Introduction
원자 수준에서 단백질의 구조를 이해하는 것은 생물학적 경로와 질병의 분자 기반을 폭로의 핵심입니다. X 선 결정학은 단백질 거대 분자의 구조를 결정하기위한 가장 널리 사용 / 적용 가능한 방법이다. 이 방법의 가장 큰 문제는 제대로 접혀, 순수한 단백질의 충분한 양을 얻을 수있다. 특히 특정 번역 후 수정을 거쳐 분비 포유류 단백질, 작업 문제가된다.
세균 발현 단백질은 단백질 데이터 뱅크 1에서 증착 된 결정화 된 단백질의 주요 원이다. 그들은 저렴하고, 빠르고 일반적으로 단백질의 높은 수율을 생산하기 때문에 세균 발현 시스템은 크게 바람직하다. 그러나, 박테리아에서 발현 포유류 단백질의 세포 외 도메인은 종종 제대로 fo를 균일하게 얻기 위해하는 경우 폴딩 및 광범위한 정화 단계가 필요, 접힌되지 않습니다lded 단백질. 또한, 많은 포유류 단백질은 적절한 폴딩 2를 달성하기 위해 번역 후 당화가 필요합니다. 효모 또는 곤충 세포에서의 발현은 글리코 실화 및 접힘 문제를 극복 할 수 있지만, 당화 포함 번역 후 변형은, 부정확 한 또는 불균일 한 변형을 가진 단백질을 수득 포유류 세포 (3)의 것과 크게 다르지.
포유 동물 세포가 적절한 번역 후 변형 및 폴딩을 위해 필요한 모든 분자 기계를 표현; 그러나, 이러한 발현 시스템은 전형적으로 제한 수율 및 시약 및 소모품의 높은 비용, 대부분의 실험실에서 바람직하지 않다. 폴리에틸렌 이민 (PEI)는 표준 트랜 스펙 션 시약을 비교적 염가이지만 상당한 독성, 낮은 형질 감염 효율, 셀 매체, DNA의 비용 상승을 초래하고 장비의 배양을 부과한다. PEI에 많은 대안이 엄청나게 비싸다. 우리는 해결개선 된 세포 배양 용 도구의 조합을 나타내는 화학적, 단일 단계 정제 한 후, 분비 된 포유 동물 단백질의 발현을위한 신속하고 비교적 저렴한 방법에 대한 PEI를 수정함으로써 이러한 문제. 이 방법은 강력한 기능, 생화학 적 연구 4 충분한 수율을 제공하고, 어떤 경우에는, 추가의 정제없이 결정화 의무가 단백질을 초래한다.
이 프로토콜은 표현을 극대화하고 정지에서 재배 인간 배아 신장 (HEK)에서 분비 포유류 단백질 293F 세포 산출하기 위해 여러 가지 기술에 대해 설명합니다. 형질 전환 효율 (비용), 단백질 생산 및 정제 모두 크게이 프로토콜에 따라 향상됩니다. 단일 단계의 개환 반응을 통해 카바 메이트의 추가에 의해 변형 된 PEI는 (PEI-TMC-25, REF 5에 상세히 설명 합성 및 특성)을 크게, 트랜 스펙 션 효율을 향상 양이온으로부터 세포 독성을 줄여따라서 막 중단 및 실험 비용을 절감 할 수 있습니다. 또한, 세포 생존 및 단백질 발현이 크게 포도당과 비타민 공급 배양 보조제의 첨가로 향상된다. 중요한 kifunensine와 당화 단백질, 치료의 제조, 만노 I의 비 독성 화학 억제제, 대신에 단일 N 아세틸 글루코사민으로 단백질을 수득 엔도 글리코시다 제의 EndoHf에 의해 제거 될 수있다 정의 미성숙 글리 칸으로 단백질을 생산 전체 길이가 6 글리 칸을 N- 결합. 마지막으로, 혈청, 화학적 매체에 단백질의 분비는 구조적, 생화학 적 연구에 대한 신속하고 손쉬운 정화를 할 수 있습니다. 단일 단계 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA 니켈) 수지의 정제는 경우에 따라, 결정화를 위해 충분한 순도의 단백질을 얻을 수 있고, 상징액의 종 및 오염의 대부분을 제거한다.
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Protocol
대규모 과도 형질에 대한 플라스미드 DNA의 밀리그램 수량 1. 생산
- 제한 부위 클로닝, 또는 다른 적절한 기술을 사용하여 높은 카피 수 포유 동물 발현 벡터에 목적 단백질을 복제.
- 최적의 결과를 가지고 pHLsec 7 벡터를 사용하는 내장 된 C- 말단 6His 태그, 강력한 프로모터 코작 순서 및 최적화 분비 신호.
- 적격 세포에 플라스미드를 변형.
- 플라스미드 DNA의 1 μg의 관할에 대장균의 20 μl를 첨가하고 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 42 ℃에서 열 쇼크 셀 35 초 후, 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 미생물 성장 매체 (SOC)의 300 μl를 추가하고 220 rpm으로 떨고, 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 적절한 항생제 선택과 한천 플레이트에 플레이트 세포.
- 플라스미드 pHLsec 벡터의 경우 100 μg의 / mL의 카르 베니 실린을 사용하여.
- 루리아 국물 (LB) 미디어 250 ml의 문화 식민지는 220 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 100 μg의 / ㎖ 항생제 (카르 베니 실린) O / N로 보충.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 고속 플라스미드 맥시 키트를 사용하여 문화의 DNA를 정화.
- 대신 버퍼 TE의 버퍼 EB (10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5)에서 DNA를 용출.
- -20 ° C에서 형질 전환 및 저장에 필요한 양의 정제 된 플라스미드를 나누어지는.
293F 세포의 2. 대규모 문화와 과도 형질
- 10 글루타민 ㎖의 5 ml의 펜 / 연쇄상 구균 (둘 다 100 배)와 보충 1 L 293F 미디어. 4 ℃에서 보관하십시오. 5 ㎖ 펜 / 스트렙토 단백질 수율을 향상 무 혈청 조건으로 환원 항생제 농도가 형질 중에 세포 생존을 개선에 충분한 강도이다.
- 1 리터의 폴리 카보네이트 300 ml의 미디어 문화 293F 세포는 배출 캡으로 삼각 플라스크를 당황8 % CO 2와 37 ° C에서의 표준 조직 문화 인큐베이터에 떨고있다.
- 세포에 5 × 105 / ㎖ 밀도 형질 전에 하루 희석.
- 293F 세포 미디어 부스트 V / w 2 %의 10 % 부피를 첨가하여 형질 감염, 보충 배지 날.
- 500 밀리그램 / dL로의 글루코스 농도를 달성하기 위해 필요에 따라 제조자의 지시 및 사용에 따른 보충 글루코스 모니터를 이용하여 글루코스 농도를 측정한다.
- 단백질 당화을 제어하는이 단계에서 kifunensine (1 μg의 / ml의 최종 농도)를 추가합니다.
- DNA의 계산 볼륨 1 × 10 6 세포 당 1 μg의 플라스미드 필요합니다. 멸균 조건하에, 5 ㎖의 무 혈청 배지에서 희석 DNA.
- 형질 전환 시약 μL 2 당 1 μg의 플라스미드에 필요한 형질 전환 시약의 양을 계산합니다. 멸균 조건하에, 5 ㎖의 무 혈청 배지에서 형질 전환 시약 (PEI-TMC-25)를 희석한다.
- 더하다1 ml의 단위로 DNA 용액으로 형질 전환 시약, 부드럽게 혼합. 형성 시약-DNA 복합체에 대한 RT에서 30 분 동안 배양한다. 이어서 적가 방식으로 셀에 용액을 추가한다.
- 형질 세포는 72-96 시간 동안 단백질을 발현하도록 허용합니다. ~ 10 % 볼륨 셀 부스트 매일 미디어, 또는 필요에 보충은 혈당이 400 ~ 600 밀리그램 / DL을 읽고 유지합니다.
3. 정제
- 세포를 펠릿 화하고 상층 액을 수집 1,300 XG에서 20 분 동안 원심 분리기로 원심 분리 플라스크 배양을 경사 분리한다. 필요하다면, 두 번째 회전 및 / 또는 상등액을 명확히 0.22 μm의 필터를 사용한다.
- 10 %의 10 배 부피의 Ni-NTA 추가 결합 완충액 (1.5 M의 NaCl, 0.5 MK 2 HPO 4, 0.1 M 트리스 pH가 8.5, 50 mM의 이미 다졸).
- 열에서의 Ni-NTA 슬러리 2 ㎖를 추가하고 1X 바인딩 버퍼의 10 열 볼륨 (CV)로 평형화하여 중력 열을 준비합니다. 가능하면, 4 ° C를 방에서 모든 열 단계를 수행. Alternativ엘리, 진정 단백질 및 열 단계 전에 얼음에 모든 버퍼 및 단백질을 유지하고 수집 흐름을 통해 얼음에.
주 : 니켈 NTA 슬러리를 50 체적 %의 수지 및 제조의 명시 결합능은 50 ㎎ / ㎖이다. NI-NTA 비드 여러 용도로 재충전 될 수있다 - 수지 위에 뜨는 흐름과 흐름을 통해 수집합니다. 이 단계를 반복합니다.
- 세척 버퍼의 10 CV로 세척 (300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 K 2 HPO 4, 20 mM의 이미 다졸 산도 8).
- 용출 완충제 5 CV로 단백질을 용리 (300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 K 2 HPO 4, 250 mM의 이미 다졸의 pH 8).
- 경우 탈 글리코 실화가 필요합니다 :
- 0.5 ㎖의 최종 부피를 위해, 원심 분리 농축기를 이용하여 0.43 ml의 용출액을 농축시킨다. 양식을 침전 경우, 16,000 XG, 4 ℃에서 원심 분리하여 이물질을 펠렛.
- 500 밀리미터 나 - 구연산 산도 5.5의 50 μl를 추가합니다.
- EndoHf (1 × 106 U / ㎖)의 20 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 실온에서 품어.
아니E : 효소는 농축 된 단백질이 응집시킬 수있는, 37 ℃에서 최적으로 작동합니다. SDS-PAGE 또는 면역 탈 글리코 실화에 의해 평가가 불완전한 경우, RT 배양을 연장한다. 효소는 4 ° C에서 활동이 없습니다. - 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 최종 저장 버퍼에 세척 아밀로스 수지 배 : EndoHf를 제거하십시오. 4 ℃에서 1 시간 동안 수지와 단백질을 품어. 구슬 펠렛 상층 액을 수집하기 위해 1,000 XG에서 5 분 스핀.
- 적절한 분획 분자량 원심 분리 필터를 이용하여 단백질을 농축시키고, 저장 버퍼 (150 mM의 염화나트륨, 20 mM의 HEPES pH를 7.5)로 교환 버퍼.
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Representative Results
본원에서 골수 세포를 2 (hTREM2 잔사 19부터 1백32까지)에 발현 인간 단백질 트리거링 수용체로부터 분비되는 13 kDa의 면역 글로빈의 (IG)에인가 도메인이 발현 시스템의 결과에 따른다. TREM2 두 개의 이황화 결합 및 N - 결합 글리코 실화 부위를 갖는 단일 IG 세포 외 도메인을 함유하는 I 형 막 횡단 단백질이다. 다른 많은 IG 도메인 단백질 (8)과는 달리, TREM2 세균 봉입체 (9)에서 접힘 의무가 아니 었습니다. 이후의 돌연변이 유발 확인 N 연결 글리 칸은 적절한 표현과 폴딩이 필요합니다. 구조적 및 기능적 연구를 용이하게하기 위해, TREM2는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 C 말단 6His 태그 7 pHLsec 벡터에 도입 하였다. kifunensine 처리 HEK293F 세포에서의 일시적인 발현은 (도 1b, 레인 2)의 Ni-NTA 크로마토 그래피에 의해 정제 된 단백질을 수득하고 샘플을 생성하기 위해 타 Nati 탈글 라이코 실화 된vely, 균일 한 단백질 (그림 1B, 레인 3) 접혀. TREM2의 293F 표현은 5 ~ 10 ㎎ / ℓ (5-10μg / 만 형질 감염된 세포)를 생산했다. 버퍼 저장 버퍼로 교환 한 후,이 단백질은 (도 1C)을 결정화시켰다. 약 80 %의 최종 순도에도 불구하고, 이러한 결정을 확실하게 회절, 재생, 오직 TREM2 단백질 (도 1D)을 함유하는 실버 염색하여 나타내었다. 이러한 관찰은 단백질의 생화학 균질성을 제안 (즉, 폴딩 및 번역 후 변형)는, 일부의 경우, 결정화의 성공을위한 전반적인 순도보다 더 중요 할 수있다.
결정화에 더하여, 본 시스템은 구조적 및 기능적 연구를위한 강력한 도구를 제공한다. 그것은 기본적으로 당화 단백질을 생산하고 크기 배제 크로마토 그래피 (그림 1E, F)에 의해> 95 %의 순도를 달성하기 위해 이용된다. solutio를 도시이 추가적인 정제 단계,N 단백질의 거동은 또한 단백질의 품질을 모니터링하는 이상적인 방법이다. 정제 된 단백질의 분자량에 상응하는 부피로 용출한다 샘플에서 가장 풍부한 종이어야한다. 비정상적 응집 단백질 대량 불안정을 나타내는 단백질 및 단백질 생산 및 정제를 최적화하기위한 실마리를 제공 할 수있다. 또한,이 최종 정제 된 단백질은 이러한 색성 분광법, 열 안정성, 조사 및 단백질 - 리간드 상호 작용을 정량적으로 생물 물리학 실험에 사용하기위한 우수하다. 마지막으로, 당화의 정도를 제어하는 글리 칸에 의존하는 기능을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.
그림 1. 포유 동물 발현 시스템 (A) 방식 HEK 293F 세포 제어 또는 기본 당질과 단백질의 포유류 표현. ( B) NiNTA 정제 hTREM2의 SDS-PAGE는 (레인 2)하기 전의 kifunensine에서와 EndoHf와 (레인 3) 탈 글리코 실화 후 표명했다. NiNTA - 정제 및 탈글 라이코 실화 된 단백질로부터 생성 (C) 결정. 결정화의 입력 (D) 실버 염색 (레인 1) 및 수확 된 결정 (레인 2와 3)의 결정에만 TREM2 포함될 보여준다. TREM2의 (E)는 추가의 정제없이 Kifunensine 293F 세포에서 생성 된 정제 NiNTA TREM2의 크기 - 배제 크로마토 그래피를 사용하여 달성 하였다. 별표 (*)는 분자량 표준 용출 부피를 나타낸다. 단백질 분석 S200 컬럼 (GE)를 이용하여 TBS로 용출시켰다. (F) 크기 배제 정제 TREM2의 SDS-PAGE 분석 : 입력 단백질 (레인 2) 및 절첩 피크 (레인 3). 어떻게 전체 SDS-PAGE에 의해 다양한 얼룩과 높은 겉보기 분자량 실행, 이기종 글리 칸합니다."NK>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
HEK 293F 세포는 번역 후 변형을 필요로하는 단백질의 강력한 생산을 제공한다. 이 시스템은 이황화물, 당화, 그렇지 않으면 더 일상적인 표현 도구를 사용하여 결석 것 인산화를 포함 기본적으로 접힌 단백질의 신속하고 확장 가능한 표현을 할 수 있습니다. 또한,이 시스템은 단순히 여러 플라스미드의 공동 형질 감염에 의해 발현 및 다중 단백질 복합체의 정제를 위해 사용될 수있다. TREM2 외에도,이 시스템은 광범위하게 실험실 (10, 11)에 대한 관심이 다른 단백질과 기능 연구에 사용되어왔다. 포유 동물 세포는 또한 생체 내 실험 또는 입체 의존성 항체를 생성하기 위해 기본적으로 접혀 항원의 생산을위한 무 - 엔도톡신 단백질 발현 최적을 제공한다.
최적의 세포 생존하고 형질 감염 조건은 효율적인 단백질 생산을 위해 가장 중요하다. 더 세포 생존을 위해, 낮은 통로 세포 배양 부스팅세포 배양 물을 보충하고 성장 배지에서 항생제 농도가 감소된다. 수정 된 PEI-TMC-25은 대부분의 단백질과 적절한 절개 효율이; 그러나, 증가 된 형질 전환 효율 감소 세포 독성을 제공 적당한 가격에 사용할 수있는 다른 옵션이 있습니다. 과대 광고 5 (오즈 바이오 사이언스는) 같은 293fectin로, 고가의 형질 전환 시약에 비해 상당히 적은 비용으로, PEI 또는 다른 시약에 비해 수율을 증가시킨다. 시약의 종류와 DNA : 시약 비율이 개별 표현과 원하는 실험의 요구에 대해 최적화 될 수있다.
여기에 기재된 방법은 단백질을 생산하는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 포유 동물 세포는 기본 보호자 폴딩 및 박테리아와 효모에 사용할 수없는 번역 후 변형을 제공합니다. 미디어의 사용을 따라 플라스미드 구조 및 제조에 대한 감소 된 시간은, 직접 변형 될 수의 pH는, baculovir에 우수한 만들곤충 세포에서 미국의 생산; 그리고 마지막으로, 혈청이없는 미디어는 손쉬운 확장 (높은 세포 밀도) 및 부착 293T 세포에 달성하지 정화를 제공합니다. 이 시스템의 주요 제한은 시간과 개별 연구자가 단백질 발현을 저지 할 수있는 확장.
발생하는 가장 일반적인 문제에 대한 문제 해결 옵션이 들어 있습니다.
문제 해결
낮은 단백질 발현이 있으면 2-3 개월 이상 세포를 계대 293F 피한다. 감소 세포 건강에 장기간 계대 결과는 느린 배로 배에 반영 크게 단백질 발현을 감소시켰다. 세포 성장은 매일 모니터링해야 더 이상 매일 배가되지 문화는 폐기해야합니다. 세포 생존 세포를 계대 배양하는 동안 첨가제를 사용함으로써 개선 될 수있다. / DL 세포 밀도는 2 백만 / ㎖를 초과하지 않아야 400-600 mg을 배양 농도를 확인하기 위해 포도당을 모니터링세포 생존 능력은 트리 판 블루 배제로 ≥98 %이어야한다. ml의 50 만 /에 고밀도 세포를 희석하고 O / N 형질 전환하기 전에 두 번 할 수 있습니다. (1 μg의 DNA의 범위 이내 1.5에서 6 사이 μL 시약) DNA : 트랜 스펙 션 시약의 다른 비율을 이용하여 형질 전환을 최적화. 이것은 2 mL를 6- 웰 플레이트에서 배양 및 면역 측정 결과를 사용하여 수행 할 수있다. 단백질 발현과 급격히 저하되고 있는지 나타낼 수 12 시간 시점을하고; 단백질이 상청액 분획에서는 관찰되지 않으면 세포 용 해물을 확인. 분비하지 잘못 폴딩 된 단백질은 여전히 면역에 의한 세포 용 해물에 명백 할 것이다.
니켈 NTA 유지율이 낮은 경우, 즉, 단백질, 관류 열 결합 후 남아 신선한 수지를 사용한다. 이 또한 비특이적 결합을 증가하지만 8.5 시료의 pH가 증가하면, 강한이 수지에 결합 될 것입니다. 4 °에서 / N 수지 O 바인딩 샘플 및 배치를 집중하는 것은있을 C앞의 Ni-NTA 정화 복구 단백질 ~ 5 배 증가의 원인이 될 수 있습니다. 6His 태그 인한 단백질의 삼차 구조에 액세스 할 수없는 경우, 다른 말단에 복제하려고. 또는, 그의 잔기 높은 친 화성이 코발트 계 수지를 사용한다.
단백질 집계 및 / 또는 정제 동안 침전 경우, 니켈 NTA에 10 % 글리세롤을 추가 세척 및 용출 버퍼에 의해 용해도를 증가. ° C를 실온에서 대신 4 니켈 친 화성 컬럼을 실행합니다. pH와 소금 / 솔루션에서 단백질의 안정성을 증가 첨가물을 선별하기 위해 시차 주사 fluorimetry (12)를 사용합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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