Introduction
La comprensión de la estructura de proteínas a nivel atómico es clave para descubrir las bases moleculares de las vías biológicas y enfermedades. Cristalografía de rayos X de proteínas es más utilizado el método / aplicable para la determinación de estructuras macromoleculares. El principal reto de este método es la obtención de cantidades suficientes de correctamente plegada, proteína pura. Esto se convierte en un problema particular cuando se trabaja con proteínas de mamífero secretada, que experimentan modificaciones post-traduccionales específicas.
Las proteínas expresadas en bacterias son la principal fuente de proteínas cristalizadas depositadas en el Protein Data Bank 1. Sistemas de expresión bacterianos se prefieren en gran parte porque son rápidos, de bajo costo y típicamente producen altos rendimientos de proteína. Sin embargo, los dominios extracelulares de proteínas de mamífero expresadas en bacterias a menudo no están correctamente plegadas, en la que se requieren pasos caso de replegamiento y purificación extensa para obtener homogéneamente foproteína LDED. Además, muchas proteínas de mamíferos requieren glicosilación postraduccional para lograr plegamiento apropiado 2. Aunque la expresión y la glicosilación en células de levadura o de insectos pueden superar el problema de plegado, modificaciones post-traduccionales, incluyendo glicosilación, difieren significativamente de los de células de mamífero 3, produciendo proteínas con modificaciones incorrectas o no homogéneos.
Las células de mamíferos expresan toda la maquinaria molecular necesaria para garantizar modificaciones post-traduccionales adecuadas y plegado; sin embargo, estos sistemas de expresión no son típicamente preferidas por la mayoría de los laboratorios, debido a los rendimientos limitados y altos costos de reactivos y consumibles. Polietilenimina (PEI), un reactivo de transfección estándar es relativamente barato, pero impone considerable la citotoxicidad y la baja eficiencia de la transfección, lo que resulta en aumento de los costos en los medios de comunicación celular, el ADN, y el equipo de cultivo. Muchas alternativas a PEI son prohibitivamente caros. Abordamosestos problemas mediante la descripción de una combinación de herramientas mejoradas de cultivo de células y químicamente modificado PEI para el método rápido y relativamente barato para la expresión de proteínas de mamíferos secretadas, seguido de purificación de un solo paso. Este método robusto da rendimientos suficientes para estudios funcionales y bioquímicos 4, y en algunos casos, da lugar a la proteína susceptible a la cristalización sin purificación adicional.
Este protocolo describe varias técnicas para maximizar la expresión y el rendimiento de las proteínas de mamíferos secretadas en el riñón embrionario humano (HEK) 293F células cultivadas en suspensión. La eficacia de transfección (y costo), la producción y purificación de proteínas están enormemente mejorado siguiendo este protocolo. PEI modificado por la adición de carbamatos a través de una reacción de apertura de anillo de un solo paso (PEI-TMC-25, síntesis y propiedades se describe en detalle en la ref 5) mejora en gran medida la eficiencia de transfección, reduce la citotoxicidad de catiónicodisrupción de la membrana y por consiguiente reduce los costes de experimentación. Por otra parte, la viabilidad celular y la expresión de proteínas se mejoran en gran medida con la adición de suplementos de cultivo para el suministro de glucosa y vitaminas. Es importante destacar que para la producción de proteínas glicosiladas, el tratamiento con kifunensine, un inhibidor químico no tóxico de manosidasa I, produce proteínas con definidos, glicanos inmaduras, que pueden ser eliminados por el EndoHf endoglicosidasa para producir proteínas con un solo N-acetilglucosamina en lugar de un álbum de glicanos 6 N-ligado. Finalmente, la secreción de proteínas en un, medio químicamente definido libre de suero permite la purificación rápida y fácil para estudios estructurales y bioquímicos. Níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) de purificación de resina Single-step elimina la mayoría de las especies contaminantes en el sobrenadante y, en algunos casos, puede producir la proteína de pureza suficiente para la cristalización.
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Protocol
1. Producción de cantidades de miligramos de ADN de plásmido para la transfección transitoria a gran escala
- Clonar la proteína de interés en un vector de expresión mamífero número elevado de copias usando la clonación sitio de restricción, u otra técnica apropiada.
- Para obtener resultados óptimos, utilice pHLsec 7 vector, que tiene incorporado un C-terminal 6His-tag, una fuerte secuencia Kozak promotor y una señal de secreción optimizado.
- Transformar el plásmido en las células competentes.
- Añadir 20 l de células competentes de E. coli en 1 g de ADN plásmido y se incuba en hielo durante 30 min.
- Células choque térmico a 42 ° C durante 35 seg, y luego incubar en hielo durante 2 min.
- Añadir 300 l de medio de crecimiento microbiano (SOC) y se incuba a 37 ° C durante 45 minutos, agitando a 220 rpm.
- Células de la placa en la placa de agar con la selección de antibiótico apropiado.
- Utilice 100 mg / ml de carbenicilina si el plásmido se encuentra en el vector pHLsec.
- Colonias Cultura en 250 ml de caldo Luria (LB) los medios suplementados con 100 g / ml a los antibióticos (carbenicilina) O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm.
- Purificar el ADN de cultivo utilizando el kit de alta velocidad plásmido Maxi según el protocolo del fabricante.
- Eluir el ADN en tampón EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), en lugar de tampón TE.
- Alícuota del plásmido purificado en cantidad necesaria para la transfección y se almacena a -20 ° C.
2. A gran escala cultura y transfección transitoria de células 293F
- Suplemento medios 1 L 293F con 10 ml de glutamina y 5 ml Pen / Strep (tanto 100x). Almacenar a 4 ° C. 5 ml Pen / Strep es una resistencia suficiente en condiciones libres de suero y la concentración del antibiótico reducido mejora la viabilidad de las células durante la transfección, lo que mejora los rendimientos de proteína.
- Cultura células 293F en 300 ml de medio en 1 L de policarbonato desconcertados matraces Erlenmeyer con tapón de ventilacións a 37 ° C con 8% de CO 2, mientras se agitaba en una incubadora de cultivo de tejidos estándar.
- Diluir las células a 5 x 10 5 / ml de densidad un día antes de la transfección.
- En el día de la transfección, el medio de cultivo mediante la adición de suplemento de volumen de 10% de 2% w / v Cell Boost en medios 293F.
- Medir la concentración de glucosa utilizando un monitor de glucosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y suplementos uso cuando sea necesario para lograr una concentración de glucosa de 500 mg / dL.
- Añadir kifunensine (/ ml de concentración final 1 g) en este paso para controlar la glicosilación de proteínas.
- Calcular el volumen de ADN plásmido requerido para 1 g por 1 x 10 6 células. En condiciones estériles, diluir ADN en medio libre de suero 5 ml.
- Calcular el volumen de reactivo de transfección requeridos para el plásmido 1 g por 2 l de reactivo de transfección. En condiciones estériles, diluir reactivo de transfección (PEI-TMC-25) en medio libre de suero de 5 ml.
- Añadirreactivo de transfección de ADN en solución en incrementos de 1 ml, mezclando suavemente. Incubar durante 30 min a TA para los complejos de ADN-reactivo para formar. A continuación, añadir la solución sobre las células de una manera gota a gota.
- Permitir que las células transfectadas para expresar la proteína de 72 a 96 h. Suplemento con ~ 10% del alza del volumen celular Medios diarias, o si es necesario para mantener la glucosa en la lectura de 400 a 600 mg / dl.
3. Purificación
- Decantar la cultura en un matraz de centrífuga, centrifugar durante 20 min a 1.300 xg para sedimentar las células y luego recoger el sobrenadante. Si es necesario, girar un segundo tiempo y / o utilizar filtro de 0,22 micras para aclarar sobrenadante.
- Añadir tampón de unión 10% volumen 10x Ni-NTA (M NaCl 1,5, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol).
- Preparar una columna de gravedad mediante la adición de 2 ml de Ni-NTA suspensión en una columna y equilibrar con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de unión 1X. Si es posible, hacer todos los pasos de columna en una habitación de 4 ° C. Alternatively, proteína de frialdad y todos los tampones en hielo antes de la etapa de columna y mantener proteínas y recogida de flujo continuo en el hielo.
Nota: Ni-NTA suspensión es la resina de 50% en volumen y capacidad de unión declarado de la fabricación es 50 mg / ml. Perlas de Ni-NTA pueden ser re-cargadas para múltiples usos - El flujo del sobrenadante sobre la resina y recoger flujo a través. Repita este paso.
- Lavar con 10 CV de tampón de lavado (NaCl 300 mM, 50 mM de K 2 HPO 4, 20 mM imidazol pH 8).
- Eluir la proteína en 5 CV de tampón de elución (NaCl 300 mM, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM de imidazol pH 8).
- Si se requiere desglicosilación:
- Para un volumen final de 0,5 ml, eluido concentrado a 0,43 ml usando un concentrador de centrifugación. Si se forman precipitados, sedimentar los residuos por centrifugación a 16.000 xg y 4 ° C.
- Añadir 50 l de 500 mM Na-citrato de pH 5,5.
- Añadir 20 l de EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incubar a temperatura ambiente durante 2 hr.
Noe: La enzima funciona de manera óptima a 37 ° C, lo que puede causar que la proteína concentrada a agregarse. Extender la incubación RT, si desglicosilación, evaluada por SDS-PAGE o inmunotransferencia, es incompleta. La enzima no tiene actividad a 4 ° C. - Para eliminar EndoHf: Wash amilosa Resina 3x en tampón fosfato salino (PBS) o tampón de almacenamiento final. Incubar proteína con resina durante 1 hora a 4 ° C. Girar 5 min a 1000 xg para sedimentar los granos y recoger el sobrenadante.
- Concentrado de proteína usando el filtro molecular apropiado centrifugación corte de peso y intercambio de tampón en tampón de almacenamiento (NaCl 150 mM y HEPES 20 mM pH 7,5).
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Representative Results
Aquí sigue los resultados de este sistema de expresión se aplica a un dominio de inmunoglobulina secretada 13 kDa (Ig) de la proteína de activación de receptor humano expresado en las células mieloides (2 hTREM2, residuos 19-132). TREM2 es una proteína transmembrana de tipo I que contiene un único dominio de Ig extracelular que tiene dos enlaces disulfuro y dos sitios de glicosilación unidos a N. A diferencia de muchas otras proteínas de dominio Ig 8, TREM2 no era susceptible de replegado de cuerpos de inclusión bacterianos 9. Se requieren de mutagénesis posteriores confirmaron glicanos ligados a N para la expresión y el plegamiento apropiado. Para facilitar los estudios estructurales y funcionales, TREM2 se introdujo en el vector pHLsec con un 6His-tag C-terminal 7 utilizando técnicas estándar de biología molecular. La expresión transitoria en células HEK293F tratados con kifunensine produjo proteína que se purificó por cromatografía de Ni-NTA (Figura 1B, carril 2) y después la muestra se desglicosilado para producir Natively plegada, la proteína homogénea (Figura 1B, carril 3). 293F expresión de TREM2 produjo 5-10 mg / L (5-10μg / millones de células transfectadas). Después de intercambio de tampón en el tampón de almacenamiento, esta proteína se cristalizó (Figura 1C). A pesar de la pureza final de aproximadamente 80%, estos cristales reproducen de forma fiable, difractada, y se muestran por la plata-manchas para contener única proteína TREM2 (Figura 1D). Esta observación sugiere la homogeneidad bioquímica de la proteína (es decir, plegado y modificaciones post-traduccionales) pueden, en algunos casos, ser más crítica que la pureza global para el éxito de la cristalización.
Además de la cristalización, este sistema ofrece una herramienta robusta para estudios estructurales y funcionales. Se explota para producir la proteína nativa glicosilada y alcanzar> 95% de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño (Figura 1E, F). Esta etapa de purificación adicional, que muestra el solution comportamiento de la proteína, es también una forma ideal para monitorear la calidad de la proteína. La proteína purificada debe eluir a un volumen que corresponde a su peso molecular y debe ser la especie más abundante en la muestra. Anormalmente grandes cantidades de proteína agregada pueden indicar proteínas inestables y proporcionar pistas para optimizar la producción y purificación de proteínas. Además, esta proteína purificada final es superior para su uso en experimentos cuantitativos biofísicos tales como la espectroscopia de dicroísmo circular, estabilidad térmica, y la investigación de las interacciones proteína-ligando. Por último, el control de la extensión de la glicosilación proporciona una herramienta robusta para estudiar las funciones de glicano-dependiente.
Figura 1. Sistema de expresión en mamíferos: (A) Esquema para la expresión de las proteínas de mamíferos con glicosilación controlada o nativo en células HEK 293F. ( B) SDS-PAGE de purificado NiNTA hTREM2 expresa bajo kifunensine mostrado antes (carril 2) y después (carril 3) desglicosilación con EndoHf. (C) los cristales producidos a partir de proteína de NiNTA-purificada y deglicosilada. (D) tinción de plata de la entrada de la cristalización (carril 1) y cristales recogidos (carriles 2 y 3) revela cristales sólo contienen TREM2. (E) La purificación adicional de TREM2 se logró usando cromatografía de exclusión por tamaño de TREM2 purificado NiNTA producida en células 293F sin Kifunensine. Los asteriscos (*) indican volúmenes de elución de patrones de peso molecular. Las proteínas eluidas en TBS usando una columna S200 analítica (GE). (F) Análisis de SDS-PAGE de tamaño de exclusión purificado TREM2: proteína de entrada (carril 2) y el pico de doblado (carril 3). Nótese cómo, glicanos heterogéneas dirigidas a un peso molecular aparente más elevada con un amplio desprestigio por SDS-PAGE completa.nk "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Células HEK 293F ofrecen la producción de robusta de las proteínas que requieren modificaciones posteriores a la traducción. Este sistema permite la expresión rápida y escalable de las proteínas plegadas de forma nativa que contienen disulfuros, glicosilación, fosforilación y que de otra manera estaría ausente el uso de herramientas de expresión más rutinarias. Además, este sistema puede ser utilizado para la expresión y purificación de varios complejos de proteínas simplemente mediante la co-transfección de múltiples plásmidos. Además TREM2, este sistema se ha utilizado ampliamente para estudios funcionales con otras proteínas de interés en el laboratorio de 10,11. Las células de mamíferos también ofrecen proteína óptima expresión libre de endotoxinas para experimentos in vivo o para la producción de antígenos forma nativa plegada para generar anticuerpos dependientes de conformación.
Las condiciones óptimas de viabilidad celular y transfección son los más cruciales para la producción de proteínas eficiente. Para una mejor viabilidad celular, cultivos celulares de bajo pasaje se elevancon suplementos de cultivo celular y la concentración de antibióticos en el medio de crecimiento se reduce. El PEI-TMC-25 modificado tiene la eficiencia transección adecuado con la mayoría de las proteínas; Sin embargo, hay otras opciones disponibles a un precio moderado que ofrecen una mayor eficiencia de transfección y la reducción de la citotoxicidad. Bombo 5 (Oz Bioscience) aumenta los rendimientos en comparación con PEI u otros reactivos, a un costo reducido considerablemente en comparación con más caros reactivos de transfección, tales como 293fectin. El tipo de reactivo y el ADN: proporciones de reactivos se pueden optimizar para expresiones individuales y las necesidades del experimento deseado.
El método descrito aquí tiene varias ventajas sobre otros métodos de producción de proteínas. Las células de mamífero ofrecen plegado chaperona nativo y modificaciones post-traduccionales no disponibles para bacterias y levaduras. El tiempo reducido para la construcción del plásmido y la preparación, a lo largo de la utilización de medios de comunicación, el pH de que puede ser modificado directamente, hacen que sea superior a baculovirproducción basada en nosotros en células de insecto; y finalmente, el medio libre de suero ofrece escalado facile (mayor densidad celular) y la purificación no alcanzable a las células 293T adherentes. La principal limitación de este sistema es sólo el tiempo y escalar el investigador individual es capaz de comprometerse con la expresión de proteínas.
A continuación se incluyen las opciones de reparación para los problemas más comunes encontrados.
Solución de problemas
Si hay baja expresión de proteínas, evitar pases 293F células de más de 2-3 meses. Resultados pases prolongados en la salud celular disminuido reflejan en tiempos de duplicación más lentas y redujeron significativamente la expresión de proteínas. El crecimiento celular se debe supervisar a diario y las culturas ya no duplicar diaria debe ser desechada. La viabilidad celular se puede mejorar mediante el uso de suplementos de cultivo, mientras que pases las células. Control de la glucosa para asegurar una concentración cultura de 400-600 mg / dl densidad celular no debe superar los 2 millones / ml yla viabilidad celular debe ser ≥98% por exclusión de azul tripán. Diluir las células densas a 0,5 millones / ml y permitirá duplicar O / N antes de la transfección. Optimizar transfección utilizando diferentes proporciones de reactivo de transfección de ADN: (dentro del rango de 1 mg de ADN: 1.5-6 l de reactivo). Esto se puede hacer utilizando 2 ml de cultivos en una placa de 6 pocillos y la salida medida por inmunotransferencia. Hacer 12 puntos de tiempo hr puede indicar si la proteína se expresa y se degrada rápidamente; comprobar el lisado de células si la proteína no se observa en la fracción sobrenadante. Proteínas mal plegadas, que dejan de ser secretada, seguirán siendo evidentes en el lisado celular mediante inmunotransferencia.
Si la retención de Ni-NTA es baja, es decir, la proteína permanece en flujo continuo después de la columna de unión, utilice resina fresca. El aumento de pH de la muestra a 8,5 dará como resultado una unión más fuerte a la resina, aunque esto también aumentará la unión no específica. Concentrar la muestra y lote de unión a la resina O / N a 4 ° C seatanto la purificación Ni-NTA puede resultar en ~ aumento de 5x en proteína recuperada. Si el 6His-tag es inaccesible debido a la estructura terciaria de la proteína, trate de clonación en el otro terminal. Alternativamente, utilizar resina de cobalto, que tiene una mayor afinidad por residuos de His.
Si los agregados de proteínas y / o precipitados durante la purificación, aumentar la solubilidad mediante la adición de 10% de glicerol en el Ni-NTA lavar y tampones de elución. Ejecute las columnas de afinidad de níquel a temperatura ambiente en lugar de 4 ° C. Utilice fluorimetría diferencial de barrido 12 para la detección de pH y sal / aditivos que aumentan la estabilidad de la proteína en solución.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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