Abstract
Préparation des étalements de chromosomes est une condition préalable à l'exécution réussie de hybridation in situ en fluorescence (FISH). Préparation des chromosomes de la plante spreads de haute qualité est difficile en raison de la paroi cellulaire rigide. L'un des procédés approuvés pour la préparation des chromosomes de la plante est une préparation dite chute, également connu en tant que goutte d'étalement ou d'une technique de séchage par air. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation rapide du chromosome mitotique propage approprié pour la détection du poisson de sondes d'ADN copie unique et haute. Cette méthode est une variante améliorée de la méthode de la goutte sécher à l'air réalisée sous une humidité relative de 50% -55%. Ce protocole comprend un nombre réduit d'étapes de lavage rendant son application facile, efficace et reproductible. Avantages évidents de cette approche sont bien étalées, chromosomes métaphasiques endommagées et de nombreux siégeant en tant que condition préalable idéale pour l'analyse FISH succès. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu chrome de haute qualitéOSOME spreads et les résultats de FISH reproductibles pour Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale.
Introduction
Hybridation fluorescente in situ (FISH) est un outil efficace pour la cartographie physique des séquences à copie unique et élevés au niveau chromosomique. La condition préalable est la préparation du chromosome spreads de haute qualité. Il n'y a pas chromosome protocole général de préparation qui serait également approprié pour des cellules animales et végétales. Préparation des chromosomes de plantes est particulièrement difficile en raison de la paroi cellulaire rigide et divers de consistance à l'intérieur du cytoplasme des espèces différentes. L'un des procédés avantageux pour la préparation des chromosomes de la plante est une technique dite chute aussi connu comme technique d'étalement de goutte-et séchage à l'air technique 1,2. Cette méthode a été introduite en 1958 par Rothfels et Siminovitch pour in vitro des cellules de mammifères cultivées 3. Plus tard, Martin et al. 4 et Kato et al. 5 adapté cette méthode pour les plantes.
Plus récemment, une méthode nommée 'SteamDrop &N ° 39; a été développé qui utilise de la vapeur d'eau pour la préparation de chromosomes 6 ne se chevauchent pas. Bien que, l'influence positive de l'humidité élevée a été observée plus tôt 7, 'SteamDrop' délivre un flux contrôlé de chromosomes préparations de haute qualité 6. Le traitement à la vapeur provoque l'étirement des chromosomes probablement liées à des modifications des protéines chromosomiques. La qualité des spreads résultant de métaphase est très élevé, bien que retenue du nombre suffisant de métaphase complète propage pour des expériences de FISH ultérieures exige une expertise technique.
Nous présentons ici un protocole pour la préparation des chromosomes de céréales mitotiques appropriés pour la détection du poisson de sondes simples et copies élevé 5,8. Cette méthode est une variante perfectionnée du procédé de coulée sécher à l'air décrite par Kato 9 réalisé sous une humidité relative de 50% à 55% (Figure 1). Ce protocole comprend un nombre réduitdes étapes de lavage rendant son application facile, efficace et reproductible. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu des étalements de chromosomes de haute qualité et les résultats de poisson pour Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation Chromosome
- La germination des graines et la fixation des extrémités des racines
- Germer les graines d'orge 10-20 sur deux couches de papier filtre humide dans une boîte de Petri dans des conditions sombres pendant 2 jours à 22-24 ° C. Couper les racines vigoureuses avec la longueur de 1-2 cm de la graine en utilisant une lame de rasoir.
- Préparez de l'eau glacée en plaçant une bouteille en verre de 500 ml contenant de l'eau froide du robinet dans l'eau glacée écrasé. Aérer l'eau glacée et plongez pointes des racines pendant 20 heures pour augmenter la fréquence des cellules en métaphase.
- Transfert des racines de l'eau à 50 ml d'éthanol: acide acétique (3: 1) pour les fixer fixateur à température ambiante pendant 2 jours. Racines de magasins dans un éthanol fraîchement préparé: acide acétique (3: 1) fixateur à 4 ° C jusqu'à utiliser jusqu'à un an.
- Traitement de lavage et l'enzyme
- Laver les 10-20 racines avec 30 ml d'eau du robinet glacée pendant 5 min à deux reprises en utilisant un bêcher de 50 ml en verre. Utilisez microscope binoculaire. Transfert racines un par un dans30 ml 0,01 M de tampon citrate (0,01 M d'acide citrique 0,01 M + citrate de sodium, pH 4,8) en utilisant des pinces et laver en secouant le récipient en verre pendant 5 minutes deux fois. Placez les racines sur du papier filtre pour éliminer le liquide complètement et de coupure tissu non méristématique indésirable en utilisant une lame de rasoir.
- Incuber jusqu'à 20 pointes des racines dans le mélange de l'enzyme de 1 ml à 37 ° C pendant environ 50 min pour adoucir le tissu végétal (tableau 1) dans un verre de montre. Enzyme mélange contient 0,7% de cellulase R10, 0,7% de cellulase, une pectolyase% et 1% cytohelicase dilué dans du tampon 0,01 M de citrate. Conserver le mélange d'enzymes à -20 ° C et réutilisé jusqu'à cinq fois.
- Retirer l'enzyme par pipetage et laver les pointes des racines sur la glace avec 5 ml 0,01 M de tampon citrate à deux reprises pour remplacer l'enzyme résiduelle.
- Racine macération
- Laver les pointes des racines avec 1 ml éthanol à 96% deux fois soigneusement dans le même verre de montre. Remplacer éthanol avec fraîchement préparé fixateur (75% d'acide acétique: 25% d'éthanol). Utilisez 10-15fixateur pi par extrémité de la racine.
- Transfert des conseils profondes conjointement avec le fixateur dans un tube de 2 ml et se désintègrent méristèmes de racine avec une aiguille ou une pince de dissection. Appuyez sur le tube 20 fois pour remettre en suspension les cellules pour obtenir une suspension cellulaire. Conservez la suspension de cellules à -20 ° C jusqu'à deux mois.
- Goutte de la suspension cellulaire
- Placez 2-3 couches de mouchoir en papier imbibé d'eau sur une plaque chauffante à 50 ° C. Immerger les lames microscopiques dans l'eau du robinet glacé dans le réfrigérateur pendant 30 min. Et le lieu glisse sur le dessus du tissu de papier humide.
- Pipette 7-10 ul de suspension cellulaire et déposez-le à partir d'une distance de 20 cm sur la lame refroidi placé sur la plaque chaude. Pipette 10 ul de mélange acide acétique-éthanol sur la même place que la suspension de cellules sur la lame et maintenir la lame sur la plaque chaude pour supplémentaire de 2 min. Placer la lame sur la plaque chauffante, sans le tissu humide et laisser sécher pendant 1 min.
- Contrôle de la qualité et de boîte de glissières
- Vérifiez diapositives à l'aide d'un microscope à contraste de phase pour contrôler la qualité de la propagation de chromosome. Utilisez des lames soit le même jour ou dans un magasin par immersion dans 96% d'éthanol dans une jarre de Coplin à -20 ° C.
- Le prétraitement des diapositives avant FISH; toutes les étapes sont réalisées à température ambiante
- Placer les lames dans une jarre de Coplin contenant 50 ml de 2x SSC (20x SSC contient 3 M de NaCl et 300 mM de citrate trisodique) pendant 5 min. En utilisant des pinces, des diapositives de transfert d'une jarre de Coplin contenant 50 ml d'acide acétique à 45% pour les 3-10 min.
- Transfert glisse à une jarre de Coplin contenant 50 ml de 2x SSC pendant 10 min. Diapositives de transfert à une jarre de Coplin contenant 50 ml de formaldéhyde à 4% (en 2x SSC) et plonger diapositives pour 10 min de fixer chromosomes.
- Retirer le formaldéhyde en rinçant les diapositives 3 fois pendant 4 min chacune, dans une jarre de Coplin contenant 50 ml 2x SSC. Déshydrater les lames dans une jarre de Coplin pendant 2 minutes dans la série de 70%, 90% et 100% d'éthanol, et coulisse respectivement à la verticale secsposition.
2. hybridation fluorescente in situ (FISH)
- Pour chaque lame, préparer une solution d'hybridation de 20 ul au total en utilisant 10 ul de formamide désionisé, 5 pi de tampon 4 x d'hybridation (tampon de 200 ul contenant 80 ul de 20 x SSC, 8 pi de 1 M de Tris-HCl pH 8,0, 1,6 pi de 0,5 M EDTA, 11,2 pi 10 ug / ul sperme de saumon et de l'eau libre de DNase 99,2 pi), 3 pi de la sonde et 2 ld'eau exempte de DNase.
- Ajouter 20 ul de solution d'hybridation par lame et le couvercle avec une lamelle de 24 x 32 mm et d'arrêter la lamelle avec du ciment de caoutchouc. Dénaturer diapositives avec des sondes simultanément à 80 ° C pendant 2 min sur une plaque chauffante.
- Transfert lames dans une chambre humide et incuber diapositives à 37 ° CO / N évitant la lumière. Retirer lamelles en rinçant les lames dans une jarre de Coplin avec 2x SSC. Placer les lames dans une jarre de Coplin contenant 55-60 ° C SSC 2x et incuber pendant 20 min.
- Placer les lames à 2x SSC dans une jarre de Coplin pendant 2 min à température ambiante. Déshydrater les lames dans une jarre de Coplin pendant 2 minutes dans la série de 70%, 90% et 100% d'éthanol, respectivement.
- Air-sécher les diapositives et de contraste avec 1 pg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) dans antifade milieu de montage, éviter la lumière intense.
3. Analyse microscopique et stockage
- Analyser les lames en utilisant un microscope à épifluorescence. La sélection de filtre dépend du fluorochrome utilisé pour le marquage de la sonde. Si nécessaire, conserver les lames à 4 ° C dans des conditions sombres jusqu'à un an.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lames microscopiques avec les écarts de métaphase de mitose ont été préparés par la méthode rapide de l'air sec chute chromosome préparation décrit ci-dessus (Suppl. Figure 1). Analyse FISH a été réalisée en utilisant les deux, des séquences répétitives et une seule copie. Les images ont été obtenues par un microscope à épifluorescence avec un ensemble de filtres permettant d'excitation des fluorophores et correspondant captés par la caméra CCD monochrome une haute sensibilité. Pour l'acquisition de l'image, nous avons utilisé un ordinateur avec un logiciel d'acquisition d'image. Les résultats des expériences de FISH sur chromosomes mitotiques utilisant ADNr 5S, [CTT] 10, et les sondes à copie unique étaient distincts et de haute qualité pour Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (figure 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale (figure 2D). Avantages évidents de cette approche sont bien étalées, en bon état et a rencontré de nombreux chromosomes aphase agissant comme une condition préalable idéale pour l'analyse FISH succès. Il est possible de stocker la suspension de cellules à -20 ° C jusqu'à deux mois et pour préparer le chromosome se propage sur le jour de l'expérience FISH. Fraîchement lames préparées peuvent être également stockés à -20 ° C dans 96% d'éthanol, bien que nous avons observé que la qualité des signaux d'hybridation sur les chromosomes est réduit par rapport aux écarts de métaphase fraîchement préparés. Les méthodes peuvent être utilisées pour préparer des étalements de chromosomes de haute qualité dans les céréales d'une manière simple, efficace et reproductible et très probablement peuvent être utilisés dans d'autres espèces de plantes aussi.
Figure 1. Un schéma décrivant la procédure de la méthode de préparation du chromosome usine de chute sécher à l'air.
es / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
Figure 2. Fish sur métaphase mitotique des chromosomes du Hordeum vulgare, H. bulbosum et Secale céréale préparée par le procédé de coulée d'air sec. (A) H. vulgare avec une seule sonde de copie (FPct_40752) marqué avec un colorant fluorescent rouge. (B) H. vulgare avec sonde 5S ADNr marqué par un colorant fluorescent vert. (C) H. bulbosum avec CTT-microsatellite marqué par un colorant fluorescent vert et (D) S. cereale avec répétition de pSc119.2 marqué par un colorant fluorescent vert. Tous les chromosomes ont été contre-colorées avec du DAPI (en rouge). Signaux FISH sont représentées en jaune. Barre d'échelle = 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figuré.
Tableau 1. temps d'incubation de traitement enzymatique pour différentes espèces.
Suppl. Figure 1. contraste de phase et de contraste d'interférence différentiel (DIC) des images de la métaphase mitotique chromosomiques spreads de la méthode de préparation du chromosome usine de chute sécher à l'air sur l'exemple de Hordeum vulgare. (A) L'image à contraste de phase prise au grossissement de 200x et (B) l'image de contraste d'interférence différentiel prise à 630X grossissement. S'il vous plaît cliquer surici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'expérience de préparation du chromosome a été réalisée en utilisant jeunes racines de céréales appartenant à la famille des graminées (Poaceae). Toutes les espèces analysées ont 14 chromosomes métaphasiques relativement longue de la mitose (11-15 um) dans l'ensemble du génome diploïde et appartiennent à des espèces grand génome (05.01 à 07.09 GBP).
Longueur des racines germées était pas plus de 2 cm pour obtenir un maximum de tissu méristématique. La synchronisation des cellules en division a été obtenue par un traitement de 20 h de l'eau glacée longue que l'amélioration de la quantité de la métaphase mitotique 10 se propage.
Deux étapes sont importantes pour la préparation de préparations de chromosomes de haute qualité: (I) l'humidité relative de 50% à 55% et (II) la durée du traitement enzymatique. Le premier point a été réalisé en plaçant les tissus de papier humide sur une plaque chaude à proximité des lames de verre. L'humidité relative a été mesurée par un hygromètre. L'humidité optimale pour la préparation de l'usineles chromosomes a été similaire à l'humidité déclarés par Kirov et al. 6. L'effet positif sur la qualité de chromosome à une humidité relative optimale se produit par le gonflement du cytoplasme et la paroi cellulaire hydrolyse.
La durée du traitement dépend enzyme est espèces (tableau 1). La durée du traitement enzymatique dépend aussi de l'intervalle de temps de fixation de racine dans éthanol / acide acétique et la taille des racines. Les racines plus longues ont été stockés dans le fixateur (jusqu'à 1 an à 4 ° C), plus il faut pour digérer racines au grade approprié. Matériau racine insuffisamment digéré est difficile à macérer et augmenter le temps total de préparation à la suite d'une longue macération durable. En outre, les chromosomes métaphasiques restent ancrées dans le cytoplasme qui pourraient entraver la pénétration de la sonde qui a suivi lors de l'expérience de poissons. Sur l'autre main sur digéré matériau peut influencer la structure des chromosomes eux-mêmes, et les dommages DN cibleUn pour l'analyse FISH.
Un facteur supplémentaire pour l'amélioration de la préparation est l'utilisation de la seconde goutte de fixateur (3: 1, acide acétique / éthanol). Une concentration élevée d'acide acétique à ce mélange stimule la digestion de cytoplasme et favorise la diffusion des espèces chromosome avec de grands chromosomes. Réduction de cytoplasme peut également avoir lieu après l'immobilisation des chromosomes sur diapositives. A cet effet, des lames de microscope portant les étalements de chromosomes peuvent être incubées dans de l'acide acétique à 45% à température ambiante pendant 2 à 10 min en fonction du niveau de cytoplasme. Contrôle de la qualité des étalements de chromosomes a été réalisée avec un microscope à contraste de phase sans aucune coloration supplémentaire (par exemple, 1% Aceto-carmin). Normalement, plus de 25 diapositives contenant chromosomiques spreads de haute qualité peuvent être obtenus à partir de 20 racines en utilisant la méthode ci-dessus.
Les résultats des expériences de FISH sur chromosomes mitotiques utilisant ADNr 5S, [CTT] 10, et 6 kb longtemps copie unique sonde (FPct_40752) étaient distinctes et de haute qualité pour toutes les espèces décrites ci-dessus (Figure 2). Avantages évidents de cette approche sont bien étalées, chromosomes métaphasiques endommagées et de nombreux siégeant en tant que condition préalable idéale pour l'analyse FISH succès. Il est possible de stocker la suspension de cellules à -20 ° C jusqu'à deux mois et pour préparer le chromosome se propage sur le jour de l'expérience FISH. Fraîchement lames préparées peuvent être également stockés à -20 ° C dans 96% d'éthanol, bien que nous avons observé que la qualité des signaux d'hybridation sur les chromosomes est réduit par rapport aux écarts de métaphase fraîchement préparés.
Étalements de chromosomes préparés par la technique de coulée de l'air de séchage rapide ont été adaptés pour les poissons et ont été reproduits à plusieurs reprises. Combinaison de cette méthode de préparation des chromosomes avec des poissons pourrait être largement appliquée à explorer l'organisation du génome des plantes, par exemple, pour un caryotype 11, chromoscartographie omal 12, dans les études de synthèse, et pour l'intégration des cartes physiques et génétiques 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M.
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
