Abstract
Подготовка спредов хромосом является необходимым условием для успешного выполнения флуоресценции в гибридизация (FISH). Подготовка высококачественных спредов завод хромосом является сложной задачей из-за жесткой клеточной стенки. Одним из одобренных способов получения растительных хромосом является так называемая подготовка падение, также известный как капли распространяющихся или техники сушки на воздухе. Здесь мы представляем протокол для быстрого приготовления митотического хромосомы распространяется подходит для обнаружения рыбы одиночных и высоких копий ДНК-зондов. Этот метод представляет собой усовершенствованный вариант воздушно-сухого капельным методом осуществляют при относительной влажности 50% -55%. Этот протокол включает в себя уменьшение количества стадий промывки делает его применение просто, эффективно и воспроизводимым. Очевидные преимущества такого подхода хорошо распространение, неповрежденные и многочисленные хромосомы метафазные, выступающей в качестве идеального предпосылки для успешного анализа FISH. Используя этот протокол, мы получили качественный хромosome спреды и воспроизводимые результаты рыбу для Hordeum обыкновенной, Х. Х. луковичный, Маринум, Х. Х. murinum, pubiflorum и Secale Cereale.
Introduction
Флуоресценции в гибридизация (FISH) является эффективным инструментом для физического картирования отдельных и высоких последовательностей копирования на хромосомном уровне. Обязательным условием является подготовка спредов хромосомных высокого качества. Там нет общего протокола подготовки хромосом, которые в равной степени подходит для животных и растительных клеток. Приготовление растительных хромосом особенно трудно из-за жесткой клеточной стенки и различных консистенции цитоплазмы в различных видов. Одним из выгодных методов получения растительных хромосом является так называемая технология падение также известен как раскрывающегося распространение техники и сушки на воздухе 1,2 техники. Этот метод был впервые введен в 1958 году и Ротфельс Siminovitch для в пробирке выращенных клетках млекопитающих 3. Позже Мартин и др. 4 и Като и др. 5 приспособлен этот метод для растений.
Совсем недавно, метод назван "SteamDrop &# 39; был разработан, которые используются водяной пар для приготовления неперекрывающихся хромосом 6. Хотя, положительное влияние высокой влажности наблюдалось ранее 7, "SteamDrop" поставляет контролируемый технологический процесс препаратов 6 высококачественных хромосом. Обработку паром вызывает растяжение хромосом, вероятно, подключенных к некоторыми изменениями хромосомных белков. Качество результате метафазных очень высока, хотя стопорное достаточного количества полной метафазных для последующих экспериментов FISH требует технических знаний.
Здесь мы приводим протокол для подготовки митотических хромосом зерновых, пригодных для обнаружения рыбы одиночных и высокий экземпляр зондов 5,8. Этот метод представляет собой усовершенствованный вариант воздушно-сухого метода, описанного капельной Като 9 выполняется под относительной влажности 50% -55% (рисунок 1). Этот протокол включает в себя уменьшение количествашагов стиральных делает его применение просто, эффективно и воспроизводимым. Используя этот протокол, мы получили высокие качества спредов хромосом и результаты рыбу для Hordeum обыкновенной, Х. Х. луковичный, Маринум, Х. Х. murinum, pubiflorum и Secale Cereale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Хромосома Подготовка
- Всхожесть семян и фиксация корневых
- Прорастают 10-20 ячмень семена на двух слоев влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при темных условиях в течение 2 дней при температуре 22-24 ° С. Отрежьте энергичные корни с длиной 1-2 см от семян с помощью лезвия бритвы.
- Подготовка ледяной водой, помещая стеклянный флакон, содержащий 500 мл холодной воды в измельченный лед-вода. Проветривайте ледяной водой и погрузите кончики корней в течение 20 часов, чтобы увеличить частоту метафазных клеток.
- Передача корни из воды до 50 мл этанола: уксусную кислоту (3: 1) фиксатор для фиксации их при комнатной температуре в течение 2 дней. Корни Хранить в свежеприготовленной смеси этанол: уксусная кислота (3: 1) фиксатор при 4 ° С до использования до одного года.
- Стиральная и фермент лечение
- Промыть 10-20 корни с 30 мл охлажденного льдом водопроводной воде в течение 5 мин с помощью дважды стеклянном стакане на 50 мл. Используйте бинокулярный микроскоп. Перевести корни по одному в30 мл 0,01 М цитрат буфера (0,01 М лимонная кислота + 0,01 М цитрата натрия, рН 4,8) с помощью щипцов и промойте путем встряхивания стеклянный стакан в течение 5 мин в два раза. Поместите корни на фильтровальной бумаге, чтобы полностью удалить жидкость и отсечки нежелательного не-меристематической ткани с помощью лезвия бритвы.
- Инкубируют до 20 корешков в 1 мл смеси ферментов при 37 ° С в течение приблизительно 50 мин, чтобы смягчить растительной ткани (таблица 1) в часовом стекле. Фермент смесь содержит 0,7% целлюлазы R10, 0,7% целлюлазы, 1% pectolyase и 1% cytohelicase разводят в 0,01 М цитрат буфера. Хранить смесь ферментов при -20 ° С и повторно до пяти раз.
- Удалить фермент с помощью пипетки и мыть кончики корней на льду с 5 мл 0,01 М цитрат буфера в два раза, чтобы заменить остаточного фермента.
- Корень мацерации
- Вымойте корень наконечники с 1 мл 96% этанола в два раза осторожно в том же часовом стекле. Заменить этанола с свежеприготовленного фиксатора (75% -ной уксусной кислоты: 25% этанол). Используйте 10-15мкл фиксатором за кончик корня.
- Корневые передачи советы вместе с фиксатором в 2 мл пробирку и распадаются корневые меристемы с рассекает иглы или щипцов. Нажмите на трубке 20 раз повторно приостанавливать клетки для получения суспензии клеток. Храните клеточной суспензии при -20 ° С до двух месяцев.
- Удаление клеточной суспензии
- Поместите 2-3 слоев воды пропитанные бумажной салфеткой на горячей плите при 50 ° C. Погрузитесь микроскопические слайды в ледяной водопроводной воды в холодильник на 30 мин. И место скользит по верхней части влажной салфеткой.
- Внесите 7-10 мкл клеточной суспензии и поместите его на расстоянии 20 см на охлажденной слайд размещенной на горячей плите. Внесите 10 мкл уксусной кислоты и этанола на том же месте, клеточной суспензии на слайде и сохранить слайд на горячей плите в течение дополнительных 2 мин. Поместите слайд на горячей плите, не мокрой тканью и дайте ему высохнуть в течение 1 мин.
- Контроль качества и Storagе слайдов
- Проверьте слайды, используя фазы контрастного микроскопа для контроля качества распространения хромосом. Использование слайдов либо в тот же день или хранить при погружении в 96% -ном этаноле в банку Коплин при -20 ° С.
- Предварительная обработка слайдов до рыбы; Все этапы выполняются при комнатной температуре
- Место слайдов в банке Коплин, содержащую 50 мл 2х SSC (SSC 20x содержит 3 М NaCl и 300 мМ цитрат) тринатрийфосфат в течение 5 мин. Использование щипцов, трансфер слайды банку Коплин, содержащей 50 мл 45% -ной уксусной кислоты в течение 3-10 мин.
- Передача скользит к банку Коплин, содержащую 50 мл 2х SSC в течение 10 мин. Передача слайды в банке Коплин, содержащей 50 мл 4% формальдегида (в 2х SSC) и погружают горки в течение 10 мин, чтобы исправить хромосомы.
- Удалить формальдегид путем промывки слайды 3 раза в течение 4 минут каждый, в банке Коплин, содержащую 50 мл 2x SSC. Дегидрировать слайды в банке Коплин в течение 2 мин в серии 70%, 90% и 100% этанола, соответственно и сухих слайдов в вертикальнойдолжность.
2. Люминесцентные В гибридизация (FISH)
- Для каждого слайда, подготовить гибридизации раствор 20 мкл в целом с помощью 10 мкл деионизированной формамида, 5 мкл 4х гибридизации буфера (200 мкл буфера содержит 80 мкл 20x SSC, 8 мкл 1 М Трис-HCl рН 8,0, 1,6 мкл 0,5 М ЭДТА, 11,2 мкл 10 мкг / мкл спермы лосося и 99,2 мкл ДНКазы свободной воды), 3 мкл зонда и 2 мкл ДНКазы без воды.
- Добавьте 20 мкл гибридизации раствора на слайде и крышкой с 24 х 32 мм покровным и арестовать покровное с резиновым клеем. Денатурации слайдов с зондами одновременно при 80 ° С в течение 2 мин на горячей плите.
- Передача слайды влажной камере и инкубируют при 37 слайдов ° CO / N, избегая света. Снимите крышку скользит путем промывки слайды в банке Коплин с 2х SSC. Место слайды в банке, содержащей 55-60 Коплин ° C 2x SSC и инкубировать в течение 20 мин,
- Поместите слайды 2x SSC в банке Коплин в течение 2 мин при комнатной температуре. Высушить слайды в банку Коплин в течение 2 мин в серии 70%, 90% и 100% -ным этанолом, соответственно.
- Высушите слайды и контрастное 1 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-phenylindoline (DAPI) в antifade монтажной среды, во избежание интенсивный свет.
3. Микроскопический анализ и хранение
- Анализ слайды, используя микроскоп эпифлуоресцентной. Выбор фильтра зависит от используемого флуорохромом для маркировки зонда. При необходимости, магазин горки 4 ° С в темноте до года.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроскопические слайды с митотических спредов метафазных были подготовлены быстро воздушно-сухой падение хромосом способа получения описанного выше (доп. Рисунок 1). Анализ FISH проводили с использованием оба, повторяющиеся и одного копирования последовательности. Изображения были получены с помощью микроскопа с эпифлуоресцентной набор фильтров, позволяющих возбуждение соответствующих флуорофоров и захвачен высокой чувствительности CCD монохромный камеры. Для получения изображения мы использовали компьютер с программным обеспечением захвата изображений. Результаты FISH экспериментах на митотический метафазных хромосом с использованием 5S рДНК, [СТТ] 10, и один от копирования зондов были различны и высокого качества для Hordeum обыкновенной (Figre 2А, Б), Х. луковичный (рис 2С), Х. Marinum, Х. murinum, Х. pubiflorum и Secale Cereale (рис 2D). Очевидные преимущества такого подхода хорошо распространение, неповрежденный и многочисленные встретился aphase хромосомы, выступающей в качестве идеального предпосылки для успешного анализа FISH. Можно хранить клеточной суспензии при -20 ° С до двух месяцев и подготовить хромосома распространяется на день эксперимента рыбы. Свежеприготовленные горки можно также хранить при -20 ° С в 96% -ном этаноле, хотя мы обнаружили, что качество сигналов гибридизации на таких хромосом уменьшается по сравнению с свежеприготовленные спредов метафазных. Эти методы могут быть использованы для получения высококачественных спреды хромосомы в зерновых в легкий, эффективный и воспроизводимый способ и наиболее вероятно могут быть использованы в других видов растений тоже.
Рисунок 1. Схема описания процедуры капельном способе получения растительного хромосома воздушно-сухой.
ES / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
Рисунок 2. рыбы на митотический метафазы хромосомы спредов Hordeum обыкновенной, H. луковичный и Secale Cereale получают по способу капельной воздушно-сухой. (А) Х. обыкновенный с одной копией зонда (FPct_40752), помеченный красным флуоресцентным красителем. (В) Х. обыкновенный с 5S рДНК зонда с надписью зеленой флуоресцентной краской. (С) H. луковичный с СТТ-микросателлитных меченого зеленым флуоресцентным красителем и (D) С. Cereale с pSc119.2 повторения с надписью зеленой флуоресцентной краской. Все хромосомы контрастно DAPI (в ред). РЫБЫ сигналы показаны желтым цветом. Масштаб бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное FIGUчисло рейнольдса
Таблица 1. Время инкубации лечения фермента для различных видов.
Дополнение. Рисунок 1. фазового контраста и дифференциального интерференционного контраста (ДИК) изображения митотический метафазных хромосом спрэдов воздушно-сухой падение растений методом подготовки хромосом на примере обыкновенной Hordeum. (А) Фазового контраста изображения принято на 200X увеличении и (Б) Дифференциальная интерференционного контраста изображения принято на 630X увеличении. Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эксперимент подготовка хромосома была проведена с помощью молодых корней зерновых, принадлежащих к семейству травы (Poaceae). Все анализируемые виды имеют 14 относительно длинный митотических хромосом (метафазных 11-15 мкм) в диплоидным набором генома и принадлежат большого генома видов (5.1-7.9 GBP).
Длина корней проросших не более 2 см, чтобы получить максимум меристематической ткани. Синхронизация делящихся клеток было достигнуто в 20 ч лечения долго лед-вода, которая улучшила количество митотического метафазы распространяется 10.
Два шаги важны для приготовления препаратов хромосом высококачественных: (I) относительной влажности 50% -55%, и (II), длительность лечения фермента. Первая точка была достигнута путем размещения мокрые бумажные салфетки на горячей плите в непосредственной близости от стеклах. Относительная влажность измеряют с помощью гигрометра. Оптимальное влажности для приготовления растенияхромосомы была похожа на влажность сообщили Кирова и др. 6. Положительное влияние на качество хромосом при оптимальной относительной влажности происходит за счет набухания цитоплазмы и клеточной стенки гидролиза.
Продолжительность обработки ферментом является видовой зависимый (Таблица 1). Период ферментной обработки также зависит от промежутка времени корневой фиксации в смеси этанол / уксусной кислоты и размера корней. Чем дольше корни хранятся в фиксатора (до 1 года при 4 ° С), тем больше времени требуется, чтобы переварить корни в правильном классе. Недостаточно усваиваются корневой материал трудно вымачивать и увеличит общее время приготовления в результате длительного вымачивания. Кроме того, метафазных хромосом остаются встроенными в цитоплазму, которые могли бы препятствовать проникновению зонда последующего ходе эксперимента рыбы. С другой стороны более расщепленный материал может влиять на структуру самих хромосом и уровня разрушения DNА для анализа FISH.
Дополнительным фактором для улучшения подготовки является использование второй капле фиксатора (3: 1, уксусную кислоту / этанол). Высокая концентрация уксусной кислоты в этой смеси стимулирует усвоение цитоплазме и способствует распространению в хромосому видов с большими хромосом. Снижение Цитоплазма также может иметь место после иммобилизации хромосом на слайдах. Для этого предметные стекла, несущие спреды хромосом можно инкубировать в 45% -ной уксусной кислоты при комнатной температуре в течение 2-10 мин в зависимости от уровня цитоплазмы. Проверка качества спредов хромосом проводили с фазового контрастного микроскопа без дополнительного окрашивания (например, 1% ацето-Carmin). Обычно более 25 скользит содержащие спреды хромосомные высококачественные могут быть получены из 20 корней с использованием метода выше.
Результаты FISH экспериментах на митотический метафазных хромосом с использованием 5S рДНК, [СТТ] 10, и 6 кб давно единственная копия зонд (FPct_40752) были различны и высокого качества для всех видов описанных выше (рис 2). Очевидные преимущества такого подхода хорошо распространение, неповрежденные и многочисленные хромосомы метафазные, выступающей в качестве идеального предпосылки для успешного анализа FISH. Можно хранить клеточной суспензии при -20 ° С до двух месяцев и подготовить хромосома распространяется на день эксперимента рыбы. Свежеприготовленные горки можно также хранить при -20 ° С в 96% -ном этаноле, хотя мы обнаружили, что качество сигналов гибридизации на таких хромосом уменьшается по сравнению с свежеприготовленные спредов метафазных.
Хромосомные спреды, подготовленные быстрого техники капельной воздушно-сухой были пригодны для переработки рыбы и были воспроизведены несколько раз. Сочетание этого метода подготовки хромосом с рыбой может широко применяться для изучения генома растений в организацию, например, для кариотипирование 11 ChromosOMAL отображение 12, в синтетических исследований, так и для интеграции физических и генетических карт 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M.
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
