Introduction
एक स्तर पर परमाणु प्रोटीन संरचना को समझने के जैविक रास्ते और रोगों के आणविक आधार को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक्स-रे क्रि प्रोटीन अणुओं संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया / लागू विधि है। इस विधि की मुख्य चुनौती ठीक से मुड़ा हुआ, शुद्ध प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त है। यह विशेष रूप से विशिष्ट बाद translational संशोधनों से गुजरना जो स्रावी स्तनधारी प्रोटीन, साथ कार्य करते समय एक मुद्दा बन जाता है।
Bacterially-व्यक्त प्रोटीन प्रोटीन डाटा बैंक 1 में जमा सघन प्रोटीन का प्राथमिक स्रोत हैं। वे सस्ती, उपवास कर रहे हैं और आम तौर पर प्रोटीन की उच्च पैदावार का उत्पादन क्योंकि बैक्टीरियल अभिव्यक्ति सिस्टम काफी हद तक पसंद कर रहे हैं। हालांकि, बैक्टीरिया में व्यक्त स्तनधारी प्रोटीन के बाह्य डोमेन अक्सर ठीक लिए ही ढंग से प्राप्त करने के लिए जो मामले refolding और व्यापक शुद्धि चरणों आवश्यक हैं, मुड़ा नहीं कर रहे हैंlded प्रोटीन। इसके अतिरिक्त, कई स्तनधारी प्रोटीन उचित तह 2 को प्राप्त करने के बाद translational ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता होती है। खमीर या कीट कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और ग्लाइकोसिलेशन तह समस्या को दूर कर सकते हैं, ग्लाइकोसिलेशन सहित बाद translational संशोधनों, गलत या गैर सजातीय संशोधनों के साथ प्रोटीन उपज, स्तनधारी कोशिकाओं 3 के उन लोगों से काफी अलग हैं।
स्तनधारी कोशिकाओं उचित बाद translational संशोधनों और तह सुनिश्चित करने के लिए सभी आवश्यक आणविक मशीनरी व्यक्त; हालांकि, इन अभिव्यक्ति की प्रणाली आम तौर कारण सीमित पैदावार और अभिकर्मकों और उपभोक्ता वस्तुओं की उच्च लागत के लिए, सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा पसंद नहीं कर रहे हैं। Polyethyleneimine (पी), एक मानक अभिकर्मक अभिकर्मक अपेक्षाकृत सस्ता है लेकिन काफी cytotoxicity और कम अभिकर्मक दक्षता, सेल मीडिया, डीएनए में वृद्धि की लागत में जिसके परिणामस्वरूप, और उपकरणों संवर्धन लगाता है। पी के लिए कई विकल्प बेहद महंगे हैं। हम पतामें सुधार सेल संस्कृति उपकरणों का एक संयोजन का वर्णन है और रासायनिक एकल कदम शुद्धि के बाद, स्रावित स्तनधारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए त्वरित और अपेक्षाकृत सस्ती विधि के लिए पी संशोधित करके इन मुद्दों। यह मजबूत विधि कार्यात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन 4 के लिए पर्याप्त पैदावार देता है, और कुछ मामलों में, आगे की शुद्धि के बिना क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी प्रोटीन में यह परिणाम है।
इस प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति को अधिकतम करने और निलंबन में विकसित मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) में स्रावित स्तनधारी प्रोटीन 293F कोशिकाओं के लिए उपज के लिए कई तकनीकों का वर्णन है। अभिकर्मक दक्षता (और लागत), प्रोटीन के उत्पादन और शोधन सब बहुत इस प्रोटोकॉल के बाद से बढ़ा रहे हैं। एक एकल कदम अंगूठी खोलने प्रतिक्रिया के माध्यम से Carbamates के अलावा द्वारा संशोधित पी (पी-टीएमसी -25, रेफरी 5 में विस्तार से वर्णित संश्लेषण और गुण) बहुत अभिकर्मक दक्षता में सुधार cationic से cytotoxicity कम कर देता हैतदनुसार झिल्ली विघटन और प्रयोग की लागत कम कर देता है। इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता और प्रोटीन अभिव्यक्ति बहुत ग्लूकोज और विटामिन की आपूर्ति करने के लिए संस्कृति की खुराक के अलावा के साथ सुधार कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है kifunensine साथ ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन, उपचार के उत्पादन के लिए, Mannosidase मैं की एक गैर विषैले रासायनिक अवरोध करनेवाला, के स्थान पर एक एकल एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन के साथ प्रोटीन की उपज के लिए endoglycosidase EndoHf द्वारा हटाया जा सकता है, जो परिभाषित, अपरिपक्व ग्लाइकान, साथ प्रोटीन का उत्पादन एक पूरी लंबाई की glycan 6 एन से जुड़े। अंत में, एक सीरम मुक्त, रासायनिक परिभाषित माध्यम में प्रोटीन का स्राव संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए तेजी से और सतही शुद्धि की अनुमति देता है। एकल कदम निकल nitrilotriacetic एसिड (नी NTA) राल शुद्धि कुछ मामलों में, क्रिस्टलीकरण के लिए पर्याप्त शुद्धता के प्रोटीन उपज कर सकते हैं, सतह पर तैरनेवाला में प्रजातियों को दूषित और के बहुमत को हटा।
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Protocol
बड़े पैमाने पर क्षणिक अभिकर्मक के लिए प्लास्मिड डीएनए के मिलीग्राम मात्रा 1. उत्पादन
- प्रतिबंध साइट क्लोनिंग, या अन्य उपयुक्त तकनीक का उपयोग कर एक उच्च प्रतिलिपि संख्या स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की प्रोटीन क्लोन।
- इष्टतम परिणामों के लिए, जो pHLsec 7 वेक्टर, उपयोग में निर्मित एक सी टर्मिनल 6His टैग, एक मजबूत प्रमोटर कोज़ाक अनुक्रम और एक अनुकूलित स्राव संकेत।
- सक्षम कोशिकाओं पर प्लाज्मिड रूपांतरण।
- प्लास्मिड डीएनए के एक ग्राम पर सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं के 20 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी झटका कोशिकाओं 35 सेकंड के लिए, फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- माइक्रोबियल विकास मध्यम (समाज) के 300 μl जोड़ें और 220 rpm पर मिलाते हुए, 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- उचित एंटीबायोटिक चयन के साथ अगर प्लेट पर प्लेट कोशिकाओं।
- प्लाज्मिड pHLsec वेक्टर में है, तो 100 माइक्रोग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन प्रयोग करें।
- Luria शोरबा (पौंड) मीडिया की 250 मिलीलीटर में संस्कृति कालोनियों 220 rpm पर मिलाते हुए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोग्राम / एमएल एंटीबायोटिक (कार्बेनिसिलिन) हे / एन के साथ पूरक।
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार हाई स्पीड प्लाज्मिड मैक्सी किट का उपयोग संस्कृति से डीएनए शुद्ध।
- बजाय बफर ते की, बफर ईबी (10 मिमी Tris सीएल, पीएच 8.5) में डीएनए Elute।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मक और दुकान के लिए आवश्यक राशि पर शुद्ध प्लाज्मिड विभाज्य।
293F प्रकोष्ठों के 2. बड़े पैमाने पर संस्कृति और क्षणिक अभिकर्मक
- 10 glutamine के मिलीग्राम और 5 मिलीलीटर पेन / Strep (दोनों 100x) के साथ अनुपूरक 1 एल 293F मीडिया। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 5 मिलीलीटर पेन / Strep प्रोटीन की पैदावार में सुधार, जो सीरम मुक्त शर्तों और कम एंटीबायोटिक एकाग्रता अभिकर्मक दौरान सेल व्यवहार्यता को बेहतर बनाता में पर्याप्त ताकत है।
- 1 एल पॉली कार्बोनेट में 300 मिलीलीटर मीडिया में संस्कृति 293F कोशिकाओं दिए टोपी के साथ Erlenmeyer बोतल चकित8% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर है, एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में मिलाते हुए।
- कोशिकाओं के लिए 5 एक्स 10 5 / एमएल घनत्व अभिकर्मक से पहले एक दिन पतला।
- 293F मीडिया में सेल बूस्ट वी डब्ल्यू / 2% का 10% मात्रा जोड़कर अभिकर्मक, पूरक संस्कृति के माध्यम के दिन पर।
- 500 एमजी / डीएल के एक ग्लूकोज एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए जरूरत के रूप में निर्माता के निर्देशों और उपयोग की खुराक के अनुसार एक ग्लूकोज मॉनिटर का उपयोग कर ग्लूकोज एकाग्रता उपाय।
- प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन नियंत्रित करने के लिए इस कदम पर kifunensine (1 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
- डीएनए की गणना मात्रा 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रति 1 ग्राम प्लाज्मिड के लिए जरूरी है। बाँझ शर्तों के तहत, 5 मिलीलीटर सीरम मुक्त माध्यम में डीएनए पतला।
- अभिकर्मक अभिकर्मक μl 2 प्रति 1 ग्राम प्लाज्मिड के लिए आवश्यक अभिकर्मक अभिकर्मक की मात्रा की गणना। बाँझ शर्तों के तहत, 5 मिलीलीटर सीरम मुक्त माध्यम में अभिकर्मक अभिकर्मक (पी-टीएमसी-25) पतला।
- जोड़ना1 मिलीलीटर वेतन वृद्धि में डीएनए समाधान में अभिकर्मक अभिकर्मक, धीरे मिश्रण। फार्म के लिए अभिकर्मक-डीएनए परिसरों के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। फिर एक बूंद के लिहाज से फैशन में कोशिकाओं पर समाधान जोड़ें।
- कोशिकाओं 72-96 घंटे के लिए प्रोटीन को व्यक्त करने की अनुमति दें। ~ 10% मात्रा सेल बूस्ट दैनिक मीडिया, या के रूप में आवश्यक के साथ पूरक ग्लूकोज 400-600 मिलीग्राम / डीएल पढ़ने रखने के लिए।
3. शुद्धीकरण
- गोली कोशिकाओं और फिर सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए 1300 XG पर 20 मिनट के लिए, एक सेंट्रीफ्यूज फ्लास्क में सेंट्रीफ्यूज संस्कृति छानना। यदि आवश्यक हो, एक दूसरी बार स्पिन और / या सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट करने के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करें।
- 10% मात्रा 10x नी NTA बाध्यकारी बफर जोड़ें (1.5 एम NaCl, 0.5 एमके 2 4 HPO, 0.1 एम Tris पीएच 8.5, 50 मिमी imidazole)।
- एक कॉलम में नी NTA घोल के 2 मिलीलीटर जोड़ने और 1x बाध्यकारी बफर के 10 कॉलम की मात्रा (सीवी) के साथ equilibrating द्वारा एक गुरुत्वाकर्षण स्तंभ तैयार करें। यदि संभव हो तो, एक 4 डिग्री सेल्सियस कमरे में सभी स्तंभ कदम है। ALTERNATIVइली, सर्द प्रोटीन और स्तंभ कदम से पहले बर्फ पर सभी buffers, और प्रोटीन रखने के लिए और एकत्र प्रवाह के माध्यम से बर्फ पर।
नोट: नी NTA घोल मात्रा से 50% राल है और निर्माण के घोषित बाध्यकारी क्षमता 50 मिलीग्राम / एमएल है। नी NTA मोती कई उपयोगों के लिए फिर से चार्ज किया जा सकता - राल से अधिक सतह पर तैरनेवाला प्रवाह और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। इस चरण को दोहराएँ।
- धोने बफर के 10 CV के साथ धो (300 मिमी NaCl, 50 मिमी कश्मीर 2 4 HPO, 20 मिमी imidazole पीएच 8)।
- क्षालन बफर के 5 CV में प्रोटीन Elute (300 मिमी NaCl, 50 मिमी कश्मीर 2 HPO 4, 250 मिमी imidazole पीएच 8)।
- अगर deglycosylation आवश्यक है:
- 0.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए, एक centrifugation concentrator का उपयोग 0.43 मिलीलीटर eluate ध्यान केंद्रित। प्रपत्र अवक्षेप हैं, तो 16,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा किसी भी मलबे गोली।
- 500 मिमी ना-साइट्रेट 5.5 पीएच के 50 μl जोड़ें।
- EndoHf (1 एक्स 10 6 यू / एमएल) के 20 μl जोड़ें। 2 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
नहींई: एंजाइम केंद्रित प्रोटीन कुल करने के लिए कारण हो सकता है, जो 37 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर काम करता है। एसडीएस पृष्ठ या immunoblotting द्वारा मूल्यांकन deglycosylation, अधूरा है, तो आर टी ऊष्मायन बढ़ाएँ। एंजाइम 4 डिग्री सेल्सियस पर गतिविधि नहीं है। - फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या अंतिम भंडारण बफर में धो एमाइलोज राल 3x: EndoHf निकालने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए राल के साथ प्रोटीन सेते हैं। मोती गोली और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए 1,000 XG पर 5 मिनट के स्पिन।
- उचित आणविक वजन कटऑफ centrifugation फिल्टर का उपयोग प्रोटीन ध्यान और भंडारण बफर (150 मिमी NaCl और 20 मिमी HEPES 7.5 पीएच) में विनिमय बफर।
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Representative Results
इस के साथ साथ माइलॉयड कोशिकाओं 2 (hTREM2, अवशेषों 19-132) पर व्यक्त मानव प्रोटीन ट्रिगर रिसेप्टर से स्रावित 13 केडीए immunoglobin (आईजी) डोमेन के लिए लागू इस अभिव्यक्ति प्रणाली के परिणाम इस प्रकार है। TREM2 दो डाइसल्फाइड बॉन्ड और दो एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन साइटों है कि एक भी बाह्य पुलिस महानिरीक्षक डोमेन युक्त एक प्रकार मैं transmembrane प्रोटीन होता है। कई अन्य पुलिस महानिरीक्षक डोमेन प्रोटीन 8 के विपरीत, TREM2 बैक्टीरियल समावेश शरीर 9 से refolding करने के लिए उत्तरदायी नहीं था। इसके बाद उत्परिवर्तजनन पुष्टि की एन से जुड़े ग्लाइकान उचित अभिव्यक्ति और मोड़ने के लिए आवश्यक हैं। संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन की सुविधा के लिए, TREM2 मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग कर एक सी टर्मिनल 6His टैग 7 के साथ pHLsec वेक्टर में पेश किया गया था। Kifunensine के साथ इलाज HEK293F कोशिकाओं में क्षणिक अभिव्यक्ति (चित्रा 1 बी, 2 लेन) नी NTA क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया था कि प्रोटीन झुकेंगे और नमूना तो विकासशील देशों के उत्पादन के लिए deglycosylated थाvely, समरूप प्रोटीन (चित्रा 1 बी, 3 लेन) मुड़ा हुआ है। TREM2 की 293F अभिव्यक्ति 5-10 मिलीग्राम / एल (5-10μg / मिलियन कोशिकाओं) का उत्पादन किया। बफर भंडारण बफर में आदान प्रदान के बाद, इस प्रोटीन (चित्रा 1 सी) सघन था। के बारे में 80% की अंतिम पवित्रता के बावजूद, इन क्रिस्टलों मज़बूती से diffracted, reproduced, और केवल TREM2 प्रोटीन (चित्रा -1) को रोकने के लिए चांदी दाग द्वारा दिखाया गया। इस अवलोकन प्रोटीन की जैव रासायनिक एकरूपता चलता है (यानी, तह और बाद translational संशोधनों), कुछ मामलों में, क्रिस्टलीकरण सफलता के लिए समग्र पवित्रता की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है।
क्रिस्टलीकरण के अलावा, इस प्रणाली के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है। यह नेटिव ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का उत्पादन और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 1E, एफ) द्वारा> 95% शुद्धता को प्राप्त करने के लिए शोषण किया जाता है। समाधान से पता चलता है, जो इस अतिरिक्त शुद्धि कदम,प्रोटीन के एन व्यवहार भी प्रोटीन की गुणवत्ता पर नजर रखने के लिए एक आदर्श तरीका है। शुद्ध प्रोटीन अपनी आणविक वजन को इसी मात्रा में elute चाहिए और नमूने में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रजातियों होना चाहिए। असामान्य रूप से एकत्रित प्रोटीन की बड़ी मात्रा में अस्थिर प्रोटीन से संकेत मिलता है और प्रोटीन के उत्पादन और शोधन अनुकूलन करने के लिए सुराग प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, इस अंतिम शुद्ध प्रोटीन ऐसे परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रोस्कोपी, थर्मल स्थिरता, और जांच प्रोटीन ligand बातचीत के रूप में मात्रात्मक biophysical प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए बेहतर है। अन्त में, ग्लाइकोसिलेशन की हद तक नियंत्रित glycan निर्भर कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है।
चित्रा 1. स्तनधारी अभिव्यक्ति सिस्टम: (ए) योजना HEK 293F कोशिकाओं में नियंत्रित या देशी ग्लाइकोसिलेशन के साथ प्रोटीन की स्तनधारी अभिव्यक्ति के लिए। ( बी) NiNTA शुद्ध hTREM2 की एसडीएस पृष्ठ (2 लेन) से पहले दिखाया kifunensine के तहत और EndoHf साथ (3 लेन) deglycosylation के बाद व्यक्त की। NiNTA शुद्ध और deglycosylated प्रोटीन से उत्पादित (सी) कण। क्रिस्टलीकरण इनपुट (डी) चांदी दाग (1 लेन) और काटा क्रिस्टल (गलियों 2 और 3) क्रिस्टल केवल TREM2 शामिल पता चलता है। TREM2 (ई) आगे की शुद्धि Kifunensine बिना 293F कोशिकाओं में उत्पादित NiNTA शुद्ध TREM2 का आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग हासिल की थी। तारों (*) आणविक भार मानकों का क्षालन मात्रा में संकेत मिलता है। प्रोटीन एक विश्लेषणात्मक S200 स्तंभ (जीई) का उपयोग टीबीएस में eluted। (एफ) आकार अपवर्जन शुद्ध TREM2 की एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण: इनपुट प्रोटीन (2 लेन) और मुड़ा शिखर (3 लेन)। कैसे पूर्ण एसडीएस पृष्ठ से एक व्यापक धब्बा के साथ एक उच्च स्पष्ट आणविक वजन पर चलाने के लिए, विषम ग्लाइकान ध्यान दें।"एन.के.> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
HEK 293F कोशिकाओं बाद translational संशोधनों की आवश्यकता होती है प्रोटीन के मजबूत उत्पादन करते हैं। इस प्रणाली disulfides, ग्लाइकोसिलेशन, और नहीं तो और अधिक दिनचर्या अभिव्यक्ति उपकरण का उपयोग कर अनुपस्थित होगा कि फास्फोरिलीकरण युक्त नेटिव मुड़ा प्रोटीन के तेजी से और स्केलेबल अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस प्रणाली केवल कई plasmids के सह अभिकर्मक से अभिव्यक्ति और बहु-प्रोटीन परिसरों की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। TREM2 इसके अलावा, इस प्रणाली के बड़े पैमाने पर प्रयोगशाला 10,11 में ब्याज की अन्य प्रोटीन के साथ कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। स्तनधारी कोशिकाओं को भी इन विवो प्रयोगों के लिए या रचना पर निर्भर एंटीबॉडी पैदा करने के लिए नेटिव मुड़ा एंटीजन के उत्पादन के लिए endotoxin मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति इष्टतम प्रदान करते हैं।
इष्टतम सेल व्यवहार्यता और अभिकर्मक शर्तों कुशल प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे अधिक महत्वपूर्ण हैं। बेहतर सेल व्यवहार्यता के लिए, कम बीतने सेल संस्कृतियों बढ़ाया जाता हैसेल संस्कृति की आपूर्ति करता है और विकास मीडिया में एंटीबायोटिक एकाग्रता के साथ कम हो जाता है। संशोधित पी-टीएमसी-25 सबसे प्रोटीन के साथ उपयुक्त transection क्षमता है; हालांकि, वृद्धि की अभिकर्मक दक्षता और कम cytotoxicity का प्रस्ताव है कि मध्यम कीमत पर उपलब्ध अन्य विकल्प हैं। प्रचार 5 (आस्ट्रेलिया बायोसाइंस) ऐसे 293fectin के रूप में, और अधिक महंगा अभिकर्मक अभिकर्मकों की तुलना में एक काफी कम कीमत पर, पी या अन्य अभिकर्मकों की तुलना में पैदावार बढ़ जाती है। अभिकर्मक प्रकार और डीएनए: अभिकर्मक अनुपात व्यक्ति का भाव और वांछित प्रयोग की जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
यहाँ वर्णित विधि प्रोटीन के उत्पादन के अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं। स्तनधारी कोशिकाओं पैतृक निगरानी तह और बैक्टीरिया और खमीर के लिए अनुपलब्ध बाद translational संशोधनों की पेशकश। मीडिया के उपयोग के साथ प्लाज्मिड निर्माण और तैयारी के लिए कम समय है, सीधे संशोधित किया जा सकता है, जिनमें से पीएच, baculovir करने के लिए इसे बेहतर बनाने केकीट कोशिकाओं में अमेरिका स्थित उत्पादन; और अंत में, सीरम मुक्त मीडिया सतही स्केलिंग (उच्च घनत्व सेल) और पक्षपाती 293T कोशिकाओं को प्राप्य नहीं शुद्धि प्रदान करता है। इस प्रणाली की मुख्य सीमा केवल समय है और अलग-अलग शोधकर्ता प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रतिबद्ध करने में सक्षम है पैमाने।
आई सबसे आम मुद्दों के लिए समस्या निवारण विकल्पों के नीचे शामिल कर रहे हैं।
समस्या निवारण
कम प्रोटीन अभिव्यक्ति नहीं है, तो 2-3 महीने से अधिक समय 293F कोशिकाओं passaging से बचें। की कमी आई सेल स्वास्थ्य में लंबे समय तक passaging के परिणाम धीमी दोहरीकरण के दिनों में परिलक्षित होता है और काफी प्रोटीन अभिव्यक्ति कम कर दिया। सेल के विकास को दैनिक निगरानी की जानी चाहिए और अब दैनिक दोहरीकरण संस्कृतियों खारिज किया जाना चाहिए। सेल व्यवहार्यता कोशिकाओं passaging जबकि संस्कृति की खुराक का उपयोग द्वारा सुधार किया जा सकता है। / डीएल सेल घनत्व 2 लाख / मिलीलीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए 400-600 मिलीग्राम की एक संस्कृति एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए ग्लूकोज की निगरानी औरसेल व्यवहार्यता trypan नीले बहिष्कार से ≥98% होना चाहिए। मिलीलीटर 0.5 मिलियन / घने कोशिकाओं पतला और ओ / एन अभिकर्मक पहले दोगुना करने की अनुमति देते हैं। (1 माइक्रोग्राम डीएनए की सीमा के भीतर: 1.5-6 μl अभिकर्मक) डीएनए: अभिकर्मक अभिकर्मक के विभिन्न अनुपात का उपयोग अभिकर्मक का अनुकूलन। यह 2 मिलीलीटर 6 अच्छी तरह से थाली में संस्कृतियों और immunoblotting द्वारा मापा उत्पादन का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटीन व्यक्त की और तेजी से अपमानित किया जा रहा है, तो संकेत कर सकते हैं 12 घंटा समय बिंदुओं कर रही है; प्रोटीन सतह पर तैरनेवाला अंश में नहीं मनाया जाता है, तो सेल lysate की जाँच करें। स्रावित करने के लिए असफल जो misfolded प्रोटीन, अभी भी immunoblotting द्वारा सेल lysate में स्पष्ट हो जाएगा।
नी NTA प्रतिधारण कम है, यानी, प्रोटीन, प्रवाह के माध्यम से स्तंभ बाध्यकारी बाद में रहता ताजा राल का उपयोग करें। यह भी गैर विशिष्ट बंधन में वृद्धि होगी, हालांकि 8.5 के लिए नमूना का पीएच बढ़ाने, मजबूत राल के लिए बाध्य कर दिया जाएगा। 4 डिग्री पर / एन राल हे के लिए बाध्य नमूना और बैच ध्यान केंद्रित किया Cसामने नी NTA शुद्धि बरामद प्रोटीन में ~ 5x वृद्धि का परिणाम हो सकती है। 6His-टैग की वजह से प्रोटीन की तृतीयक संरचना करने के लिए दुर्गम है, तो अन्य टर्मिनस पर यह क्लोनिंग का प्रयास करें। वैकल्पिक रूप से, उनके अवशेषों के लिए एक उच्च संबंध है जो कोबाल्ट राल, का उपयोग करें।
प्रोटीन समुच्चय और / या शुद्धि के दौरान अवक्षेप हैं, तो नी NTA में 10% ग्लिसरॉल जोड़ने धोने और क्षालन buffers द्वारा घुलनशीलता वृद्धि हुई है। डिग्री सेल्सियस आरटी पर बजाय 4 निकल आत्मीयता कॉलम चलाएँ। पीएच और नमक / समाधान में प्रोटीन की स्थिरता को बढ़ाने कि additives के लिए स्क्रीन करने के लिए अंतर स्कैनिंग fluorimetry 12 का प्रयोग करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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