vorgewärmten Kulturmedium (Basal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - Glucose, 1% B27 ergänzen, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) unter dem Kultureinsatz, so dass die Kultureinsatzes in Kontakt mit dem Medium, aber Scheiben sind nicht in sie getaucht.
  10. Kulturen, die bei 37 ° C / 6% CO 2 inkubieren bis 3 Tage. Ersetzen Sie den gesamten Kulturmedium alle 24 Stunden mit frischem vorgewärmten Medium.
  11. Nach der Kultur, zu beheben Scheiben auf Kultureinsätze für 1 Stunde in 4% Paraformaldehyd (oder O / N bei 4 ° C) in einem frischen 30-mm-Schale ohne Kulturmedien.

4. Imaging von Kleinhirn-Slices

  1. Nach der Fixierung, Waschen Scheiben 3 mal 5 min in PBS.
  2. Mit einer Rasierklinge, sezieren jede Elektroporation und kultivierten zerebellären Scheibe aus dem Kultureinsatzes durch Schneiden um die Scheibe und das Entfernen der Scheibe und den Bereich der Einsatz es eingehalten wird. MachenVersuchen Sie nicht, Scheibe aus der Kultur Einsatzoberfläche zu entfernen.
  3. Berg Scheiben in etwa 1 ml Eindeckmedium enthält DAPI (falls gewünscht) unter einem Deckglas dabei nicht zu Blasen einzuführen und Bild mit Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie.
    Anmerkung: Bildparameter können gemß den Konstrukten elektroporiert variiert werden und liegt im Ermessen des jeweiligen Benutzers.

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Representative Results

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele von Ergebnissen, die unter Verwendung von Scheiben Elektroporation und die Kultur des Kleinhirns aus embryonalen Tag 14 Küken gewonnen werden können. Die Präparation des Kleinhirns ist in Abbildung 1 veranschaulicht und die Elektroporationskammer einzurichten ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir zeigen, dass es möglich ist, Kultur Kleinhirnschnitten, die ihre Struktur und Zellmorphologie in vitro (3A) zu behalten elektroporieren und erfolgreich. Gezielte Elektroporation einzelner folia leicht erreicht wird (3B). Wir eine Anzahl von unterschiedlichen Plasmiden erfolgreich Elektroporation in die EGL Zellen und zeigen, dass es möglich ist, i) um Zellen zu markieren mit Reporterkonstrukten, ihr Verhalten (3C beobachten), ii), um mögliche genomische Regionen Funktionalität in Kleinhirnzellen zu testen (Figur 3D ) und iii), um die genetisch manipuliertZellen in der EGL durch misexpressing Proteine ​​von Interesse (3E). Zusätzlich werden pharmakologischen Manipulationen elektroporiert Scheiben möglich ist (Ergebnisse nicht gezeigt). Nach Kultivierung ist es möglich, zusätzliche Gewebeanalyse wie Immunhistochemie oder Proliferationsassays (Abbildung 3F) durchzuführen. Wir führen Gewebegesundheit Analyse Calbindin und PH3 Immunfärbung und zeigen, dass die Gewebeintegrität wird für mindestens 3 div nach der Kultur (4) gehalten wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass die EGL ist jetzt eine zugängliche und leicht manipuliert Struktur, die vollständig untersucht werden können und genetisch in der Küken Modellsystem verändert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Dissection des Kleinhirns von E14 Hühnerembryonen. (A) Enthaupten das Küken im Ei und entfernen Sie den Kopf intoa Petrischale mit eiskaltem PBS. Entfernen Sie den Unterkiefer und die Augen, indem Schnitt hinter der Augen und des Rachens (gestrichelte Linie). (B) Entfernen Sie die Haut von der Oberfläche des Schädels. (C) Entfernen Sie den frontalen und parietalen Knochen und (D) entfernen, das Gehirn aus dem Mesenchym und Knorpel umgibt. (E) unter einem Präpariermikroskop ermitteln die Lage des Kleinhirns am hinteren Ende des Gehirns. Zwischen der Mittelhirn und Rautenhirn (gestrichelte Linien) zu schneiden, um mit dem Kleinhirn und Rautenhirn ventralen gelassen werden. (F) Stellen Einschnitte an den Seitengängen (Stielen) des Kleinhirns, das Kleinhirn aus dem Hinterhirn (gestrichelte Linie) zu trennen. (G) Entfernen Sie die Adergeflecht (Sternchen) aus der Bauchseite des Kleinhirns, bis Sie mit einer ganzen intakten Kleinhirn mit der pia befestigt gelassen werden. Übertragen Sie das Kleinhirn in eiskaltes HBSS vor der Zubereitung von Scheiben mit einem Gewebe choppäh. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Die Elektroporationskammer einzurichten. (A) Ein Bild von der maßgeschneiderten Elektroporationskammer. Die Kammer besteht aus einer Anode einer Elektroporator sicher auf dem Boden einer 60 mm Petrischale gelegt. Die Schale enthält etwa 1 ml HBSS, um die Elektrode abzudecken. Das Kultureinsatz ist auf der Elektrode mit konstanter Kontakt zwischen dem Einsatz und dem Elektroden ruhen, die Aufrechterhaltung der Schaltung, aber ermöglicht räumliche Ausrichtung der Kathode, die von Hand betätigt wird. (B) Ein Bild von Scheiben, die Elektroporation. Scheiben werden mit der DNA / schnelle grüne Lösung abgedeckt. Die Scheiben werden als Wunsch elektroporiertd: Elektroporation kann auf eine folium oder mehrere Standorte ausgerichtet sein. Nach der Elektroporation der Einsatz in einem 30 mm-Petrischale mit vorgewärmtem Kulturmedium überführt und in den Inkubator gestellt. 1. Die Anode 2. Die Kathode 3. Kultureinsatzes 4. Petrischale mit 1 ml HBSS 5. Binokular 6. Einzelscheiben aus Gewebe Chopper 7. DNA-Lösung mit schnellen grünen Farbstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.

Figur 3
Figur 3. Repräsentative Ergebnisse. (A) geringer Vergrößerung Bild eines Steuer Elektroporation eines RFP kodierenden Plasmid in die EGL an mehreren Standorten. Das Gewebe behält seine Struktur und elektroporierten Zellen sind eindeutig in einer dicken subpialen Schicht des Kleinhirns sichtbar. (B) einBeispiel für eine gezielte Elektroporation mit einem Steuer GFP-Plasmid. Die gezielte folium wird durch ein Sternchen angezeigt. Maßstabsleiste AB = 500 & mgr; m. (C) Ein Beispiel, wo ein Konstrukt kodiert GFP durch eine Atoh1 Enhancer angetrieben in die EGL elektroporiert worden. Die Expression von Atoh1 definiert Körnerzellvorstufen innerhalb der EGL. Verschiedene Zellmorphologien sind deutlich in 3 div sichtbar und das Verhalten der Zelle überwacht werden. (D) ein Beispiel für die Kennzeichnung nach der Elektroporation von einem Konstrukt, das für eine putative konservierten nicht Codierelement (CNE) des NeuroD1 Gen Antriebs GFP. Die CNE meldet Aktivität in den Zellen auf endogene NeuroD1 Expressions was auf eine aktive Rolle der CNE in Entwicklung erwartet. NeuroD1 Expression korreliert mit der Einleitung Körnerzelldifferenzierung. (E) Ein Beispiel, wo das Gewebe genetisch durch Fehlexpression NeuroD1 Protein und einer Änderung der Körnerzell Behav manipuliereniour beobachtet werden kann. (F) Ein Beispiel, wo das elektroporierte Gewebe (Kontrolle GFP-Plasmid) fixiert und für Marker von proliferierenden Zellen, wie phosphohistone H3 (PH3) gefärbt werden. Maßstabsleiste CF = 50 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Gewebeintegrität und Proliferation in der Kultur. (A - C) Calbindin-Färbung von E14 Kleinhirngewebe mit einem Steuer GFP Plasmid elektroporiert an 1-3 Tagen in vitro (div). Calbindin-Färbung zeigt, dass die Gewebeintegrität wird in der Kultur für mindestens 3 div gehalten. Die Purkinjezellschicht nicht eine Monoschicht auf dieser Stufe in chick Entwicklung zu bilden, aber es ist deutlich zu erkennen, das Bilden einer Schicht unterhalb derEGL, wo Körnerzellen (grün) befinden. (D) Phosphohistone H3 (PH3) Flecken auf Kleinhirngewebe für 2 div kultiviert. PH3 Färbung ist in den EGL (Pfeile) sichtbar, aber auch bei anderen Kleinhirnregionen (Pfeilspitzen). Diese Färbung ist repräsentativ für alle Stufen in Kultur untersucht (1-3 div). Maßstabsleiste AD = 50 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das Protokoll hier berichteten beschreibt ein Verfahren zum Präparieren, Elektroporation und Kultivieren Scheiben embryonalen Tag 14 Kleinhirn von der Küken. Dieses Protokoll ermöglicht Targeting der Elektroporation zur kleinen Brenn Regionen der EGL, einschließlich isolierten Ausrichtung der einzelnen Kleinhirnlappen. Es ermöglicht die genetische Analyse und Bildgebung mit einer hohen Auflösung und Bequemlichkeit, und zu geringen Kosten im Vergleich zu etablierten Techniken in Nagetieren 43-47. Eine solche Analyse ist in vivo nicht derzeit möglich aufgrund der Verlängerung der Entwicklungszeitdauer der Mangel an EGL-spezifische genetische Targeting Möglichkeiten in der Maus, und die Allgemeinheit der molekularen Mechanismen zwischen dem rhombischen Lippe und der EGL, was bedeutet, dass Änderungen, die EGL beeinflussen können Biologie häufig nicht analysiert werden, da sie Auswirkungen auf Rautenlippe Neurogenese und hebt EGL Bildung 49. Unser System stellt somit einen wesentlichen Fortschritt im Hinblick auf die Ziel genetische Modifikation zur EGL specifically, und wir erwarten, wird es für andere Arten über das Küken sein, dass vielleicht der vergleichenden Interesse, wie nicht-Modell Säugetieren und Reptilien.

Bei der Durchführung der Schnittkultur Elektroporationstechnik, eine Reihe von technischen Überlegungen im Vordergrund stehen. Zum einen die Robustheit der Scheiben in der Kultur, ohne auf der einen Seite in umfangreichen Zelltod oder auf der anderen Seite verlieren die strukturelle Integrität zu überleben begrenzt die Dicke der Scheibe bis 300 um in unseren Händen. Ein zweiter wichtiger Punkt ist die Viskosität der DNA-Lösung, die Elektroporation von DNA in Konzentrationen, die hoch genug ist, um sichtbares oder entsprechenden Ebenen der genetischen Veränderung zu induzieren sicherstellt. In in ovo Elektroporation von DNA-Lösungen in den frühen embryonalen Hinterhirn injiziert Konzentrationen schnell grünen Farbstoff von ca. 1% sind typisch. Doch in unserem Protokoll, verwenden wir in der Regel Konzentrationen von Fast Green von 20%. Dies sorgt für eine ausreichend viscous DNA-Lösung, um die Dispergierung der DNA nach dem Pipettieren aber vor der Elektroporation zu verhindern, aber eine ausreichend verdünnte man effiziente elektrische Leitfähigkeit zu vermitteln.

Neben diesen technischen Überlegungen, beobachteten wir, dass proliferative Verhalten, das wir beobachten, ex vivo nicht gerade Spiel, die von In-vivo-Studien wahrscheinlich auf, die Pia-Integrität durch die Gewebepräparation gestört vorhergesagt. Unter solchen Bedingungen, wenn ein GFP-Expressionskonstrukt wird durch Elektroporation, ein großer Anteil der elektroporierten Zellen scheinen in den Zellzyklus nach nur einem Tag der Kultur gelassen, wie durch PH3 Färbung (Abbildung 3F) beurteilt. Das funktioniert nicht mit erwarteten EGL proliferative Verhalten, bei dem die Proliferation von Klonen in Maus und chick erstreckt sich über einen großen Zeitraum 27 korrelieren. Die Folgerung, die der pia moduliert Proliferation wird durch die Beobachtung gestützt, dass, wenn wir einen Reporter elektroporieren Baut mit einem NeuroD1 regulatorische Element zum Antreiben der Expression von GFP alle elektroporierten Zellen exprimieren GFP nach einem Tag in Kultur (Figur 3D). In vivo spiegelt dieses Konstrukt endogenen NeuroD1 Expression in Markierungszellen des Innen EGL, die post-mitotischen 36,37 sind, während in voller Länge NeuroD1 ist ausreichend, um die Zelldifferenzierung (3E) zu fahren. Dies legt nahe, dass unter bestimmten Bedingungen, die proliferative Fähigkeit von Zellen nicht beibehalten, wie er ist in der äußeren EGL an äquivalenten Stufen in vivo werden. PH3 Färbung weist jedoch darauf hin, dass es eine Menge der Proliferation in Kultur, oft zum EGL Bereich (4D) lokalisiert. Umfangreiche Verbreitung außerhalb der EGL zeigt an einer möglicherweise verstärkten Gliogenese oder Proliferation von Pax2 GABAerge Vorläufer in der weißen Substanz. Die Implikation ist, dass die Auslegung von jedem Versuchsdurchführung muss die Berücksichtigung der oben proliferativ nehmene Verhalten kann die Tatsache, dass Purkinje Zellen nicht eine Monoschicht bis E18 in chick und eine normale Entwicklung zu bilden, nachdem Schnittpräparat beeinträchtigt werden (beispielsweise aufgrund fehlender Wechselwirkung mit Kletter Fasern etc.)

Trotz dieser Einschränkungen stellt unser Protokoll ein wichtiger Schritt im Hinblick auf das Studium viele Aspekte der Granulat Zellbiologie. Der entscheidende Vorteil, dass räumlich und zeitlich spezifische Markierung der EGL im Unterschied zu dem Rautenlippe werden mehrere Prüfungen der sowohl in der Zellbiologie von Körnervorläuferzellen und die genetische Regulation zugrunde es in einer Weise, die derzeit nicht in vivo möglich ist, zu erleichtern. Unsere Technik in chick bestehende ex vivo Kultur und Elektroporationsprotokolle bei Nagern 43-48 ergänzen und trägt die erhebliche Vorteile bei Kosten und Bequemlichkeit, die mit Küken verbunden sind. Zusätzlich ist ein deutlicher Fortschritt gegenüber stellt siebestehenden Techniken der Kultivierung Körnervorläuferzellen 39. Während es eher als Ergänzung ersetzen die letztere, wird unser Protokoll, um eine Vielzahl von pharmazeutischen Behandlungen und der Vielfalt der Zell autonome genetische Manipulationen, die in der Küken sind möglich öffnen, die Kontrolle der Körnerneuronendifferenzierung. Es bietet eine Grundlage für die Prüfung Granulat Zellbiologie mit bisher unerreichter Genauigkeit.

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Acknowledgments

Die in diesem Artikel vorgestellte Methode entstand aus der Arbeit durch die BBSRC BB / finanziert I021507 / 1 (TB, RJTW) und eine MRC Doktor studentship (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Entwicklungsbiologie Heft 106 Kleinhirn Entwicklung Küken externen Körnerschicht Schnittkultur Körnerzellen Purkinje-Zellen die Elektroporation.
<em>Ex-vivo-Kultur</em> von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen
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Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

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