Introduction
Inzicht eiwitstructuur op atomair niveau is de sleutel tot het blootleggen van de moleculaire basis van biologische processen en ziekten. X-ray kristallografie eiwit is het meest gebruikte / toepasbare methode voor de bepaling van macromoleculaire structuren. De belangrijkste uitdaging van deze methode is het verkrijgen van voldoende hoeveelheden correct gevouwen, zuiver eiwit. Dit wordt een probleem in het bijzonder bij het werken met uitgescheiden eiwitten van zoogdieren, welke specifieke post-translationele modificaties ondergaan.
Bacterieel tot expressie gebrachte eiwitten zijn de primaire bron van de gekristalliseerde eiwitten gedeponeerd in de Protein Data Bank 1. Bacteriële expressiesystemen zijn grotendeels de voorkeur omdat zij snel, goedkoop en typisch van hoge opbrengsten aan eiwit. Echter, extracellulaire domeinen van zoogdiereiwitten expressie in bacteriën vaak niet goed gevouwen, waarbij opnieuw vouwen en uitgebreide zuiveringsstappen nodig zijn voorliet verkrijgen homogeen folded eiwit. Bovendien, veel zoogdiereiwitten vereisen posttranslationele glycosylering op correcte vouwing 2 bereiken. Hoewel expressie en glycosylering in gist of insectencellen kunnen overwinnen van de problemen vouwen, post-translationele modificaties, zoals glycosylering, verschillen aanzienlijk van die van zoogdiercellen 3, waardoor eiwitten onjuiste of niet-homogene modificaties.
Zoogdierlijke cellen brengen de vereiste moleculaire machinerie te zorgen voor een juiste post- translationele modificaties en vouwen; Echter, deze expressiesystemen niet typisch voorkeur van de meeste laboratoria, vanwege de beperkte opbrengsten en hoge kosten van reagentia en hulpstoffen. Polyethyleenimine (PEI), een standaard transfectie reagens is relatief goedkoop, maar legt aanzienlijke cytotoxiciteit en lage transfectie efficiëntie, resulterend in verhoogde kosten celmedia, DNA en kweken materiaal. Veel alternatieven voor PEI zijn onbetaalbaar. We pakkendeze problemen door het beschrijven van een combinatie van verbeterde celcultuur gereedschappen en chemisch gemodificeerde PEI voor de snelle en relatief goedkope werkwijze voor de expressie van gesecreteerde zoogdiereiwitten, gevolgd door enkelvoudige stap zuivering. Deze robuuste methode geeft voldoende opbrengst van functionele en biochemische studies 4, en in sommige gevallen resulteert in eiwitten vatbaar voor kristallisatie zonder verdere zuivering.
Dit protocol beschrijft verschillende technieken om expressie te optimaliseren en de opbrengst van uitgescheiden zoogdiereiwitten in humane embryonale nier (HEK) 293F cellen gekweekt in suspensie. Transfectie-efficiëntie (en kosten), eiwitproductie en zuivering zijn allemaal sterk verbeterd door het volgen van dit protocol. PEI gemodificeerd door de toevoeging van carbamaten door middel van een eenstaps ringopeningsreactie (PEI-TMC-25, synthese en eigenschappen in detail beschreven in referentie 5) verbetert transfectie-efficiëntie, vermindert de cytotoxiciteit van kationischemembraan verstoring en dienovereenkomstig vermindert experiment kosten. Bovendien worden cellevensvatbaarheid en eiwitexpressie sterk verbeterd met de toevoeging van cultuur aanvullingen op glucose en vitaminen leveren. Belangrijk voor de productie van geglycosyleerde eiwitten behandeling met kifunensine een niet-giftige chemische remmer van mannosidase I, produceert eiwitten met gedefinieerde, onrijpe glycanen die kan worden verwijderd door endoglycosidase EndoHf om eiwitten te leveren met een N-acetylglucosamine in plaats van een full-length N-gelinkte glycan 6. Tenslotte, de uitscheiding van eiwitten in een serumvrij, chemisch gedefinieerd medium maakt een snelle en gemakkelijke zuivering structurele en biochemische studies. Single-step nikkel-nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) hars zuivering verwijdert de meeste verontreinigende soorten in de bovenstaande vloeistof en in sommige gevallen kunnen eiwit voldoende zuiver verkregen voor kristallisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De productie van Milligram hoeveelheden van plasmide DNA voor grootschalige tijdelijke transfectie
- Kloon het eiwit van belang in een groot aantal kopieën zoogdierexpressievector behulp restrictieplaats klonering of andere geschikte techniek.
- Voor optimale resultaten gebruikt pHLsec 7 vector, die een ingebouwde C-terminaal 6His-tag, een sterke promoter Kozak-sequentie en een geoptimaliseerde secretiesignaal.
- Transformeer het plasmide op competente cellen.
- Voeg 20 pi competente E. coli cellen op 1 ug plasmide DNA en incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Heat shock cellen bij 42 ° C gedurende 35 seconden, vervolgens incuberen op ijs gedurende 2 minuten.
- Voeg 300 ul van microbiële groeimedium (SOC) en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten, onder schudden bij 220 rpm.
- Plaat cellen op agar plaat met de juiste antibiotica selectie.
- Met 100 ug / ml carbenicilline indien het plasmide in de vector pHLsec.
- Cultuur kolonies in 250 ml Luria Broth (LB) medium aangevuld met 100 ug / ml antibioticum (carbenicilline) O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 220 rpm.
- Zuiver DNA van cultuur met Hi-Speed Plasmid Maxi Kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Elueer DNA in buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) in plaats van buffer TE.
- Aliquot het gezuiverde plasmide in hoeveelheid die nodig is voor transfectie en bewaar bij -20 ° C.
2. Grootschalige Cultuur en Transient Transfectie van 293F-cellen
- Supplement 1 L 293F medium met 10 ml glutamine en 5 ml Pen / Strep (beide 100x). Bewaar bij 4 ° C. 5 ml Pen / Strep een voldoende sterkte in serumvrije omstandigheden en de verlaagde antibioticumconcentratie verbetert levensvatbaarheid van de cellen gedurende transfectie, welk eiwit opbrengst verbetert.
- Cultuur 293F cellen in 300 ml media in 1 L polycarbonaat verbijsterd erlenmeyers met geventileerde dops bij 37 ° C met 8% CO 2, onder schudden in een standaard weefselkweek incubator.
- Verdun cellen tot 5 x 10 5 / ml dichtheid één dag voor transfectie.
- Op de dag van transfectie supplement kweekmedium door toevoeging van 10% volume van 2% w / v Cell Boost in 293F media.
- Meet glucoseconcentratie met een glucosemonitor volgens de instructies van de fabrikant en gebruikt supplementen nodig is om een glucoseconcentratie van 500 mg / dl te bereiken.
- Voeg kifunensine (1 ug / ml eindconcentratie) in deze stap proteïneglycosylering beheersen.
- Bereken hoeveelheid DNA die nodig is voor 1 ug plasmide per 1 x 10 6 cellen. Onder steriele omstandigheden, verdund DNA in 5 ml serumvrij medium.
- Bereken volume transfectiereagens vereist 1 ug plasmide per 2 pl transfectiereagens. Onder steriele omstandigheden verdunde transfectiereagens (PEI-TMC-25) in 5 ml serumvrij medium.
- Toevoegentransfectiereagens in DNA-oplossing in stappen van 1 ml, voorzichtig mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur reagens-DNA-complexen te vormen. Voeg vervolgens de oplossing op de cellen in een druppelsgewijze manier.
- Sta getransfecteerde cellen om eiwitten te uiten voor 72-96 uur. Aanvullen met ~ 10% celvolume Boost Media dag, of zoals nodig blijven lezen glucose 400-600 mg / dl.
3. Zuivering
- Giet cultuur in een kolf centrifuge gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 1300 xg om cellen te pelletiseren en verzamel de bovenstaande vloeistof. Eventueel spin tweede en / of gebruik 0,22 urn filter om supernatant te verduidelijken.
- Voeg 10% volume 10x Ni-NTA bindingsbuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazool).
- Bereid een zwaartekracht kolom door toevoeging van 2 ml Ni-NTA slurry in een kolom en het equilibreren met 10 kolomvolumes (CV) 1x bindingsbuffer. Indien mogelijk, doe alle kolom stappen in een 4 ° C kamer. AlternativEly, chill eiwit en alle buffers op het ijs voordat kolom stap, en houdt eiwit en verzamelde doorstroming op het ijs.
Opmerking: Ni-NTA brij 50% hars vol en verklaard bindingscapaciteit van de fabrikant is 50 mg / ml. Ni-NTA korrels kan worden opgeladen voor meerdere doeleinden - Stromen de bovenstaande vloeistof over de hars en het verzamelen van doorstroming. Herhaal deze stap.
- Wassen met 10 CV wasbuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazol pH 8).
- Elueer het eiwit in 5 CV elutiebuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazol pH 8).
- Indien deglycosylatie vereist:
- Voor een eindvolume van 0,5 ml, concentraat eluaat 0,43 ml via een centrifugatie concentrator. Indien neerslaat vorm pellet vuil door centrifugatie bij 16000 xg en 4 ° C.
- Voeg 50 ul van 500 mM Na-citraat pH 5,5.
- Voeg 20 ul van EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
NietE: Het enzym werkt optimaal bij 37 ° C, hetgeen kan de geconcentreerde proteïneoplossing te aggregeren. Verleng de RT incubatie, indien deglycosylatie, bepaald door SDS-PAGE en immunoblotting, onvolledig. Het enzym heeft geen activiteit bij 4 ° C. - Om EndoHf verwijderen: Wash amylosehars 3x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of definitieve opslag buffer. Incubeer eiwit met hars gedurende 1 uur bij 4 ° C. Spin 5 min bij 1000 xg om kralen pellet en verzamel de bovenstaande vloeistof.
- Concentreer eiwit met behulp van geschikte moleculair gewicht cutoff centrifugeren filter en buffer uitwisseling in opslag buffer (150 mM NaCl en 20 mM HEPES pH 7,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hierbij volgt de resultaten van dit expressiesysteem toegepast op een 13 kDa uitgescheiden immunoglobuline (Ig) domein van het humane eiwit triggering receptor tot expressie gebracht op myeloïde cellen 2 (hTREM2, residuen 19-132). TREM2 is een type I transmembraan eiwit dat een enkel extracellulair Ig-domein dat twee disulfidebindingen en twee N-gebonden glycosyleringsplaatsen heeft. In tegenstelling tot veel andere Ig-domein eiwitten 8, TREM2 was niet ontvankelijk voor hervouwing uit bacteriële inclusielichamen 9. Daaropvolgende mutagenese bevestigde N-gekoppelde glycanen zijn vereist voor de juiste expressie en vouwing. Structurele en functionele studies te vergemakkelijken, werd TREM2 geïntroduceerd in de pHLsec vector met een C-terminaal 6His-tag 7 middels standaard moleculair biologische technieken. Tijdelijke expressie in HEK293F cellen behandeld met kifunensine leverde eiwit dat werd gezuiverd door Ni-NTA chromatografie (figuur 1B, laan 2) en het monster werd vervolgens gedeglycosyleerde nati producerenvely gevouwen, homogeen eiwit (Figuur 1B, laan 3). 293F expressie van TREM2 geproduceerd 5-10 mg / L (5-10μg / miljoen getransfecteerde cellen). Na het uitwisselen van buffer in de opslagbuffer, was dit eiwit gekristalliseerd (figuur 1C). Ondanks de uiteindelijke zuiverheid van ongeveer 80%, deze kristallen betrouwbaar gereproduceerd, afgebogen, en werden door zilver-kleuring slechts TREM2 eiwit (figuur 1D) bevatten. Deze waarneming suggereert de biochemische homogeniteit van het eiwit (dat wil zeggen, vouwing en post-translationele modificaties) kan, in sommige gevallen, meer kritisch dan algehele zuiverheid Kristallisatieoplosmiddel succes.
Naast kristallisatie biedt dit systeem een krachtig hulpmiddel voor structurele en functionele studies. Het wordt benut om native geglycosyleerd eiwit te produceren en het bereiken van> 95% zuiverheid door grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 1E, F). Deze additionele zuiveringsstap, waarbij de solutio toontn gedrag van het eiwit, is ook een ideale manier om te controleren eiwit kwaliteit. Het gezuiverde eiwit moet elueren bij een volume dat overeenkomt met het molecuulgewicht en moeten de meest voorkomende soort in het monster. Abnormaal grote hoeveelheden geaggregeerde eiwit kan instabiel eiwit aan te geven en geven aanwijzingen om eiwitproductie en zuivering te optimaliseren. Bovendien is deze laatste gezuiverde eiwit is superieur voor toepassing bij kwantitatieve biofysische experimenten zoals circulair dichroïsme spectroscopie, thermische stabiliteit en het onderzoeken van eiwit-ligand interacties. Tenslotte regelen van de mate van glycosylering over een handig hulpmiddel voor glycan-afhankelijke functies te bestuderen.
Figuur 1. Mammalian Expression System: (A) Regeling voor zoogdieren expressie van eiwitten met een gecontroleerde of inheemse glycosylering in HEK 293F-cellen. ( B) SDS-PAGE van gezuiverde NiNTA hTREM2 expressie gebracht onder kifunensine getoond vóór (laan 2) en na (laan 3) deglycosylatie met EndoHf. (C) Crystals geproduceerd NiNTA-gezuiverde en gedeglycosyleerde eiwitten. (D) Zilverkleuring kristallisatie ingang (laan 1) en geoogste kristallen (lanen 2 en 3) toont TREM2 kristallen bestaan. (E) Verdere zuivering van TREM2 werd bereikt met behulp grootte-uitsluitingschromatografie van NiNTA gezuiverde TREM2 geproduceerd 293F cellen zonder Kifunensine. Sterretjes (*) geven elutievolume van molecuulgewichtstandaarden. Eiwitten geëlueerd in TBS via een analytische S200 kolom (GE). (F) SDS-PAGE analyse van grootte-uitsluitingschromatografie gezuiverde TREM2: ingang eiwit (laan 2) en gevouwen piek (laan 3). Merk op hoe vol heterogene glycanen op een hogere schijnbare molecuulgewicht met een brede smeer met SDS-PAGE.nk "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK 293F cellen bieden robuuste productie van eiwitten die posttranslationele modificaties. Dit systeem maakt een snelle en schaalbare expressie van natief gevouwen eiwitten die disulfiden, glycosylering, en fosforylering die anders afwezig zou zijn het gebruik van meer routine expressie gereedschappen. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor de expressie en zuivering van multi-eiwit complexen eenvoudig door co-transfectie van meerdere plasmiden. Naast TREM2, heeft dit systeem uitgebreid gebruikt voor functionele studies met andere eiwitten van belang in het lab 10,11. Zoogdiercellen bieden ook endotoxinevrij eiwitexpressie optimaal voor in vivo experimenten of voor de productie van antigenen aan native gevouwen conformatie afhankelijke antilichamen.
Optimale levensvatbaarheid en transfectie celomstandigheden het meest cruciaal voor efficiënte eiwitproductie. Voor een betere levensvatbaarheid van de cellen, zijn low-passage celculturen gestimuleerdmet celkweek supplementen en het antibioticum concentratie in het groeimedium wordt verminderd. De gemodificeerde PEI-TMC-25 is geschikt doorsnijding efficiëntie met de meeste eiwitten; maar er zijn andere opties beschikbaar tegen redelijke prijs die verhoogde transfectie-efficiëntie en verminderde cytotoxiciteit bieden. Hype 5 (Oz Bioscience) verhoogt de opbrengsten in vergelijking met PEI of andere reagentia, tegen een aanzienlijk lagere kosten in vergelijking met duurdere transfectiereagentia, zoals 293fectin. Het type reagens en DNA: reagens verhoudingen kunnen worden geoptimaliseerd voor afzonderlijke uitingen en de behoeften van de gewenste experiment.
De hier beschreven methode heeft een aantal voordelen boven andere werkwijzen van eiwitproductie. Zoogdiercellen hebben natieve chaperone vouwing en post-translationele modificaties beschikbaar voor bacteriën en gist. De kortere tijd voor plasmide constructie en opstelling langs het gebruik van media, waarvan de pH direct kunnen worden aangepast, maakt het superieur aan baculovirons-gebaseerde productie in insectencellen; en tenslotte het serumvrije media biedt facile scaling (hogere celdichtheid) en zuivering niet haalbaar hechtende 293T cellen. De belangrijkste beperking van dit systeem is alleen de tijd en de schaal van de individuele onderzoeker in staat is zich te committeren aan eiwitexpressie.
Hieronder opgenomen zijn opties voor het oplossen van de meest voorkomende problemen ondervonden.
Het oplossen van problemen
Als er laag eiwit expressie, vermijd passage 293F cellen langer dan 2-3 maanden. Langdurige passage leidt tot verlaagde celgezondheid weerspiegeld in tragere verdubbelingstijd en aanzienlijk verminderde eiwitexpressie. Celgroei moet dagelijks worden gecontroleerd en culturen niet meer dagelijks verdubbelen moet worden weggegooid. Levensvatbaarheid van de cellen kan worden verbeterd door kweek supplementen tijdens passage cellen. Monitor glucose een cultuur concentratie van 400-600 mg / dl Celdichtheid mag niet meer dan 2 miljoen / ml te verzekeren enlevensvatbaarheid van de cellen moeten ≥98% bedragen door trypan blauw uitsluiting. Verdunnen dichte cellen 0,5 miljoen / ml en laten verdubbelen O / N voor transfectie. Optimaliseren transfectie met verschillende verhoudingen van transfectiereagens: DNA (binnen het traject van 1 ug DNA: 1,5-6 ul reagens). Dit kan met 2 ml kweken in een 6-wells plaat en de uitvoer bepaald door immunoblotting. Doet 12 uur tijdstippen kan aangeven of het eiwit wordt uitgedrukt en snel afgebroken; Controleer de cellysaat als eiwit niet wordt waargenomen in de bovenstaande fractie. Verkeerd gevouwen eiwitten, die niet worden uitgescheiden, nog steeds duidelijk in het cellysaat door immunoblotting.
Als retentie Ni-NTA is laag, dat wil zeggen eiwit blijft in flow-through na kolom binding, gebruiken verse hars. Toenemende pH van het monster tot 8,5 resulteert in sterkere binding aan de hars, hoewel dit ook zal toenemen aspecifieke binding. Concentreren van het monster en batch binding hars O / N bij 4 ° Cvoorstuk Ni-NTA zuivering kan tot ~ 5x toename teruggewonnen eiwit. Wanneer de 6His-tag niet toegankelijk vanwege tertiaire structuur van het eiwit, probeer kloneren aan de andere terminus. U kunt ook gebruik maken van Cobalt hars, die een hogere affiniteit voor zijn residuen heeft.
Als de proteïneaggregaten en / of precipitaten tijdens de zuivering, oplosbaarheid te verhogen door toevoeging van 10% glycerol in de Ni-NTA wassen en elutie buffers. Run nikkel affiniteitskolommen bij kamertemperatuur in plaats van 4 ° C. Gebruik differentiële scanning fluorimetrie 12 te screenen op pH en zout / additieven die de stabiliteit van het eiwit in oplossing te verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
