A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
הכנת ממרחי כרומוזום היא תנאי הכרחי לביצוע המוצלח של הקרינה הכלאה באתר (דגים). הכנת ממרחי כרומוזום צמח באיכות גבוהה היא מאתגרת בשל קיר התא הנוקשה. אחת השיטות שאושרו להכנה של כרומוזומים מפעל הוא הכנת ירידה כביכול, הידוע גם בהפצה-טיפה או טכניקת אוויר ייבוש. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנה המהיר של כרומוזום mitotic מתפשט מתאים לזיהוי הדגים של בדיקות DNA עותק יחידים וגבוהות. שיטה זו היא גרסה משופרת של שיטת טיפת האוויר יבש מבוצעת בלחות היחסית של 50% -55%. פרוטוקול זה כולל מספר מופחת של שלבי כביסה עושים יישומה קל, יעיל ושחזור. יתרונות ברורים של גישה זו הם גם התפשטות, כרומוזומים metaphase ניזוק ורבים המשרתים כתנאי מושלמים לניתוח FISH מוצלח. שימוש בפרוטוקול זה השגנו כרום באיכות גבוההosome ממרחים ותוצאות FISH לשחזור לvulgare Hordeum, bulbosum ח ', ח' marinum, murinum ח ', ח' וpubiflorum cereale Secale.
הקרינה הכלאה באתר (דגים) היא כלי יעיל למיפוי הפיזי של רצפי עותק יחידים וגבוהים ברמת כרומוזומליות. התנאי המוקדם הוא הכנת ממרחי כרומוזום באיכות גבוהה. אין פרוטוקול הכנת כרומוזום כללי שיהיה פחות מתאים לתאים של בעלי חיים וצמחים. הכנה של כרומוזומים צמח היא מאתגרת במיוחד בשל הקיר הנוקשה תא ועקביות ציטופלסמה שונות במינים שונים. אחת השיטות הטובות להכנה של כרומוזומים צמח הוא טכניקת ירידה כביכול הידוע גם בטכניקה מתפשט שחררה ו1,2 טכניקת אוויר ייבוש. שיטה זו הוצגה לראשונה בשנת 1958 על ידי Rothfels וSiminovitch במבחנה תאי יונקים גדלו 3. מאוחר יותר מרטין et al. 4 וקאטו et al. 5 מותאם שיטה זו לצמחים.
לאחרונה, 'SteamDrop שיטה בשם &# 39; פותח אשר משמש קיטור מים להכנה של כרומוזומים שאינם חופף 6. אמנם, ההשפעה החיובית של לחות גבוהה נצפתה קודם לכן 7, 'SteamDrop' מספק זרימת עבודה מבוקרת של הכנות כרומוזום באיכות גבוהה 6. טיפול הקיטור גורם מתיחה של כרומוזומים כנראה קשורים לכמה שינויים של חלבוני כרומוזומליות. איכות וכתוצאה מכך מתפשט metaphase היא גבוהה מאוד, אם כי התמך של מספר המספיק של metaphase המלא מתפשט לניסויי דגים שלאחר מכן דורשים מומחיות טכנית.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנת כרומוזומים דגני mitotic המתאימים לזיהוי הדגים של בדיקות יחידים וגבוה עותק 5,8. שיטה זו היא גרסה משופרת של שיטת שחרור האוויר יבש שתוארה על ידי קאטו 9 מבוצעים בלחות היחסית של 50% -55% (איור 1). פרוטוקול זה כולל מספר מופחתצעדי כביסה עושים יישומה קל, יעיל ושחזור. שימוש בפרוטוקול זה השגנו מרווחי כרומוזום באיכות גבוהה ותוצאות דגים לvulgare Hordeum, bulbosum ח ', ח' marinum, murinum ח ', ח' וpubiflorum cereale Secale.
ניסוי הכנת כרומוזום בוצע באמצעות שורשים צעירים של דגנים השייכת למשפחת הדשא (Poaceae). כל המינים ניתחו 14 כרומוזומים mitotic הארוך יחסית metaphase (11-15 מיקרומטר) בסט הגנום דיפלואידי ושייכים למינים גדול הגנום (5.1-7.9 GBP).
אורך של שורשים מונבטים לא ה…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
Pectolyase | Sigma | P3026 | |
Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |