Introduction
Förstå proteinstruktur på atomnivå är nyckeln till att avslöja den molekylära grunden för biologiska vägar och sjukdomar. X-ray proteinkristallografi är den mest använda / användbar metod för bestämning av makromolekylära strukturer. Den största utmaningen med denna metod är att få tillräckliga mängder av ordentligt vikta, rent protein. Detta blir ett problem i synnerhet när man arbetar med utsöndrade däggdjursproteiner, vilka undergår specifika posttranslationella modifieringar.
Bakteriellt uttryckta proteiner är den primära källan för kristalliserade proteiner deponeras i Protein Data Bank 1. Bakteriella uttryckssystem är till stor del föredragna eftersom de är snabba, billiga och vanligen producera höga utbyten av protein. Emellertid extracellulära domänerna av däggdjursproteiner som uttrycks i bakterier är ofta inte korrekt veckad, i vilket fall återveckning och omfattande reningssteg krävs för att erhålla homogent folded proteinet. Dessutom har många däggdjursproteiner kräver posttranslationell glykosylering för att uppnå rätt vikning 2. Även uttryck och glykosylering i jäst eller insektsceller kan övervinna fällbara problemet, post-translationella modifieringar, inklusive glykosylering, skiljer sig markant från de däggdjursceller 3, vilket ger proteiner med felaktiga eller icke-homogena modifieringar.
Däggdjursceller uttrycker alla nödvändiga molekylära maskiner för att säkerställa korrekt posttranslationella modifieringar och vikning; emellertid är dessa expressionssystem inte typiskt föredras av de flesta laboratorium, på grund av begränsade utbyten och höga kostnader för reagenser och förbrukningsvaror. Polyetylenimin (PEI), är en standard transfektionsreagens relativt billiga men lägger stor cytotoxicitet och låg transfektionseffektivitet, vilket resulterar i ökade kostnader i cell media, DNA, och odling av utrustning. Många alternativ till PEI är oöverkomligt dyra. Vi vänder oss tilldessa frågor genom att beskriva en kombination av förbättrade cellodlingsverktyg och kemiskt modifierad PEI för snabb och relativt billig metod för expression av utsöndrade däggdjursproteiner, följt av ett steg rening. Denna robusta metod ger tillräcklig avkastning för funktionella och biokemiska studier 4, och i vissa fall resulterar i protein mottaglig för kristallisering utan ytterligare rening.
Detta protokoll beskriver flera tekniker för att maximera uttryck och ge för utsöndrade däggdjursproteiner i humana embryonala njur (HEK) 293F celler som odlas i suspension. Transfektionseffektivitet (och kostnad), proteinproduktion och rening är alla förbättras avsevärt genom att följa detta protokoll. PEI modifieras genom tillsats av karbamater genom ett enda steg ringöppningsreaktion (PEI-TMC-25, syntes och egenskaper beskrivs i detalj i ref 5) förbättrar avsevärt transfektionseffektivitet, minskar cytotoxiciteten från katjoniskamembran störningar och därmed minskar experimentkostnader. Vidare är cellviabiliteten och proteinuttryck förbättrats avsevärt med tillsats av odlingstillskott att leverera glukos och vitaminer. Viktigt för produktion av glykosylerade proteiner, behandling med kifunensine, en icke-giftig kemikalie hämmare av mannosidas I producerar proteiner med definierade, omogna glykaner, som kan avlägsnas genom endoglykosidas EndoHf att ge proteiner med en enda N-acetylglukosamin i stället för en fullängds N-kopplad glykan 6. Slutligen utsöndringen av proteiner till ett serumfritt, kemiskt definierat medium tillåter snabb och enkel rening för strukturella och biokemiska studier. Enda steg nickel nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) harts rening avlägsnar huvuddelen av kontaminerande arter i supernatanten och, i vissa fall, kan ge proteinet med tillräcklig renhet för kristallisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion av milli Mängder av plasmid DNA för Storskalig Transient transfektion
- Klona proteinet av intresse in i ett högt kopietal däggdjursexpressionsvektor med användning av restriktionsstället kloning, eller annan lämplig teknik.
- För bästa resultat, använd pHLsec 7 vektor, som har en inbyggd C-terminal 6His-tagg, en stark promotor Kozak-sekvens och en optimerad utsöndringssignal.
- Omvandla plasmiden på kompetenta celler.
- Tillsätt 20 pl av kompetenta E. coli-celler på ett ^ g av plasmid-DNA och inkubera på is under 30 minuter.
- Värmechocks celler vid 42 ° C under 35 sek, sedan inkubera på is under 2 minuter.
- Tillsätt 300 ul av mikrobiell tillväxt-medium (SOC) och inkubera vid 37 ° C under 45 minuter, skakning vid 220 varv per minut.
- Plate celler på agarplatta med lämplig antibiotika val.
- Använd 100 | ig / ml karbenicillin om plasmiden är i pHLsec vektorn.
- Kultur kolonier i 250 ml Luria-buljong (LB) medium med tillsats av 100 | ig / ml antibiotikum (karbenicillin) O / N vid 37 ° C, skakning vid 220 varv per minut.
- Rena DNA från kultur med hjälp av Hi-Speed Plasmid Maxi Kit enligt tillverkarens protokoll.
- Eluera DNA i buffert EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), i stället för buffert TE.
- Alikvotera den renade plasmiden vid belopp som behövs för transfektion och förvara vid -20 ° C.
2. Storskaliga Kultur och Transient transfektion av 293F-celler
- Supplement 1 L 293F-media med 10 ml glutamin och 5 ml Pen / Strep (båda 100x). Förvaras vid 4 ° C. 5 ml pen / strep är en tillräcklig hållfasthet i serumfria betingelser och den reducerade antibiotiska koncentrationen förbättrar cellviabilitet under transfektion, vilket förbättrar proteinutbyten.
- Kultur 293F-celler i 300 ml medium i en L polykarbonat bafflad Erlenmeyer-kolvar med ventilerade locks vid 37 ° C med 8% CO2, under skakning i en standard vävnadsodlingsinkubator.
- Späd celler till 5 x 10 5 / ml densitet en dag före transfektion.
- På dagen för transfektion, komplettera odlingsmediet genom tillsats av 10% volym av 2% vikt / volym cell Boost i 293F medier.
- Mät glukoskoncentration med hjälp av en glukosmätare enligt tillverkarens instruktioner och använda kosttillskott som behövs för att uppnå en glukoskoncentration av 500 mg / dL.
- Lägg kifunensine (1 | j, g / ml slutkoncentration) i detta steg för att styra protein glykosylering.
- Beräkna volymen av DNA som krävs för 1 ng plasmid per 1 x 10 6 celler. Under sterila betingelser, utspädd DNA i 5 ml serumfritt medium.
- Beräkna volymen av transfektion reagens som krävs för en ug plasmid per 2 pl transfektionsreagens. Under sterila betingelser, utspädd transfektionsreagens (PEI-TMC-25) i 5 ml serumfritt medium.
- Lägg tilltransfektionsreagens i DNA-lösning i 1 ml steg, blanda försiktigt. Inkubera under 30 minuter vid RT i reagens-DNA-komplex för att bilda. Sedan till lösningen på cellerna i ett droppvis sätt.
- Tillåt transfekterade celler för att uttrycka protein för 72-96 timmar. Komplettera med ~ 10% volym Cell Boost Media dagligen, eller som krävs för att hålla glukos läsa 400-600 mg / dl.
3. Rening
- Dekantera kulturen till en centrifug-kolv, centrifugera i 20 min vid 1300 xg för att pelletera cellerna och därefter uppsamla supernatanten. Om så är nödvändigt, snurra en andra gång och / eller använd 0,22 | im filter för att klargöra supernatanten.
- Lägg 10% volym 10x Ni-NTA-bindningsbuffert (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris, pH 8,5, 50 mM imidazol).
- Förbered en gravitationskolonn genom att tillsätta 2 ml Ni-NTA-uppslamningen i en kolonn och jämvikt med 10 kolonnvolymer (CV) av 1x bindningsbuffert. Om det är möjligt, göra allt kolumn steg i en 4 ° C rum. Alternatively, kyla protein och alla buffertar på is före kolumn steg, och hålla protein och samlas genomströmning på is.
Obs: Ni-NTA-uppslamning är 50% harts i volymprocent och tillverkning uttalade bindningskapacitet är 50 mg / ml. Ni-NTA pärlor kan re-charged för flera användningsområden - Flödes supernatanten över hartset och samla genomströmning. Upprepa det här steget.
- Tvätta med 10 CV tvättbuffert (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazol pH 8).
- Eluera proteinet i 5 CV av elueringsbuffert (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazol pH 8).
- Om deglykosylering krävs:
- För en slutlig volym av 0,5 ml, koncentrat eluatet till 0,43 ml med hjälp av ett centrifugeringsanrikningsverk. Om fällningar form pelle eventuellt skräp genom centrifugering vid 16 tusen xg och 4 ° C.
- Tillsätt 50 pl av 500 mM Na-citrat pH 5,5.
- Tillsätt 20 pl av EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Inkubera vid rumstemperatur under två timmar.
Intee: Enzymet fungerar optimalt vid 37 ° C, som kan orsaka den koncentrerade protein att aggregera. Förläng RT inkubationen om deglykosylering, bedömt genom SDS-PAGE eller immunoblotting är ofullständig. Enzymet har inte aktivitet vid 4 ° C. - För att ta bort EndoHf: Tvätta amylosharts 3x i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller slutlig buffertlager. Inkubera protein med harts för en timme vid 4 ° C. Spin 5 min vid 1000 xg för att pelletera pärlorna och samla supernatanten.
- Koncentrera protein med hjälp av lämplig vikt cutoff centrifuge filter molekylära och buffertutbytet i lagringsbuffert (150 mM NaCl och 20 mM HEPES pH 7,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Häri följer resultaten av detta expressionssystem tillämpas på en utsöndrad 13 kDa-immunglobulin (Ig) domänen från det humana proteinet utlöser receptor uttryckt på myeloidceller 2 (hTREM2, rester 19-132). TREM2 är ett typ I transmembranprotein innehållande en enda extracellulär Ig-domän som har två disulfidbindningar och två N-kopplade glykosyleringsställen. Till skillnad från många andra Ig domänproteiner 8, TREM2 var inte mottagliga för återveckning från bakteriella inklusionskroppar 9. Efterföljande mutagenes bekräftade N-länkade glykaner krävs för korrekt uttryck och vikning. För att underlätta strukturella och funktionella studier, var TREM2 infördes i pHLsec vektor med en C-terminal 6His-tagg 7 med användning av standardmässiga molekylärbiologiska tekniker. Övergående expression i HEK293F celler behandlade med kifunensine gav protein som renades med Ni-NTA-kromatografi (Figur 1B, bana 2) och provet sedan deglykosylerad att producera natidevis vikta, homogent protein (Figur 1B, spår 3). 293F uttryck av TREM2 producerade 5-10 mg / l (5-10μg / miljoner transfekterade celler). Efter buffert utbyte i buffertminnet, var detta protein kristallise (Figur 1C). Trots den slutliga renhet av ca 80%, dessa kristaller återges på ett tillförlitligt sätt, diffrakterade, och visades av silver-fläcken för att bara innehålla TREM2 protein (Figur 1D). Denna observation antyder den biokemiska homogenitet av proteinet (dvs, vikning och posttranslationella modifieringar) kan, i vissa fall, vara mer kritisk än den totala renheten för kristallisation framgång.
Förutom kristallisation, erbjuder detta system ett kraftfullt verktyg för strukturella och funktionella studier. Det utnyttjas för att producera nativt glykosylerat protein och uppnå> 95% renhet genom storleksuteslutningskromatografi (figur 1E, F). Detta ytterligare reningssteg, som visar Solution beteende av proteinet, är också ett utmärkt sätt att övervaka proteinkvalitet. Det renade proteinet bör eluera vid en volym som motsvarar dess molekylvikt och bör vara den mest förekommande arterna i provet. Onormalt stora mängder aggregerat protein kan tyda instabilt protein och ge ledtrådar för att optimera produktion och rening protein. Dessutom är detta slutliga renade proteinet överlägsen för användning i kvantitativa biofysikaliska experiment såsom cirkulär dikroism-spektroskopi, termisk stabilitet, och undersöka protein-ligand-interaktioner. Slutligen styr graden av glykosylering ger ett kraftfullt verktyg för att studera glycan beroende funktioner.
Figur 1. mammalieexpressionssystem: (A) System för däggdjursexpression av proteiner med kontrollerad eller nativ glykosylering i HEK 293F-celler. ( B) SDS-PAGE av NiNTA-renad hTREM2 uttryckas under kifunensine visad före (bana 2) och efter (fält 3) deglykosylering med EndoHf. (C) Kristaller framställts av NiNTA-renat och deglykosylerat protein. (D) Silverfärgningskristallisationsingång (spår 1) och skördade kristaller (spår 2 och 3) avslöjar kristaller bara innehålla TREM2. (E) Ytterligare rening av TREM2 uppnåddes med användning storleksuteslutningskromatografi av NiNTA-renat TREM2 produceras i 293F-celler utan Kifunensine. Asterisker (*) indikerar elutionsvolymerna för molekylviktsstandarder. Proteiner elueras i TBS med hjälp av en analytisk S200 kolonn (GE). (F) SDS-PAGE-analys av storleksuteslutning-renat TREM2: ingångsprotein (spår 2) och vikta topp (spår 3). Notera hur full, heterogena glykaner drivs vid en högre skenbar molekylvikt med ett brett utstryk genom SDS-PAGE.nk "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK 293F-celler erbjuder robusta produktion av proteiner som kräver post-translationella modifieringar. Detta system möjliggör snabb och skalbar expression av nativt veckade proteiner innehållande disulfider, glykosylering och fosforylering, som annars skulle vara frånvarande användning mer rutinmässiga uttryck verktyg. Dessutom kan detta system användas för expression och rening av multiproteinkomplex att helt enkelt genom samtransfektion av multipla plasmider. Förutom TREM2 har detta system i stor utsträckning använts för funktionella studier med andra proteiner av intresse i labbet 10,11. Mammalieceller erbjuder också endotoxin-fritt protein uttryck optimal för in vivo experiment eller för tillverkning av nativt vikta antigener att generera konformationsberoende antikroppar.
Optimala cellviabilitet och transfektion förhållanden är den mest avgörande för effektiv produktion protein. För bättre cellviabilitet är låg passagecellkulturer ökademed cellodlings kompletterar och antibiotikakoncentrationen i odlingsmediet minskar. Den modifierade PEI-TMC-25 har lämplig transection effektivitet med de flesta proteiner; men det finns andra alternativ till måttlig pris som ger ökad transfektion effektivitet och minskad cytotoxicitet. Hype 5 (Oz Bioscience) ökar utbytena jämfört med PEI eller andra reagens, vid en avsevärt reducerad kostnad jämfört med dyrare transfektionsreagens, såsom 293fectin. Reagenset typ och DNA: reagens förhållanden kan optimeras för individuella uttryck och behoven hos den önskade experimentet.
Den metod som beskrivs här har flera fördelar jämfört med andra metoder för proteinproduktion. Däggdjursceller erbjuder nativ chaperon vikning och posttranslationella modifieringar som inte är tillgängliga för bakterier och jäst. Den reducerade tiden för plasmidkonstruktion och beredning, längs användning av media, vars pH kan direkt ändras, gör den överlägsen baculoviross baserad produktion i insektsceller; och slutligen, erbjuder serumfritt medium enkel skalning (högre celltäthet) och rening inte uppnås till vidhäftande 293T-celler. Den främsta begränsningen med detta system är endast tid och skala den enskilde forskaren är beredd att ta proteinuttryck.
Ingår nedan felsöker alternativ för de vanligaste problemen som uppstått.
Felsökning
Om det är låg proteinuttryck, undvika passage 293F celler längre än 2-3 månader. Förlängda passage resulterar i minskad cell hälsa återspeglas i långsammare fördubblingstider och avsevärt reducerad proteinuttryck. Celltillväxten bör övervakas dagligen och kulturer inte längre fördubbling dagligen ska kasseras. Cellviabilitet kan förbättras med hjälp av kultur tillskott medan passage celler. Övervaka glukos för att säkerställa en kultur koncentration av 400-600 mg / dl Celldensiteten bör inte överstiga 2 miljoner / ml ochcellviabiliteten bör vara ≥98% av trypanblåttexklusion. Späd täta celler till 0.500.000 / ml och låt fördubbla O / N före transfektion. Optimera transfektion med användning av olika förhållanden av transfektionsreagens: DNA (inom intervallet 1 pg DNA: 1,5-6 jil reagens). Detta kan göras med användning av 2 ml kulturer i en 6-brunnsplatta och utsignalen mäts genom immunoblotting. Att göra 12 hr tidpunkter kan indikera om proteinet uttrycks och försämras snabbt; Kontrollera cellysatet om proteinet inte observeras i supernatantfraktionen. Felveckade proteiner, som inte skall utsöndras, fortfarande kommer att vara uppenbara i cellysatet genom immunoblotting.
Om Ni-NTA bevarande är låg, det vill säga fortfarande protein i genomströmning efter kolumn bindande, använder färsk harts. Ökande pH av provet till 8,5 kommer att resultera i starkare bindning till hartset, även om detta kommer också att öka icke-specifik bindning. Koncentrera provet och batch-bindning till harts O / N vid 4 ° C varadärför Ni-NTA rening kan resultera i ~ 5x ökning av utvunna proteinet. Om 6His-taggen är otillgängliga på grund av tertiära strukturen hos proteinet, prova kloning det på andra änden. Alternativt kan du använda Cobalt harts, som har en högre affinitet för sina rester.
Om proteinaggregat och / eller utfällningar under rening, öka lösligheten genom att tillsätta 10% glycerol i Ni-NTA tvätta och elueringsbuffertar. Kör nickelaffinitetskolonner vid RT i stället för 4 ° C. Använd differential scanning fluorimetri 12 för att screena för pH och salt / tillsatser som ökar stabiliteten av proteinet i lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
