Introduction
Forståelse proteinstruktur på atomart niveau er nøglen til at afdække den molekylære basis for biologiske veje og sygdomme. X-ray proteinkrystallografi er den mest udbredte / anvendelig fremgangsmåde til bestemmelse af makromolekylære strukturer. Den største udfordring ved denne metode er at få tilstrækkelige mængder af korrekt foldet, rene protein. Dette bliver et problem især når der arbejdes med udskilte pattedyrproteiner, der undergår specifikke post-translationelle modifikationer.
Bakterielt udtrykte proteiner er den primære kilde til krystalliserede proteiner deponeret i Protein Data Bank 1. Bakterielle ekspressionssystemer er i høj grad foretrækkes, fordi de er hurtige, billige og typisk producere høje udbytter af protein. Men ekstracellulære domæner af pattedyrsproteiner udtrykt i bakterier er ofte ikke korrekt foldet, hvor der kræves tilfælde refoldnings- og omfattende oprensningstrin til opnåelse af homogent folded protein. Derudover er der mange pattedyrproteiner kræver posttranslationel glycosylering at opnå korrekt foldning 2. Selv om ekspression og glycosylering i gær- eller insektceller kan overvinde foldningen problem, adskiller posttranslationelle modifikationer, herunder glycosylering, væsentligt fra dem for pattedyrceller 3, hvilket gav proteiner med forkerte eller ikke-homogene modifikationer.
Mammale celler udtrykker alle de krævede molekylære maskineri for at sikre korrekte post-translationelle modifikationer og folde; imidlertid er disse ekspressionssystemer ikke typisk foretrækkes af de fleste laboratorier, på grund af begrænsede udbytter og høje omkostninger af reagenser og hjælpematerialer. Polyethylenimin (PEI), en standard transfektionsreagens er relativt billigt, men pålægger betydelig cytotoksicitet og lav transfektion effektivitet, hvilket resulterer i øgede omkostninger i celle medier, DNA og dyrkning udstyr. Mange alternativer til PEI er uoverkommeligt dyre. Vi fatdisse spørgsmål ved at beskrive en kombination af forbedrede cellekultur værktøjer og kemisk modificerede PEI for hurtig og relativt billig fremgangsmåde til ekspression af secernerede proteiner fra pattedyr, efterfulgt af et enkelt trin oprensning. Denne robuste metode giver tilstrækkelige udbytter for funktionelle og biokemiske studier 4, og i nogle tilfælde resulterer i protein modtagelig for krystallisation uden yderligere oprensning.
Denne protokol beskriver adskillige teknikker til at maksimere ekspression og udbytte for secernerede pattedyrprotein i humane embryonale nyre (HEK) 293F celler dyrket i suspension. Transfektion effektivitet (og omkostninger), protein produktion og rensning er alle stærkt forbedret ved at følge denne protokol. PEI modificeret ved tilsætning af carbamater gennem et enkelt trin ringåbnende reaktion (PEI-TMC-25, syntese og egenskaber er beskrevet i detaljer i ref 5) i høj grad forbedrer transfektionseffektiviteten, reducerer cytotoksicitet fra kationiskemembran forstyrrelser og derfor reducerer eksperiment omkostninger. Desuden er cellelevedygtighed og proteinekspression stærkt forbedret ved tilsætning af kultur kosttilskud til at levere glucose og vitaminer. Vigtigere til produktion af glycosylerede proteiner, behandling med kifunensine, en ikke-toksisk kemisk inhibitor af mannosidase I, producerer proteiner med definerede, umodne glycaner, som kan fjernes ved endoglycosidase EndoHf til opnåelse af proteiner med et enkelt N-acetylglucosamin i stedet for en fuld-længde N-forbundet glycan 6. Endelig sekretionen af proteiner i et serumfrit, kemisk defineret medium tillader hurtig og let oprensning for strukturelle og biokemiske undersøgelser. Enkelt trin nikkel-nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) harpiks rensning fjerner størstedelen af kontaminerende arter i supernatanten, og i nogle tilfælde kan give protein af tilstrækkelig renhed til krystallisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion af Milligram Mængder af plasmid-DNA for Storstilet Forbigående transfektion
- Klon proteinet af interesse i en højt kopital mammal ekspressionsvektor under anvendelse restriktionssted kloning eller anden egnet teknik.
- For at opnå optimale resultater ved at bruge pHLsec 7 vektor, som har en indbygget C-terminale 6His-tag, en stærk promotor Kozak-sekvens og en optimeret sekretion signal.
- Omdan plasmidet på kompetente celler.
- Tilføj 20 pi kompetente E. coli-celler på 1 ug plasmid-DNA og inkuberes på is i 30 minutter.
- Varmechok celler ved 42 ° C i 35 sek, derefter inkuberes på is i 2 min.
- Der tilsættes 300 pi mikrobiel vækstmedium (SOC) og inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter, omrystning ved 220 rpm.
- Plate celler på agarplade med passende antibiotisk selektion.
- Brug 100 ug / ml carbenicillin, hvis plasmidet er i pHLsec vektor.
- Kultur kolonier i 250 ml Luria Broth (LB) medium suppleret med 100 ug / ml antibiotikum (carbenicillin) O / N ved 37 ° C, under omrystning ved 220 rpm.
- Oprensning af DNA fra kultur ved hjælp af Hi-Speed Plasmid Maxi Kit ifølge producentens protokol.
- Eluere DNA i puffer EB (10 mM Tris-CI, pH 8,5) i stedet for buffer TE.
- Alikvot det oprensede plasmid ved nødvendige beløb til transfektion og opbevares ved -20 ° C.
2. Storstilet Kultur og kortvarig transfektion af 293F Cells
- Supplement 1 L 293F medier med 10 ml glutamin og 5 ml Pen / Strep (begge 100x). Opbevares ved 4 ° C. 5 ml Pen / Strep er en tilstrækkelig styrke i serumfrie betingelser og den reducerede antibiotisk koncentration forbedrer cellelevedygtighed under transfektion, hvilket forbedrer proteinudbytter.
- Kultur 293F celler i 300 ml medier i 1 L polycarbonat forbløffet Erlenmeyerkolber med ventileret hættes ved 37 ° C med 8% CO2, under omrystning i et standard vævskultur inkubator.
- Fortynd celler til 5 x 10 5 / ml densitet én dag før transfektion.
- På dagen for transfektion, supplere dyrkningsmediet ved tilsætning af 10% volumen 2% w / v Cell Boost i 293F medier.
- Mål glucosekoncentration ved anvendelse af en glukosemonitor ifølge producentens instruktioner, og brug kosttilskud for at opnå en glucosekoncentration på 500 mg / dl.
- Tilføj kifunensine (1 ug / ml slutkoncentration) ved dette trin for at kontrollere proteinglycosylering.
- Beregn mængden af DNA, der kræves for 1 ug plasmid per 1 x 10 6 celler. Under sterile betingelser, fortyndet DNA i 5 ml serum-frit medium.
- Beregn mængden af transfektionsreagens kræves til 1 ug plasmid pr 2 pi transfektionsreagens. Under sterile betingelser, fortyndes transfektionsreagens (PEI-TMC-25) i 5 ml serum-frit medium.
- Tilføjetransfektionsreagens i DNA-opløsning i 1 ml intervaller, blanding forsigtigt. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur for reagens-DNA-komplekser til at danne. Derefter tilsættes opløsningen på cellerne i en drop-wise fashion.
- Tillad transficerede celler til at udtrykke protein til 72-96 timer. Supplement med ~ 10% volumen Cell Boost Media dagligt, eller efter behov for at holde glukose læsning 400-600 mg / dl.
3. Oprensning
- Dekanter kulturen i en centrifuge kolbe centrifugeres i 20 minutter ved 1.300 xg for at pelletere cellerne og derefter indsamle supernatanten. Hvis det er nødvendigt, spin en anden gang og / eller bruge 0,22 um filter for at præcisere supernatant.
- Tilsæt 10% vol 10x Ni-NTA bindingspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol).
- Der fremstilles en grovhed kolonne ved tilsætning af 2 ml Ni-NTA opslæmning i en kolonne og ækvilibrering med 10 søjlevolumener (CV) på 1 x bindingsbuffer. Hvis det er muligt, gøre alle kolonne trin i en 4 ° C værelse. AlternativEly, chill protein og alle buffere på is før kolonne skridt, og holde protein og indsamlet gennemstrømning på is.
Bemærk: Ni-NTA opslæmning er 50% harpiks i volumen og fremstilling erklærede bindingskapacitet er 50 mg / ml. Ni-NTA perler kan genoplades til flere anvendelser - Flow supernatanten over harpiksen og indsamle gennemstrømning. Gentag dette trin.
- Vask med 10 CV vaskebuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazol, pH 8).
- Eluering af protein i 5 CV elueringsbuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazol pH 8).
- Hvis deglycosylering er nødvendig:
- For et slutvolumen på 0,5 ml koncentrat eluat på 0,43 ml ved anvendelse af en centrifugering koncentrator. Hvis udfældes form pelletere eventuelle rester ved centrifugering ved 16.000 xg og 4 ° C.
- Der tilsættes 50 pi 500 mM Na-citrat, pH 5,5.
- Tilsæt 20 pi EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer.
Ikkee: Enzymet virker optimalt ved 37 ° C, hvilket kan forårsage den koncentrerede protein til at aggregere. Forlæng RT inkubation hvis deglykosylering, vurderet ved SDS-PAGE eller immunblotting, er ufuldstændig. Enzymet har ikke aktivitet ved 4 ° C. - For at fjerne EndoHf: Wash amyloseresin 3x i phosphatpufret saltvand (PBS) eller endelig oplagring buffer. Inkuber protein med harpiks i 1 time ved 4 ° C. Spin 5 min ved 1.000 xg til pelletering perler og indsamle supernatanten.
- Koncentrer protein under anvendelse af passende molekylvægt cutoff centrifugering filter og bufferudskiftning i opbevaringspuffer (150 mM NaCl og 20 mM HEPES pH 7,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Heri følger resultaterne af denne ekspressionssystem anvendes på et udskilt 13 kDa immunoglobulin (Ig) domæne fra det humane protein udløser receptor udtrykt på myeloide celler 2 (hTREM2, rester 19-132). TREM2 er et type I transmembrant protein indeholdende en enkelt ekstracellulært Ig-domæne, der har to disulfidbindinger og to N-bundne glycosyleringssteder. I modsætning til mange andre Ig-domæne proteiner 8, TREM2 ikke var egnede til genfoldning fra bakterielle inklusionslegemer 9. Der kræves efterfølgende mutagenese bekræftet N-forbundne glycaner for korrekt ekspression og foldning. For at lette strukturelle og funktionelle undersøgelser blev TREM2 indført i pHLsec vektor med en C-terminal 6His-tag 7 ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker. Forbigående ekspression i HEK293F celler behandlet med kifunensine viste protein, der blev oprenset ved Ni-NTA-kromatografi (figur 1B, bane 2), og prøven blev derefter deglycosyleret at producere Natiholdsvis foldet, homogen protein (figur 1B, bane 3). 293F ekspression af TREM2 produceret 5-10 mg / L (5-10μg / mio transficerede celler). Efter buffer udveksling i opbevaringsbufferen, var dette protein krystalliseret (figur 1C). På trods af den endelige renhed på ca. 80%, disse krystaller pålideligt reproduceres, diffrakterede og blev vist ved sølv-pletten kun indeholder TREM2 protein (figur 1D). Denne iagttagelse antyder den biokemiske homogenitet af proteinet (dvs. foldning og post-translationelle modifikationer) kan i nogle tilfælde være mere kritisk end den samlede renhed til krystallisation succes.
Ud over krystallisering dette system tilbyder en robust værktøj til strukturelle og funktionelle studier. Det udnyttes til at producere indbygget glycosyleret protein og opnå> 95% renhed ved gelpermeationskromatografi (figur 1E, F). Denne yderligere rensningstrin, som viser opklaringn opførsel af proteinet, er også en ideel måde at overvåge protein kvalitet. Det oprensede protein skal elueres ved et volumen svarende til dens molekylvægt og bør være den mest udbredte arter i prøven. Unormalt store mængder af aggregeret protein kan indikere ustabilt protein og give et fingerpeg at optimere proteinproduktion og oprensning. Desuden er denne endelige oprensede protein er overlegen til anvendelse i kvantitative biofysiske eksperimenter såsom cirkulær dikroisme-spektroskopi, termisk stabilitet og efterforskningen protein-ligand-interaktioner. Endelig kontrollerer omfanget af glycosylering giver en robust værktøj til at studere glycan-afhængige funktioner.
Figur 1. pattedyrsekspressionssystem: (A) Ordning for mammal ekspression af proteiner med kontrolleret eller nativ glycosylering i HEK 293F celler. ( B) SDS-PAGE af NiNTA-oprenset hTREM2 udtrykt under kifunensine vist før (bane 2) og efter (bane 3) deglycosylering med EndoHf. (C) Krystaller fremstillet af NiNTA-renset og deglycosylerede protein. (D) Sølvfarvning krystalvand indgang (bane 1) og høstet krystaller (bane 2 og 3) viser krystaller kun indeholde TREM2. (E) yderligere oprensning af TREM2 blev opnået under anvendelse gelpermeationskromatografi af NiNTA-oprenset TREM2 produceret i 293F celler uden Kifunensine. Stjerner (*) angiver elueringsvolumener af molekylvægtstandarder. Proteiner elueret i TBS anvendelse af en analytisk kolonne S200 (GE). (F) SDS-PAGE-analyse af størrelseseksklusion-oprenset TREM2: input protein (bane 2) og foldet peak (bane 3). Bemærk hvor fuld, heterogene glycaner kører ved en højere tilsyneladende molekylvægt med en bred smear ved SDS-PAGE.nk "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK 293F celler tilbyder robust produktion af proteiner, der kræver post-translationelle modifikationer. Dette system muliggør en hurtig og skalerbar ekspression af nativt foldede proteiner indeholdende disulfider, glycosylering og phosphorylering, som ellers ville være fraværende ved hjælp af flere rutinemæssige udtryk værktøjer. Desuden kan dette system anvendes til ekspression og oprensning af multi-proteinkomplekser blot ved co-transfektion af flere plasmider. Udover TREM2, er dette system blevet flittigt brugt til funktionelle studier med andre proteiner af interesse i laboratoriet 10,11. Mammale celler tilbyder også endotoxinfrit proteinekspression optimal til in vivo forsøg, eller til fremstilling af nativt foldede antigener til at generere konformationsafhængige antistoffer.
Optimale levedygtighed og transfektion celle betingelser er de mest afgørende for effektiv proteinproduktion. For bedre cellelevedygtighed, er lav passage cellekulturer boostetmed cellekultur kosttilskud og antibiotikum koncentration i vækstmedierne reduceres. Den modificerede PEI-TMC-25 har passende transection effektivitet med de fleste proteiner; Men der er andre muligheder til rådighed på moderat pris, der tilbyder øget transfektion effektivitet og reduceret cytotoksicitet. Hype 5 (Oz Bioscience) øger udbyttet sammenlignet med PEI eller andre reagenser, på et betydeligt lavere pris sammenlignet med dyrere transfektionsreagenser, såsom 293fectin. Reagenset type og DNA: reagens forhold kan optimeres for individuelle udtryk og behov den ønskede eksperiment.
Den her beskrevne fremgangsmåde har flere fordele frem for andre metoder til proteinproduktion. Pattedyrceller tilbyder native chaperone foldning og post-translationelle modifikationer utilgængelige for bakterier og gær. Den kortere tid til plasmidkonstruktion og forberedelse, langs anvendelse af medier, pH, som direkte kan modificeres, gør det bedre baculoviros-baserede produktion i insektceller; og endelig serumfrie medier tilbyder facile skalering (højere celletæthed) og rensning ikke kan nås til adhærente 293T-celler. Den største begrænsning ved dette system er kun tid og skalere den enkelte forsker er i stand til at forpligte sig til proteinekspression.
Inkluderet nedenfor er fejlfinding muligheder for de mest almindelige problemer stødt.
Fejlfinding
Hvis der er lavt proteinekspression, undgå passage 293F celler længere end 2-3 måneder. Langvarig overførselsteknikker resulterer i nedsat cellesundhed afspejles i langsommere fordoblingstider og væsentligt reduceret proteinekspression. Bør overvåges cellevækst dagligt og kulturer ikke længere fordobling dagligt skal kasseres. Cellelevedygtighed kan forbedres ved hjælp af kultur kosttilskud, mens passage celler. Overvåge glucose for at sikre en koncentration på 400-600 mg kultur / dl Celletæthed bør ikke overstige 2 millioner / ml ogcellelevedygtighed bør være ≥98% ved trypan-blå-udelukkelse. Fortynd tætte celler til 0,5 mio / ml og gør det muligt at fordoble O / N før transfektion. Optimer transfektion under anvendelse af forskellige forhold mellem transfektionsreagens: DNA (inden for intervallet 1 ug DNA: 1,5-6 ul reagens). Dette kan gøres ved hjælp 2 ml kulturer i en 6-brønds plade og output målt ved immunblotting. Doing 12 HR tidspunkter kan indikere, om proteinet udtrykkes og nedbrydes hurtigt; kontrollere cellelysatet hvis proteinet ikke er observeret i supernatantfraktionen. Fejlfoldede proteiner, som ikke skal udskilles, stadig vil være synlige i cellelysatet ved immunoblotting.
Hvis Ni-NTA fastholdelse er lav, dvs stadig protein i gennemstrømning efter kolonne binding, bruge frisk harpiks. Stigende pH i prøven til 8,5 vil resultere i en stærkere binding til harpiksen, selv om dette også vil øge ikke-specifik binding. Koncentrering af prøven og batch binding til harpiksen O / N ved 4 ° C værederfor Ni-NTA rensning kan resultere i ~ 5x forøgelse udvundet protein. Hvis 6His-tag er utilgængelige på grund af tertiære struktur af proteinet, prøv kloning det på den anden ende. Alternativt kan du bruge Cobalt harpiks, som har en højere affinitet for hans rester.
Hvis proteinaggregater og / eller præcipiterer under oprensning, forøge opløseligheden ved tilsætning af 10% glycerol i Ni-NTA vaske og elueringsbuffere. Kør nikkel affinitetssøjler ved stuetemperatur i stedet for 4 ° C. Brug differential scanning fluorimetri 12 til at screene for pH og salt / tilsætningsstoffer, der øger stabiliteten af proteinet i opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
