Introduction
La comprensione della struttura delle proteine a livello atomico è la chiave per scoprire le basi molecolari dei percorsi e delle malattie biologiche. X-ray cristallografia di proteine è il / metodo applicabile più ampiamente usato per determinare le strutture macromolecolari. La sfida principale di questo metodo è l'ottenimento di una quantità sufficiente di propriamente piegato, proteina pura. Questo diventa un problema particolare quando si lavora con le proteine secrete di mammifero, che subiscono specifiche modificazioni post-traduzionali.
Proteine batteri-espresse sono la fonte primaria di proteine cristallizzate depositate nel Protein Data Bank 1. Sistemi di espressione batterici sono largamente preferibili perché sono veloci, poco costosi e producono tipicamente alte rese di proteine. Tuttavia, i domini extracellulari di proteine di mammifero espresse in batteri sono spesso non correttamente ripiegate, in cui sono richiesti caso refolding ed estesa purificazione passi per ottenere omogeneamente foproteine lded. Inoltre, molte proteine di mammiferi necessitano di glicosilazione post-traslazionale per ottenere una corretta piegatura 2. Anche se l'espressione e glicosilazione in cellule di lievito o di insetto in grado di superare il problema ripiegamento, modificazioni post-traslazionali, tra cui glicosilazione, differiscono significativamente da quelle delle cellule di mammifero 3, producendo proteine con modifiche non corrette o non omogenei.
Le cellule di mammiferi esprimono tutta la macchinario molecolare necessario per garantire un'adeguata modificazioni post-traslazionale e pieghevoli; Tuttavia, questi sistemi di espressione non sono tipicamente preferiti dalla maggior parte laboratori, a causa di rendimenti limitati e costi elevati di reagenti e materiali di consumo. Polietilenimmina (PEI), un reagente di trasfezione standard è relativamente a buon mercato, ma impone una notevole citotossicità e la bassa efficienza di trasfezione, con conseguente aumento dei costi a supporto delle cellule, il DNA, e attrezzature coltura. Molte alternative al PEI sono proibitivi. Ci rivolgiamoquesti problemi descrivendo una combinazione di migliori strumenti di coltura cellulare e chimicamente modificati PEI per il metodo rapido e relativamente poco costoso per l'espressione di proteine secrete mammifero, seguita da purificazione passo singolo. Questo metodo robusto fornisce rendimenti sufficienti per studi funzionali e biochimici 4, e in alcuni casi, si traduce in proteine suscettibili di cristallizzazione senza ulteriore purificazione.
Questo protocollo descrive diverse tecniche per massimizzare l'espressione e la resa per le proteine di mammiferi secrete nel rene embrionali umane (HEK) 293F cellule coltivate in sospensione. Efficienza di trasfezione (e costo), la produzione di proteine e purificazione sono tutti sempre maggiore seguendo questo protocollo. PEI modificato con l'aggiunta di carbammati per reazione apertura d'anello singolo step (PEI-TMC-25, sintesi e proprietà descritte in dettaglio ref 5) migliora notevolmente l'efficienza di trasfezione, riduce la citotossicità da cationicorottura della membrana e di conseguenza riduce i costi di sperimentazione. Inoltre, la vitalità cellulare e l'espressione della proteina sono notevolmente migliorate con l'aggiunta di supplementi di coltura per la fornitura di glucosio e vitamine. È importante sottolineare che per la produzione di proteine glicosilate, il trattamento con kifunensine, un inibitore chimico non tossico di Mannosidase I, produce proteine con definite, glycans immaturi, che possono essere rimossi dal EndoHf endoglicosidasi per produrre proteine con un singolo N-acetilglucosamina al posto di un full-length glicano 6 N-linked. Infine, la secrezione di proteine in un mezzo chimicamente definito privo di siero consente purificazione rapida e facile per studi strutturali e biochimici. Single-step acido nitrilotriacetico nichel (Ni-NTA) purificazione resina rimuove la maggior parte dei contaminanti specie nel surnatante e, in alcuni casi, può produrre proteine di purezza sufficiente per cristallizzazione.
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Protocol
1. Produzione di milligrammo quantità di DNA plasmidi per larga scala trasfezione transiente
- Clonare la proteina di interesse in un alto numero di copie di mammifero vettore di espressione mediante clonazione sito di restrizione, o altra tecnica appropriata.
- Per ottenere risultati ottimali, utilizzare pHLsec 7 vettore, che ha un built-in C-terminale 6His-tag, un promotore forte sequenza di Kozak e un segnale di secrezione ottimizzato.
- Trasforma il plasmide sulle cellule competenti.
- Aggiungere 20 ml di cellule competenti di E. coli su 1 pg di DNA plasmidico e incubare in ghiaccio per 30 min.
- Cellule shock termico a 42 ° C per 35 secondi, poi incubare in ghiaccio per 2 minuti.
- Aggiungere 300 ml di mezzo di crescita microbica (SOC) e incubare a 37 ° C per 45 minuti, agitando a 220 rpm.
- Cellule piastra sulla piastra di agar con un'appropriata selezione antibiotica.
- Utilizzare 100 mg / ml carbenicillina se il plasmide è nel vettore pHLsec.
- Colonie culturali in 250 ml di Luria Broth (LB) Supporto integrato con 100 mg / ml antibiotico (carbenicillina) O / N a 37 ° C, agitando a 220 giri al minuto.
- Purificare il DNA dalla cultura con Hi-Speed plasmidi Maxi Kit secondo il protocollo del produttore.
- Eluire DNA in tampone EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), invece di tampone TE.
- Aliquota il plasmide purificato in quantità necessaria per la trasfezione e conservare a -20 ° C.
2. Su larga scala, Cultura e transitoria Transfection di 293F Cells
- Supplemento 1 L 293F media con 10 ml di glutammina e 5 ml Pen / Strep (entrambi 100x). Conservare a 4 ° C. 5 ml Pen / Strep è una forza sufficiente in condizioni di libero-siero e la concentrazione di antibiotico ridotto migliora la vitalità delle cellule durante la trasfezione, che migliora le rese di proteine.
- Cultura cellule 293F in 300 ml media in 1 L policarbonato sconcertato beute con tappo ventilatos a 37 ° C con 8% di CO 2, agitando in uno standard di coltura tissutale incubatore.
- Diluire le cellule per 5 x 10 5 / ml densità un giorno prima trasfezione.
- Il giorno della trasfezione, supplemento mezzo di coltura aggiungendo 10% del volume di 2% w / v Boost cellulare in 293F media.
- Misurare la concentrazione di glucosio usando un monitor di glucosio in base alle istruzioni del produttore e utilizzare integratori come necessario per ottenere una concentrazione di glucosio di 500 mg / dL.
- Aggiungere kifunensine (1 mg / ml concentrazione finale) in questa fase per controllare glicosilazione delle proteine.
- Calcolare il volume di DNA richiesto per 1 ug plasmide per 1 x 10 6 cellule. In condizioni sterili, diluire DNA in mezzo privo di siero 5 ml.
- Calcolare il volume di reagente trasfezione richiesto per 1 mg plasmide per 2 ml reagente di trasfezione. In condizioni sterili, diluire il reagente trasfezione (PEI-TMC-25) in mezzo privo di siero 5 ml.
- Aggiungerereagente di trasfezione in soluzione di DNA con incrementi di 1 ml, mescolando delicatamente. Incubare per 30 minuti a RT per complessi DNA-reagente per formare. Quindi aggiungere la soluzione sulle celle in maniera goccia a goccia.
- Consentono alle cellule trasfettate di esprimere proteine per 72-96 ore. Supplemento con ~ media il 10% del volume Boost cellulare al giorno o, se necessario, per mantenere il glucosio lettura 400-600 mg / dl.
3. Purificazione
- Decantare cultura in un pallone centrifuga, centrifugare per 20 minuti a 1300 xg per pellet cellule e quindi raccogliere il surnatante. Se necessario, girare una seconda volta e / o l'uso del filtro 0,22 micron per chiarire surnatante.
- Aggiungere 10% del volume 10x Ni-NTA tampone di legame (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazolo).
- Preparare una colonna gravità aggiungendo 2 ml di Ni-NTA slurry in una colonna e equilibrante con 10 volumi di colonna (CV) di 1x tampone di legame. Se possibile, fare tutti i passi di colonna in una camera a 4 ° C. Alternatively, proteine freddo e tutti i buffer sul ghiaccio prima del passaggio della colonna, e mantenere proteine e raccolti a flusso continuo su ghiaccio.
Nota: Ni-NTA slurry è del 50% in volume di resina e indicato capacità legante della produzione è di 50 mg / ml. Ni-NTA sfere possono essere ricaricate per molteplici usi - Flusso surnatante sulla resina e raccogliere flow-through. Ripetere questo passaggio.
- Lavare con 10 CV di tampone di lavaggio (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazolo pH 8).
- Eluire la proteina in 5 CV di tampone di eluizione (NaCl 300 mM, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazolo pH 8).
- Se è richiesta deglycosylation:
- Per un volume finale di 0,5 ml, concentrato eluato a 0,43 ml utilizzando un concentratore centrifugazione. Se precipita modulo, sedimentare i detriti per centrifugazione a 16.000 xg e 4 ° C.
- Aggiungere 50 ml di 500 mM Na-citrato pH 5,5.
- Aggiungere 20 ml di EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
None: L'enzima funziona in modo ottimale a 37 ° C, che può causare la proteina concentrata per aggregare. Estendere l'incubazione RT, se deglicosilazione, valutata mediante SDS-PAGE o immunoblotting, è incompleta. L'enzima non ha attività a 4 ° C. - Per rimuovere EndoHf: Lavare amilosio resina 3x in tampone fosfato (PBS) o tampone di stoccaggio definitivo. Incubare proteine con resina per 1 ora a 4 ° C. Spin 5 min a 1000 xg per far sedimentare perline e raccogliere il surnatante.
- Concentrato di proteine utilizzando appropriato filtro centrifugazione peso molecolare cutoff e buffer di scambio nel buffer di memoria (150 mM NaCl e 20 mM HEPES pH 7.5).
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Representative Results
Qui di seguito i risultati di questo sistema di espressione applicata ad un dominio secreto 13 kDa immunoglobuline (Ig) dalla proteina di attivazione del recettore umano espresso sulle cellule mieloidi (2 hTREM2, residui 19-132). TREM2 è una proteina transmembrana di tipo I che contiene un singolo dominio extracellulare Ig che ha due ponti disolfuro e due siti di glicosilazione N-linked. A differenza di molte altre proteine dominio Ig 8, TREM2 non era suscettibile di ripiegamento da corpi di inclusione batterici 9. Mutagenesi successiva confermati glicani N-linked sono necessari per una corretta espressione e piegatura. Per facilitare gli studi strutturali e funzionali, TREM2 è stato introdotto nel vettore pHLsec con un C-terminale 6His-tag 7 utilizzando tecniche di biologia molecolare standard. Espressione transiente in cellule trattate con kifunensine HEK293F prodotto proteina che viene purificato mediante cromatografia Ni-NTA (Figura 1B, corsia 2) ed il campione è stato poi deglicosilata produrre nativamente piegato, proteine omogenea (Figura 1B, corsia 3). 293F espressione di TREM2 prodotto 5-10 mg / L (5-10μg / milione di cellule trasfettate). Dopo buffer di scambio nel buffer di memorizzazione, questa proteina è stato cristallizzato (Figura 1C). Nonostante la purezza finale di circa 80%, questi cristalli affidabile riprodotti, diffratta, e sono stati mostrati da argento-macchia contenere solo proteine TREM2 (Figura 1D). Questa osservazione suggerisce l'omogeneità biochimica della proteina (cioè, piegatura e modificazioni post-traduzionali) possono, in alcuni casi, essere più critico di purezza globale per il successo di cristallizzazione.
Oltre a cristallizzazione, questo sistema offre uno strumento robusto per studi strutturali e funzionali. Si è sfruttata per la produzione di proteine nativamente glicosilata e realizzare> purezza 95% in cromatografia di esclusione molecolare (Figura 1E, F). Questa fase di purificazione ulteriore, che mostra la solutiocomportamento n della proteina, è anche un modo ideale per monitorare la qualità delle proteine. La proteina purificata dovrebbe eluisce al volume corrispondente al suo peso molecolare e dovrebbe essere la specie più abbondante nel campione. Anormalmente grandi quantità di proteine aggregate possono indicare proteina instabile e fornire indizi per ottimizzare la produzione di proteine e purificazione. Inoltre, questa proteina purificata finale è superiore per esperimenti biofisici quantitativi quali spettroscopia di dicroismo circolare, stabilità termica, e in relazione alle interazioni proteina-ligando. Infine, controllo della entità del glicosilazione fornisce uno strumento robusto per studiare funzioni glycan-dipendente.
Figura 1. Mammalian Expression System: (A) Schema per l'espressione di proteine di mammifero con glicosilazione controllata o nativo in cellule HEK 293F. ( B) SDS-PAGE di NiNTA-purificata hTREM2 espresso sotto kifunensine mostrato prima (corsia 2) e dopo (corsia 3) deglicosilazione con EndoHf. (C) cristalli prodotti da proteine NiNTA-purificata e deglicosilata. (D) macchia d'argento di ingresso cristallizzazione (corsia 1) e cristalli raccolti (corsie 2 e 3) rivela cristalli contengono solo TREM2. (E) Un'ulteriore depurazione di TREM2 è stata ottenuta utilizzando cromatografia di esclusione molecolare di TREM2 NiNTA-purificata prodotta in 293F cellule senza Kifunensine. Asterischi (*) indicano volumi di eluizione di standard di peso molecolare. Le proteine eluite in TBS usando una colonna analitica S200 (GE). (F) SDS-PAGE analisi di dimensioni dell'esclusione-purificata TREM2: proteine ingresso (corsia 2) e il picco ripiegato (corsia 3). Si noti come, glycans eterogenee eseguire ad un più alto peso molecolare apparente con un ampio striscio da SDS-PAGE pieno.nk "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Cellule HEK 293F offrono produzione robusta di proteine che richiedono modificazioni post-traslazionali. Questo sistema permette l'espressione rapida e scalabile di proteine ripiegate in modo nativo contenenti disolfuri, glicosilazione e fosforilazione che altrimenti assente utilizzando più strumenti di espressione di routine. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per l'espressione e la purificazione di complessi multi-proteici semplicemente co-trasfezione di plasmidi multipli. Oltre TREM2, questo sistema è stato ampiamente utilizzato per gli studi funzionali con altre proteine di interesse in laboratorio 10,11. Le cellule di mammiferi offrono anche privo di endotossine proteina espressione ottimale per esperimenti in vivo o per la produzione di antigeni nativamente piegato per generare anticorpi conformazione-dipendenti.
Condizioni di vitalità cellulare e trasfezione ottimali sono il più importante per la produzione di proteine efficiente. Per una migliore vitalità cellulare, colture cellulari a basso passaggio vengono potenziaticon i supplementi di coltura cellulare e la concentrazione di antibiotico nel terreno di crescita si riduce. Il modificato PEI-TMC-25 ha adatto efficienza transection con la maggior parte delle proteine; tuttavia, ci sono altre opzioni disponibili a prezzo moderato, che offrono una maggiore efficienza di trasfezione e ridotto citotossicità. Hype 5 (Oz Bioscience) aumenta rendimenti rispetto ad PEI o altri reagenti, a un costo notevolmente ridotto rispetto ai reagenti di trasfezione più costosi, quali 293fectin. Il tipo di reagente e il DNA: i rapporti dei reagenti possono essere ottimizzati per singole espressioni e le esigenze dell'esperimento desiderato.
Il metodo qui descritto presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di produzione di proteine. Le cellule di mammiferi offrono nativo pieghevole chaperone e modificazioni post-traslazionali non disponibili per batteri e lieviti. Il tempo ridotto per la costruzione del plasmide e preparazione, lungo l'uso di supporti, il cui pH può essere direttamente modificato, rendono superiore a baculovirproduzione statunitense in cellule di insetto; e infine, i mezzi di comunicazione privo di siero offre scalabilità facile (densità di celle superiore) e purificazione non raggiungibili per le cellule 293T aderenti. La limitazione principale di questo sistema è solo l'ora e scalare il ricercatore individuo è in grado di impegnarsi per l'espressione della proteina.
Incluso sotto sono le opzioni per la risoluzione dei problemi più comuni riscontrati.
Risoluzione dei problemi
Se non vi è espressione a basso contenuto proteico, evitare passaging 293F cellule superiori ai 2-3 mesi. Risultati passaging prolungata in salute delle cellule diminuito riflettono in cicli di raddoppio più lento e ridotto in modo significativo l'espressione della proteina. La crescita delle cellule deve essere monitorata ogni giorno e le culture non è più del doppio ogni giorno deve essere eliminata. La vitalità cellulare può essere migliorata utilizzando integratori di cultura mentre passaging cellule. Monitorare il glucosio per garantire una concentrazione di 400-600 mg cultura / dl densità cellulare non deve superare 2 milioni / ml evitalità cellulare dovrebbe essere ≥98% per esclusione trypan blu. Diluire le cellule dense a 0,5 milioni / ml e consentire di raddoppiare O / N prima trasfezione. Ottimizzare trasfezione utilizzando diversi rapporti di reagente trasfezione: DNA (entro l'intervallo di 1 mg DNA: 1,5-6 microlitri di reagenti). Questo può essere fatto utilizzando 2 ml culture in un 6-pozzetti e l'uscita misurata mediante immunoblotting. Fare 12 punti Tempo ore può indicare se la proteina viene espressa e degradato rapidamente; controllare il lisato cellulare se la proteina non viene rispettato nella frazione surnatante. Proteine mal ripiegate, che non riescono a essere secreto, saranno ancora evidenti nel lisato cellulare mediante immunoblotting.
Se ritenzione Ni-NTA è basso, vale a dire, la proteina rimane in flow-through dopo legame colonna, utilizzare resina fresca. Aumentando il pH del campione da 8,5 comporterà forte legame con la resina, anche se questo aumenterà anche legame non specifico. Concentrare il campione e il lotto legame resina O / N a 4 ° C siafore Ni-NTA purificazione può comportare ~ 5x aumento in proteina recuperata. Se la 6His-tag è inaccessibile a causa della struttura terziaria della proteina, provare clonazione sull'altro terminale. In alternativa, utilizzare Cobalt resina, che ha una maggiore affinità per i suoi residui.
Se gli aggregati proteici e / o precipitati durante la purificazione, aumentare la solubilità aggiungendo 10% glicerolo in Ni-NTA lavare e tamponi di eluizione. Eseguire le colonne di nichel affinità a temperatura ambiente invece di 4 ° C. Utilizzare scansione differenziale fluorimetria 12 per schermo per pH e sale / additivi che aumentano la stabilità della proteina in soluzione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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