Introduction
Понимание структуры белка на атомном уровне является ключевым для выявления молекулярной основы биологических путей и заболеваний. Рентгеновский белок кристаллографии наиболее широко используемый / применимым методом для определения макромолекулярных структур. Основная задача этого метода является получение достаточного количества правильно уложенного, чистого белка. Это становится проблемой, особенно при работе с секретируемых белков млекопитающих, которые подвергаются конкретные пост-трансляционных модификаций.
Бактериально-выраженные белки являются основным источником белков, нанесенных кристаллизовались в базе данных белковых 1. Бактериальные системы экспрессии в значительной степени предпочтительны, поскольку они быстро, недорого и, как правило, высокие урожаи белка. Тем не менее, внеклеточные домены белков млекопитающих, выраженные в бактерий часто не правильно уложенный, в котором требуется случай повторной укладки и обширные очистки шаги для получения гомогенного FOlded белок. Кроме того, многие белки млекопитающих требуют посттрансляционную гликозилирование достичь правильное сворачивание 2. Хотя выражение и гликозилирование в дрожжевых клетках насекомых или может преодолеть проблему складывания, после трансляционные модификации, в том числе гликозилирования, существенно отличаются от тех, клеток млекопитающих 3, уступая белки с неправильными или неоднородных модификаций.
Клетки млекопитающих выразить всю необходимую молекулярные механизмы для обеспечения надлежащего пост-трансляционных модификаций и складывание; Однако, эти системы экспрессии обычно не предпочитают большинство лабораторий, в связи с ограниченными выходами и высокой стоимости реагентов и расходных материалов. Полиэтиленимин (PEI), стандартный трансфекции реагент является относительно дешевым, но накладывает значительный цитотоксичность и низкую эффективность трансфекции, в результате увеличения расходов в клеточной ДНК, СМИ, и культивирование оборудования. Многие альтернативы PEI являются непомерно дорогими. Мы обращаемсяэти проблемы, описывающая комбинацию улучшенных средств для культивирования клеток и химически модифицированные PEI для быстрого и относительно недорогого способа выражения секретируемых белков млекопитающих с последующей одной стадии очистки. Это надежный метод дает достаточные урожаи для функциональных и биохимических исследований 4, а в некоторых случаях, приводит белка поддаются кристаллизации без дополнительной очистки.
Этот протокол описывает несколько методов, чтобы максимизировать выражение и выход для секретируемых белков млекопитающих в человеческих эмбриональных почек (НЕК) 293F клеток, выращенных в суспензии. Эффективность трансфекции (и стоимость), производство белка и очистку всех значительно усиливается после этого протокола. PEI модифицирован добавлением карбаматов путем одностадийного реакции с раскрытием кольца (PEI-ТМС-25, синтез и свойства описаны подробно в работе 5) значительно улучшает эффективность трансфекции, снижает цитотоксичность от катионныхМембрана нарушение и, соответственно, снижает затраты на эксперимент. Кроме того, жизнеспособность клеток и экспрессию белка значительно улучшены с добавлением культуры добавки для снабжения глюкозы и витаминов. Важно для производства гликозилированных белков, лечение с kifunensine, нетоксичный химический ингибитор маннозидаза I, производит белки с определенными, незрелых гликанов, которые могут быть удалены с помощью эндогликозидазой EndoHf с получением белков с одним N-ацетилглюкозамина в месте полнометражный N-связан Glycan 6. Наконец, секреция белков в бессывороточной, химически определенной среде позволяет быстро, и облегчает очистку для структурных и биохимических исследований. Пошаговый никель-нитрилотриуксусная кислота (Ni-NTA) очистки смолы удаляет большинство видов загрязнения в надосадочной жидкости и в некоторых случаях, может привести белок достаточной чистоты для кристаллизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Производство миллиграмм количества плазмидной ДНК для крупномасштабных переходных трансфекции
- Клонирование интересующий белок в с высоким числом копий вектора экспрессии млекопитающих с использованием сайта рестрикции клонирования или другой подходящий метод.
- Для получения оптимальных результатов используйте pHLsec 7 вектор, который имеет встроенный С-концевой 6His-тега, сильный промотор последовательность Козака и оптимизированы сигнал секреции.
- Преобразование плазмиды на компетентных клеток.
- Добавьте 20 мкл компетентных клетках E.coli на 1 мкг плазмидной ДНК и инкубируют на льду в течение 30 мин.
- Теплового шока клетки при 42 ° С в течение 35 сек, затем инкубируют на льду в течение 2 мин.
- Добавить 300 мкл ростовой среды микробной (SOC) и инкубируют при 37 ° С в течение 45 минут, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
- Пластина клеток на агар с соответствующим выбором антибиотика.
- Использование 100 мкг / мл карбенициллина если плазмида в векторе pHLsec,
- Культура колонии в 250 мл бульона Луриа (LB), дополненной 100 мкг / мл антибиотика (карбенициллин) O / N при 37 ° С, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
- Очищают ДНК из культуры с помощью Привет-Speed плазмиды Maxi Kit в соответствии с протоколом производителя.
- Элюции ДНК в буфере ЕВ (10 мМ Трис-Cl, рН 8,5), а буфера ТЕ.
- Алиготе очищенной плазмиды в количестве, необходимом для трансфекции и хранить при температуре -20 ° С.
2. Масштабная Культура и переходных Трансфекцию 293F клеток
- Дополнение 1 л 293F носители с 10 мл глютамина и 5 мл ручка / Strep (как 100х). Хранить при 4 ° С. 5 мл ручка / Strep является достаточной прочности в бессывороточной условиях, и снижение концентрации антибиотика повышает жизнеспособность клеток в течение трансфекции, который повышает урожайность белка.
- Культура 293F клетки в 300 мл среды в 1 л поликарбоната с толку колб Эрленмейера вентилируемой крышкой сс при 37 ° С с 8% CO 2, при встряхивании в стандартном инкубаторе тканевых культур.
- Развести клетки до 5 × 10 5 / мл плотности за один день до трансфекции.
- В день трансфекции, дополнение культуральной среды путем добавления 10% объема 2% вес / объем Cell Boost в 293F СМИ.
- Измерьте концентрацию глюкозы с помощью монитора глюкозы в соответствии с инструкциями изготовителя и использовать добавки, как необходимо для достижения концентрацией глюкозы 500 мг / дл.
- Добавить kifunensine (1 мкг / мл конечная концентрация) на этом этапе контролировать гликозилирования белков.
- Рассчитать объем ДНК, необходимые для мкг плазмиды 1 на 1 × 10 6 клеток. В стерильных условиях, разбавленной ДНК в 5 мл бессывороточной среды.
- Рассчитать объем реагента для трансфекции, необходимых для 1 мкг плазмиды на 2 мкл реагента для трансфекции. В стерильных условиях, разбавленные реагента для трансфекции (PEI-ТМС-25) в 5 мл бессывороточной среды.
- Добавитьтрансфекции реагента в раствор ДНК с шагом в 1 мл, смешивая мягко. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре реагент-ДНК комплексов с образованием. Затем добавьте раствор на клетках в каплям моды.
- Разрешить трансфицированные клетки, чтобы выразить белка для 72-96 часов. Дополнение с ~ 10% объема Cell Boost СМИ ежедневно или по мере необходимости, чтобы держать глюкозы чтения 400-600 мг / дл.
3. Очистка
- Декантировать культуру в центрифужную колбу, центрифуги в течение 20 мин при 1300 х г для осаждения клеток и затем собирают супернатант. При необходимости вращаться во второй раз, и / или использовать фильтр 0,22 мкм уточнить супернатант.
- Добавить 10% объема 10x Ni-NTA связывания буфер (1,5 М NaCl, 0,5 МК 2 HPO 4, 0,1 М Трис рН 8,5, 50 мМ имидазола).
- Подготовка колонки тяжести добавлением 2 мл Ni-NTA суспензии в колонне и уравновешивания с 10 объемами колонки (CV) 1х буфере для связывания. Если это возможно, сделать все шаги столбцов в 4 ° C в помещении. АльтернативныеЭли, холод белка и все буферы на льду перед шагом колонны, и держать белок и собрал проточный на льду.
Примечание: Ni-NTA суспензию 50% смолы по объему и указано связывающая способность производства составляет 50 мг / мл. Бусины Ni-NTA может быть повторно загружают для многократного использования - Поток супернатант через смолу и собирать проточные. Повторите этот шаг.
- Промыть 10 CV промывочного буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ К 2 НРО 4, 20 мМ имидазола рН 8).
- Элюируют белок в 5 CV буфера для элюции из (мМ NaCl 300, 50 мМ К 2 НРО 4, 250 мМ имидазола рН 8).
- Если дегликозилирование требуется:
- Для конечного объема 0,5 мл, концентрат элюат с 0,43 мл с помощью центрифугирования концентратор. Если образования осадка, гранул любой мусор центрифугированием при 16000 х г и 4 ° С.
- Добавить 50 мкл 500 мМ Na-цитрат, рН 5,5.
- Добавьте 20 мкл EndoHf (1 х 10 6 ед / мл). Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
НеE: Фермент работает оптимальным образом при 37 ° С, что может привести к концентрированного белкового агрегировать. Продлить инкубацию RT, если дегликозилирование, оценивается SDS-PAGE или иммуноблоттинга является неполным. Фермент не обладают активностью при 4 ° С. - Чтобы удалить EndoHf: Промыть 3 раза амилозы смолы в фосфатно-солевом буфере (PBS) или конечного буфера хранения. Инкубируйте белок с смолы в течение 1 ч при 4 ° С. Спин 5 мин при 1000 мкг в гранулах бусы, чтобы и собирать супернатант.
- Концентрат белка с использованием соответствующего молекулярного веса центрифугирования фильтр среза и буфер обмена в буфер хранения (150 мм NaCl и 20 мМ HEPES, рН 7,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом следует результатов этого выражения системы, прилагаемой к домену, секретируемый иммуноглобулин 13 кДа (Ig) от человеческого белка рецептора запуска выраженной миелоидных клеток (2 hTREM2 остатки 19-132). TREM2 тип I трансмембранный белок, содержащий внеклеточный домен одного Ig, который имеет две дисульфидные связи и два N-связанных сайта гликозилирования. В отличие от многих других белков 8 доменных Ig, TREM2 не поддаются повторной укладки от бактериальных тел включения 9. После мутагенеза подтвердили N-связанные гликаны необходимы для правильной экспрессии и сворачивания. Для облегчения структурные и функциональные исследования, TREM2 был введен в вектор pHLsec с С-концевым 6His-меткой 7 с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Кратковременная экспрессия в HEK293F клетках, обработанных kifunensine дали белок, который очищают с помощью Ni-NTA-хроматографии (Фигура 1В, дорожка 2) и образец затем дегликозилирован производить NatiVely сложить, гомогенного белка (рис 1B, дорожка 3). 293F выражение TREM2 производится 5-10 мг / л (5-10μg / млн трансфицированных клеток). После буфера обмена в буфер хранения, этот белок кристаллизуют (Фиг.1С). Несмотря на заключительном чистоты около 80%, эти кристаллы надежно воспроизводить, дифрагированного и были показаны серебра-пятно содержать только TREM2 белок (рис 1D). Это наблюдение показывает, биохимический однородность белка (т.е., складывающиеся и пост-трансляционной модификации) может, в некоторых случаях может быть более важным, чем общее чистоты успеха кристаллизации.
В дополнение к кристаллизации, эта система обеспечивает надежную инструмент для структурных и функциональных исследований. Это использовано для получения изначально гликозилированного белка и достичь> 95% чистоты гель-хроматографии (рис 1E, F). Эта дополнительная стадия очистки, которая показывает SOLUTIOн поведение белка, также идеальный способ для мониторинга качества белка. Очищенный белок элюируют при следует объеме, соответствующем его молекулярной массы, а должны быть наиболее распространенным видом в образце. Аномально большие количества агрегированного белка может указывать на нестабильную белок и обеспечить подсказки для оптимизации производства белка и очистку. Кроме того, этот финал очищенный белок превосходит для использования в количественном биофизических экспериментов, таких как КД-спектроскопии, тепловой стабильности и следственных белок-лиганд. Наконец, регулирования степени гликозилирования обеспечивает надежную инструментом для изучения гликанов-зависимых функций.
Рисунок 1. млекопитающих системе экспрессии: (А) Схема для экспрессии млекопитающих белков с контролируемым или родной гликозилирования в НЕК 293F клеток. ( Б) в ДСН-ПААГ очищенного NiNTA hTREM2 экспрессируется под kifunensine показанного ранее (дорожка 2) и после (дорожка 3) дегликозилированием с EndoHf. (C) Кристаллы, полученные из очищенной NiNTA-и дегликозилированного белка. (D) окрашивания серебром ввода кристаллизации (дорожка 1) и собирали кристаллы (дорожки 2 и 3), показывает кристаллы содержат только TREM2. (Е) Дальнейшая очистка TREM2 была достигнута с помощью гель-фильтрацией на NiNTA очищенного TREM2 полученного в 293F клеток без Kifunensine. Звездочки (*) указывают объемы элюирования стандартов молекулярной массы. Белки элюировали в TBS использованием аналитической колонки S200 (GE). (F), анализ ДСН-ПААГ гель-очищенного TREM2: вход белка (дорожка 2) и сложить пика (полоса 3). Обратите внимание, как полный, гетерогенные гликаны работают на более высоком кажущейся молекулярной массой с широким мазком по SDS-PAGE.НК "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
НЕК 293F клетки предлагают надежную продукцию белков, требующих пост-трансляционные модификации. Эта система позволяет быстро и масштабируемую выражение изначально свернутых белков, содержащих дисульфидов гликозилирования и фосфорилирования, что в противном случае будет отсутствовать с помощью рутинных больше инструментов экспрессии. Кроме того, эта система может быть использована для экспрессии и очистки нескольких белковых комплексов, просто ко-трансфекции нескольких плазмид. Кроме того, TREM2, эта система широко используется для функциональных исследований с другими белками интерес в лаборатории 10,11. Клетки млекопитающих также предлагаем эндотоксина белка выражение для оптимального естественных условиях экспериментов в или для производства изначально сложенными антигенов генерировать конформационно-зависимые антитела.
Оптимальные жизнеспособность клеток и трансфекции условия являются наиболее важным для эффективного производства белка. Для лучшего жизнеспособности клеток, культуры низкого прохода клеток усиливаютсяс сотового культуры добавок и концентрации антибиотика в СМИ роста снижается. Модифицированный PEI-ТМС-25 имеет подходящую эффективность перерезки с большинства белков; Однако, есть и другие варианты, доступные в умеренной цене, которые предлагают повышенную эффективность трансфекции и снижение цитотоксичности. Hype 5 (Оз Bioscience) повышает урожайность по сравнению с PEI или других реагентов, при значительно сниженной стоимости по сравнению с более дорогими реагентов трансфекции, такие как 293fectin. Тип реагента и ДНК: соотношение реагентов может быть оптимизирована для отдельных выражений и нужд желаемого эксперимента.
Метод, описанный здесь имеет ряд преимуществ перед другими методами производства белка. Клетки млекопитающих предложить нативную шаперонную складывание и пост-трансляционных модификаций, недоступные бактерий и дрожжей. Снижение времени на строительство плазмиды и подготовки, по использованию средств массовой информации, рН которого может быть непосредственно изменены, чтобы она превосходит baculovirнам производство, основанное на в клетках насекомых; и, наконец, свободную от сыворотки среду предлагает легкое масштабирование (более высокую плотность клеток) и очистка не достижимый в адгезивных клеток 293Т. Главный ограничение этой системы является только время и масштабировать отдельные исследователь может совершить экспрессии белка.
Включенная ниже устранении варианты для наиболее распространенных проблем, с которыми сталкиваются.
Исправление проблем
Если есть выражение низким содержанием белка, избегать пассажей 293F клетки дольше, чем 2-3 месяцев. Длительные результаты пассажей в сниженной здоровья клеток отражение в медленных удвоения времени и значительно сократить экспрессии белка. Рост клеток должны контролироваться ежедневно и культуры больше не удвоение ежедневно должны быть отброшены. Жизнеспособность клеток может быть улучшено с помощью культуры в то время пассирования добавки клетки. Мониторинг глюкозы, чтобы обеспечить концентрацию культуры 400-600 мг / дл Плотность клеток не должна превышать 2 млн / мл иЖизнеспособность клеток должна быть ≥98% по трипанового синего. Развести густые клетки 0,5 млн / мл и позволит удвоить O / N до трансфекции. Оптимизация трансфекции с использованием различных соотношений реагента для трансфекции ДНК: (в пределах 1 мкг ДНК: 1,5-6 мкл реагента). Это может быть сделано с помощью 2 мл культуры в 6-луночный планшет и выход, измеренный с помощью иммуноблоттинга. Выполнение 12 ч временные точки могут указывать, если белок и выражается быстро деградирует; проверить клеточного лизата, если белок не наблюдается в надосадочной фракции. Неправильно свернутые белки, которые не в состоянии секретируется, по-прежнему будут очевидны в клеточного лизата с помощью иммуноблоттинга.
Если удержание Ni-NTA низкий, т.е. белок остается в проточной колонки после связывания, используйте свежие смолы. Повышение рН образца до 8,5 приведет к более сильным связывания со смолой, хотя это также увеличивает неспецифическое связывание. Концентрация образца и партию связывания смолы O / N на 4 ° C будетносовой очистки Ni-NTA может привести к ~ 5x увеличением восстановленного белка. Если 6His-тег недоступны из-за третичной структуры белка, клонирование попробовать на другом конце. Кроме того, использование кобальта смола, которая имеет более высокое сродство к Его остатков.
Если белковые агрегаты и / или осадков во время очистки, повышают растворимость, добавляя 10% глицерина в Ni-NTA мыть и элюирование буферы. Запуск столбцы никель сродства вместо при комнатной температуре 4 ° С. Использование дифференциальной сканирующей флуориметрии 12 для скрининга рН и соли / добавки, повышающие стабильность белка в растворе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
