Introduction
原子レベルでタンパク質の構造を理解することは、生物学的経路および疾患の分子基盤を解明する鍵となります。 X線タンパク質結晶学は、高分子構造を決定するための最も広く使用される/適用可能な方法です。この方法の主な課題は、適切に折り畳まれた、純粋なタンパク質の十分な量を得ることです。これは、特に、特定の翻訳後修飾を受ける哺乳類分泌タンパク質を扱う問題となります。
細菌発現タンパク質は、タンパク質データバンク1に堆積し結晶化するタンパク質の主要な源です。それらは安価、高速であり、典型的にはタンパク質の高収量を産生するための細菌発現系は、主に好ましいです。しかし、細菌中で発現哺乳動物タンパク質の細胞外ドメインは、多くの場合、適切にケースがリフォールディングし、大規模な精製工程をfoを均一に得るために必要とされる、折り畳まれていませんldedタンパク質。さらに、多くの哺乳動物タンパク質は、適切なフォールディング2を達成するために 、翻訳後グリコシル化を必要とします。酵母または昆虫細胞での発現およびグリコシル化は、フォールディングの問題を克服することができるが、グリコシル化を含む翻訳後修飾は、不正確なまたは不均一な修飾を有するタンパク質をもたらす、哺乳動物細胞3のものとは大きく異なります。
哺乳動物細胞は、適切な翻訳後修飾や折りたたみを確保するために必要なすべての分子機構を表現します。しかしながら、これらの発現系は、典型的には、限られた収率及び試薬および消耗品のコスト高のために、ほとんどの研究室で好ましくない。ポリエチレンイミン（PEI）は、標準的なトランスフェクション試薬は、比較的安価であるが、細胞培地、DNA、及び培養装置におけるコストの増加をもたらす、かなりの細胞毒性および低いトランスフェクション効率を課します。 PEIへの多くの選択肢が非常に高価です。我々は対処します改善された細胞培養ツールの組み合わせを記述し、化学的に単一工程精製し、分泌された哺乳動物タンパク質の発現のための迅速で比較的安価な方法に対するPEI修飾することによって、これらの問題。この強力な方法は、機能的および生化学的研究4のために十分な収率を与え、場合によっては、さらに精製せずに結晶化を受けやすいタンパク質をもたらします。
このプロトコルは、懸濁液中で増殖させたヒト胚腎臓（HEK）293F細胞における分泌哺乳動物タンパク質のための発現と歩留まりを最大化するために、いくつかの手法について説明します。トランスフェクション効率（及び費用）、タンパク質産生および精製は、すべて非常にこのプロトコルに従うことによって強化されます。シングルステップ開環反応（文献5に詳細に記載さPEI-TMC-25、合成および特性）を介してカルバメートの付加により修飾PEIが大きく、カチオン性の細胞毒性を減少させ、トランスフェクション効率を向上させます膜破壊し、それに応じて、実験のコストを削減します。さらに、細胞生存率およびタンパク質の発現が大幅にグルコースおよびビタミンを供給するための培養栄養補助食品の添加によって改善されます。重要なことには、グリコシル化タンパク質の産生、キフネンシンによる治療、マンノシダーゼIの非毒性の化学阻害剤のための代わりに単一のN-アセチルグルコサミンを有するタンパク質を生成するためにエンドグリコシダーゼEndoHfによって除去することができる定義された、未成熟グリカンを有するタンパク質を生成します完全長のN-結合グリカン6。最後に、無血清、化学的に定義された培地中へのタンパク質の分泌は、構造的および生化学的研究のための迅速かつ容易な精製を可能にします。シングルステップニッケル - ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）樹脂精製上清中の種の汚染の大部分を除去し、ある場合には、結晶化のために十分な純度のタンパク質を得ることができます。
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Protocol
大規模な一過性トランスフェクションのためのプラスミドDNAのミリグラム量の1生産
- 制限部位は、クローニング、またはその他の適切な技術を用いて、高コピー数の哺乳動物発現ベクターに目的のタンパク質をクローニングします。
- 最適な結果を得るために、組み込まれているC末端の6Hisタグ、強力なプロモーターKozak配列および最適化された分泌シグナルpHLsec 7ベクトルを、使用しています。
- コンピテント細胞にプラスミドを変換します。
- プラスミドDNA1μgのにコンピテント大腸菌細胞の20μlを添加し、氷上で30分間インキュベートします。
- 35秒間42℃で熱ショック細胞は、その後2分間氷上でインキュベートします。
- 微生物の増殖培地（SOC）の300μlを添加して、220rpmで振とうしながら、45分間37℃でインキュベートします。
- 適切な抗生物質選択と寒天プレート上で平板細胞。
- プラスミドはpHLsecベクターである場合は、100μg/ mlのカルベニシリンを使用してください。
- ルリアブロス（LB）メディアの250ミリリットル中の培養コロニーは、220 rpmで振とうしながら、37℃で100μg/ mlの抗生物質（カルベニシリン）、O / Nで補充。
- 製造業者のプロトコルに従ってハイスピードプラスミドマキシキットを使用して培養物からDNAを精製します。
- 代わりにバッファTEの、バッファEB（10mMのトリス-Cl、pH8.5）中のDNAを溶出します。
- -20℃でのトランスフェクションおよびストアに必要な量で精製されたプラスミドを等分。
293F細胞の2大規模培養および一過性トランスフェクション
- グルタミン10ml及び5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（両方とも100倍）を用いて追補1 L 293F媒体。 4℃で保存します。 5 mlのペニシリン/ストレプトマイシンを無血清条件で十分な強度であり、減少した抗生物質の濃度は、タンパク質収率を改善するトランスフェクション時に細胞生存率を改善します。
- 1Lのポリカーボネート中の300ミリリットル培地で培養293F細胞は、通気キャップで三角フラスコバッフル8％CO 2、37℃での、標準的な組織培養インキュベーター中で振盪しながら。
- 5×10 5 / mlの密度、トランスフェクションの前日に細胞を希釈します。
- 293F培地における細胞ブーストw / vの2％の10％の容量を追加することにより、トランスフェクション、補充培地の日。
- 500ミリグラム/ dLのグルコース濃度を達成するために必要に応じて、製造者の指示及び使用サプリメントによるグルコースモニタを使用してグルコース濃度を測定します。
- タンパク質のグリコシル化を制御するには、この段階でキフネンシン（1 / mlの最終濃度）を追加します。
- 1×10 6個の細胞あたり1μgのプラスミドに必要なDNAの量を計算します。無菌条件下で、5 mlの無血清培地中でDNAを希釈します。
- トランスフェクション試薬μlの2当たり1μgのプラスミドに必要なトランスフェクション試薬の量を計算します。無菌条件下で、5 mlの無血清培地中でトランスフェクション試薬（PEI-TMC-25）を希釈します。
- 追加1ミリリットル単位でDNA溶液へのトランスフェクション試薬は、穏やかに混合します。形成するための試薬-DNA複合体を室温で30分間インキュベートします。その後、滴下方式で細胞上に溶液を加えます。
- トランスフェクションされた細胞は、72〜96時間タンパク質を発現することを許可します。 〜10％の容量セルブースト毎日メディア、または必要に応じてとの補足は、グルコースが400〜600ミリグラム/デシリットルを読み続けます。
3.精製
- 細胞をペレット化した後、上清を収集するために1300×gで20分間、遠心分離フラスコに培養物を遠心分離しデカントします。必要な場合は、2番目の時間をスピンおよび/または上清を明確にするために、0.22μmのフィルターを使用しています。
- 10％容積の10倍のNi-NTA結合バッファー追加（1.5 MのNaCl、0.5 K 2 HPO 4、0.1 MトリスpHは8.5、50mMのイミダゾール）。
- カラム内のNi-NTAスラリーを2mlを添加し、1×結合緩衝液の10カラム容量（CV）で平衡化することによって、重力カラムを準備します。可能な場合は、4℃の部屋にすべての列の手順を実行します。 Alternativエリー、チルタンパク質とカラム工程の前に、氷の上のすべてのバッファ、および蛋白質を維持し、収集したフロースルー氷上。
注：のNi-NTAスラリーは、50体積％の樹脂であり、製造者述べ結合能力は、50 mg / mlです。 Ni-NTAビーズを複数の用途のために再充電することができます - 樹脂上で上清をフローとフロースルーを収集します。この手順を繰り返します。
- 洗浄緩衝液（300mMのNaCl、50mMのK 2 HPO 4、20mMのイミダゾールをpH8）の10 CVで洗浄しました。
- 溶出緩衝液（300mMのNaCl、50mMのK 2 HPO 4、250 mMイミダゾールのpHは8）の5 CVでタンパク質を溶出します。
- 脱グリコシル化が必要な場合：
- 0.5ミリリットルの最終容量のために、遠心濃縮器を用いて、0.43ミリリットルに溶出液を濃縮します。沈殿物を形成する場合は、16,000×gで4℃で遠心分離することにより、任意の破片をペレット化。
- 500 mMのクエン酸ナトリウムのpHが5.5の50μLを加えます。
- EndoHf20μlの（1×10 6 U / ml）を追加します。室温で2時間インキュベートします。
ありませんE：酵素が濃縮されたタンパク質が凝集するおそれがある、37℃で最適に動作します。脱グリコシル化は、SDS-PAGEまたはイムノブロットによって評価すると、RTインキュベーションを拡張し、不完全です。酵素は4℃で活性を有していません。 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または最終貯蔵緩衝液で洗浄アミロース樹脂3倍：EndoHfを削除します。 4°Cで1時間樹脂を有するタンパク質をインキュベートします。ビーズをペレット化し、上清を回収し千×gで5分間回転さ。
- 適切な分子量カットオフ遠心フィルターを用いてタンパク質を濃縮し、保存緩衝液（150mMのNaCl及び20mMのHEPES pH7.5）中に緩衝液交換。
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Representative Results
ここで骨髄細胞2（hTREM2、残基19から132）上に発現ヒトタンパク質誘発性受容体から分泌される13 kDaの免疫グロブリン（IG）ドメインに適用され、この発現系の結果に従います。 TREM2は2つのジスルフィド結合と2つのN結合型グリコシル化部位を有する単一の細胞外Igドメインを含むI型膜貫通タンパク質です。多くの他のIgドメインタンパク質8とは異なり、TREM2は、細菌封入体9からのリフォールディングに適していませんでした。その後の突然変異誘発は、N-結合グリカンを適当な発現およびフォールディングのために必要とされていることが確認されました。構造的および機能的研究を容易にするために、TREM2は、標準的な分子生物学技術を用いて、C末端の6Hisタグ7とpHLsecベクターに導入しました。キフネンシンで処置したHEK293F細胞で一過性発現（図1B、レーン2）のNi-NTAクロマトグラフィーにより精製したタンパク質を生じたサンプルは、その後、NATI生成するために脱グリコシル化されましたvely折り畳まれ、均質なタンパク質（ 図1B、レーン3）。 TREM2の293F式は5〜10 mg / Lで（5-10μg/百万トランスフェクトした細胞）を生産しました。バッファは、記憶バッファに交換した後、このタンパク質は、（ 図1C）結晶化しました。約80％の最終純度にもかかわらず、これらの結晶を確実回折、再生、およびのみTREM2タンパク質（ 図1D）を含有する銀染色により示されました。この観察は、タンパク質の生化学的な均質性を示唆している（ すなわち、折り畳みおよび翻訳後修飾）は、いくつかのケースでは、結晶化の成功のための全体的な純度よりも重要であることができます。
結晶化に加えて、このシステムは、構造的および機能的研究のための強力なツールを提供しています。これは、ネイティブのグリコシル化タンパク質を生成し、サイズ排除クロマトグラフィー（ 図1E、F）によって> 95％純度を達成するために利用されます。 solutioを示しているこの追加の精製工程、タンパク質のNの動作は、また、タンパク質の品質を監視するための理想的な方法です。精製したタンパク質は、その分子量に対応するボリュームで溶出する必要があり、サンプルの中で最も豊富な種でなければなりません。異常に凝集タンパク質の大量の不安定なタンパク質を示し、タンパク質産生および精製を最適化するための手がかりを提供することができます。また、この最終的な精製されたタンパク質は、円二色性分光法、熱安定性、及び調査するタンパク質 - リガンド相互作用のような定量的な生物物理学的実験に使用するために優れています。最後に、グリコシル化の程度を制御することグリカン依存の機能を研究するための強力なツールを提供します。
図1.哺乳類発現系：（A）スキームHEK 293F細胞において制御または天然のグリコシル化によるタンパク質の哺乳動物発現のために。 （ B）のNiNTA精製hTREM2のSDS-PAGEは（レーン2）の前に示さキフネンシン下でEndoHfと（レーン3）脱グリコシル化後に発現。 NiNTA精製し、脱グリコシル化タンパク質から生成された（C）結晶。結晶化の入力（D）銀染色（レーン1）及び収穫結晶（レーン2および3）は、結晶のみTREM2を含んで明らかにする。 TREM2の（E）さらに精製せずにキフネンシン293F細胞で産生さのNiNTA精製TREM2のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して達成されました。アスタリスク（*）は、分子量標準の溶出量を示しています。タンパク質は、分析S200カラム（GE）を用いて、TBSで溶出しました。 （F）サイズ排除精製TREM2のSDS-PAGE分析：入力タンパク質（レーン2）および折り畳まれたピーク（レーン3）。フル、異種のグリカンは、SDS-PAGEで幅広い汚れに高い見かけの分子量で実行方法に注意してください。NK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
HEK 293F細胞は、翻訳後修飾を必要とするタンパク質の強固な生産を提供しています。このシステムは、それ以外の場合は、より日常的表現のツールを使用して存在しないことになるジスルフィド、グリコシル化、およびリン酸化を含むネイティブに折りたたまれたタンパク質の迅速かつスケーラブルな発現を可能にします。また、このシステムは、単に複数のプラスミドの同時トランスフェクションにより、多タンパク質複合体の発現および精製のために使用することができます。 TREM2また、本システムは、広く研究室10,11内の関心のある他のタンパク質との機能的研究に使用されています。哺乳動物細胞はまた 、インビボ実験のために、またはコンホメーション依存性抗体を生成するために、天然の折り畳み抗原の生産のための最適なエンドトキシンフリータンパク質発現を提供しています。
最適な細胞生存率およびトランスフェクション条件は、効率的なタンパク質産生のために最も重要です。優れた細胞生存率は、低継代の細胞培養物を追加免疫します細胞培養サプリメントおよび増殖培地中の抗生物質濃度で還元します。修正されたPEI-TMC-25は、ほとんどのタンパク質との適切な切断効率を有します。しかし、増加したトランスフェクション効率と低細胞毒性を提供する適度な価格で利用可能な他のオプションがあります。ハイプ5（オズバイオサイエンス）は、293フェクチンとして、より高価なトランスフェクション試薬に比べてかなり低コストで、PEIまたは他の試薬に比べて歩留まりを向上させます。試薬の種類とDNA：試薬比は、個々の表現や目的実験のニーズに合わせて最適化することができます。
ここに記載された方法は、タンパク質生産の他の方法を超えるいくつかの利点を有します。哺乳動物細胞は、細菌や酵母が利用できないネイティブシャペロンの折り畳みおよび翻訳後修飾を提供しています。メディアの利用に沿ってプラスミド構築と準備のための時間短縮は、直接変更することができるのpHは、baculovirすることが優れた作ります昆虫細胞中での私たちに基づく生産。そして最後に、無血清培地は、容易なスケーリング（高細胞密度）を提供し、接着性293T細胞への精製は達成できません。このシステムの主な制限は、個々の研究者がタンパク質発現にコミットすることができます唯一の時間とスケールです。
発生する最も一般的な問題のトラブルシューティングのオプションは以下に含まれています。
トラブルシューティング
低タンパク質の発現がある場合は、2〜3ヶ月より長い293F細胞を継代することは避けてください。減少した細胞の健康における長期の継代の結果が遅い倍加時間に反映され、大幅にタンパク質の発現を減少させました。細胞増殖を毎日モニターすべきであり、もはや日常倍増文化が破棄されるべきです。細胞生存率は、細胞を継代培養しながら、サプリメントを使用することによって改善することができます。 / dlの細胞密度200万/ mlのを超えてはならない400〜600ミリグラムの培養濃度を確保するために、グルコースを監視し、細胞生存率はトリパンブルー排除により≥98％であるべきです。 mlの050万/に高密度の細胞を希釈し、O / Nトランスフェクション前に倍増することができます。 （1μgのDNAの範囲内：1.5-6μlの試薬）のDNA：トランスフェクション試薬の異なる比率を使用してトランスフェクションを最適化します。これを、2 mlの6ウェルプレート中で培養し、免疫ブロット法によって測定された出力を使用して行うことができます。タンパク質が発現し、急速に分解されているかどうかを示すことができ、12時間の時点を行います。タンパク質が上清画分において観察されていない場合、細胞溶解物を確認します。分泌されることができないミスフォールドタンパク質は、まだ免疫ブロットにより細胞溶解物中では明らかであろう。
Ni-NTA保持が低い場合、 すなわち、タンパク質は、カラムを結合した後、フロースルー中に残り、新たな樹脂を使用します。これはまた、非特異的結合を増加させるが、8.5にサンプルのpHを増加させると、樹脂に強い結合をもたらします。 4℃で/ N樹脂Oに結合するサンプルやバッチを濃縮することをC前方のNi-NTA精製は、回収されたタンパク質で〜5倍の増加をもたらすことができます。 6Hisタグが原因タンパク質の三次構造にアクセスできない場合、他方の末端でそれをクローニングしてみてください。あるいは、His残基に対して高い親和性を有するコバルト樹脂を使用します。
タンパク質凝集体および/または精製の間に沈殿する場合はNi-NTA洗浄および溶出緩衝液中に10％グリセロールを添加することにより溶解度を増加させます。 RTの代わりに、4℃で、ニッケルアフィニティーカラムを実行します。 pH及び塩/溶液中のタンパク質の安定性を高める添加剤をスクリーニングするために、示差走査蛍光光度12を使用してください 。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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