Abstract
染色体利差的准备是荧光原位杂交技术的成功表现（FISH）的先决条件。高品质的植物染色体利差准备是具有挑战性，因为刚性细胞壁。之一的植物染色体的制备的批准的方法是所谓的滴制剂，也称为滴扩展或空气干燥技术。在这里，我们提出了一个协议，为快速编制有丝分裂染色体的利差适合FISH检测单和高仿DNA探针。这种方法是在50％-55％的相对湿度下进行的风干滴法的改进的变体。这个协议包括清洗步骤使得其应用简单，有效和可再现的数目减少。这种方法的显而易见的好处是作为成功的FISH分析了完善的前提条件良好的蔓延，没有损坏和大量的中期染色体。使用这个协议，我们得到高品质的CHROMosome差价和可重复的FISH结果大麦，H球茎，H海鱼，H murinum，H pubiflorum和黑麦 。
Introduction
荧光原位杂交（FISH）是一种有效的工具，单一的，高拷贝序列在染色体水平的物理图谱。前提条件是高品质的染色体利差的准备。没有一般染色体制备方案，这将是同样适用于动物和植物细胞。植物染色体的制备是特别具有挑战性，因为不同的物种中的刚性细胞壁和各种细胞质的一致性。之一的有利方法植物染色体的制备是一个所谓的滴技术也被称为落扩频技术和空气干燥技术1,2。该方法首先在1958引入由Rothfels和Siminovitch用于体外生长哺乳动物细胞3。后来Martin等人4和Kato等人5适于这种方法的植物。
最近，一个名叫法“SteamDrop＆＃39;被开发了用于水蒸汽的非重叠的染色体6的制备。虽然，前面7观察到高湿度的积极影响，'SteamDrop'提供高质量染色体制剂6的受控流。蒸汽处理引起拉伸可能连接到染色体蛋白质的一些修改染色体。导致中期扩展的质量是非常高的，虽然中期完成足够数量的固定利差随后FISH实验要求的专业技术。
在这里，我们提出了一个协议为适合FISH检测单和高仿探测器5,8的有丝分裂染色体谷物的准备。这种方法是由加藤下的50％-55％的相对湿度进行9（图1）中描述的风干落下法的改进的变体。这个协议包括减少数量的洗涤步骤使得其应用简便，高效和可重复性。使用这个协议，我们得到高品质的染色体利差和FISH结果大麦，H球茎，H海鱼，H murinum，H pubiflorum和黑麦 。
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Protocol
1.染色体制备
- 种子萌发和根尖的固定
- 发芽在黑暗条件下的皮氏培养皿2天在22-24℃，在湿润的滤纸两层10-20大麦种子。通过用刀片切断剧烈根系1-2厘米从种子的长度。
- 通过将装有冷自来水入碎冰 - 水的500ml玻璃瓶制备冰冷的水中。充入冰冷的水，沉浸根尖为20小时，以增加中期细胞的频率。
- 从水到根部到50毫升乙醇：乙酸（3：1）固定液固定它们在室温2天。商店的根在新制备的乙醇：乙酸（3：1）固定液在4°C，直到使用最多的一年。
- 洗涤和酶处理
- 洗10-20根用30ml冰冷的自来水进行5分钟，两次用50ml的玻璃烧杯中。使用双目显微镜。通过一个传输根一成30毫升使用镊子和通过摇动在玻璃烧杯5分钟洗两次的0.01M柠檬酸盐缓冲液（0.01M柠檬酸+ 0.01柠檬酸钠，pH值4.8）。放置在滤纸上的根，完全除去液体并用刀片切断不希望的非分生组织。
- 孵育达于1ml酶混合物20根尖，在37℃下进行约50分钟，以软化植物组织（表1）在表玻璃。酶混合物含有0.7％的纤维素酶R 10，0.7％纤维素酶，1％果胶酶和1％cytohelicase稀释在0.01M的柠檬酸盐缓冲液。在-20℃下储存酶混合物和重复使用高达五倍。
- 通过移液除去酶并用5ml的0.01M柠檬酸盐缓冲液洗根尖在冰上两次更换残留酶。
- 根浸渍
- 洗涤根尖用1ml 96％乙醇仔细在同一表玻璃两次。更换新鲜配制的固定液（75％乙酸：25％乙醇），乙醇。使用10-15每根尖微升固定液。
- 转印根尖连同固定剂到2ml管和崩解根分生组织用解剖针或镊子。挖掘管20次以重新悬浮细胞，以获得一个细胞悬浮液。存储所述细胞悬浮液在-20℃到两个月。
- 细胞悬浮液的滴液
- 放置2-3层水渍薄纸在热板上在50℃下。沉浸显微镜载玻片在冰冷的自来水在冰箱30分钟。而地方上滑动的湿纸巾之上。
- 吸管7-10微升细胞悬浮液，并从20厘米的距离拖放到冷却滑动放置在热板上。吸管上相同的位置上的滑动细胞悬浮液10微升乙酸 - 乙醇混合物中，并保持在热板上进行额外2分钟的幻灯片。放置在热板上滑动而不湿纸巾，并让它干燥1分钟。
- 质量控制和存储媒体Ë幻灯片
- 检查使用相位差显微镜来控制染色体扩散的质量幻灯片。通过在-20℃下浸在96％的乙醇中，在科普林缸使用滑板或者在同一天或存储。
- 鱼类面前，幻灯片预处理;所有步骤都在室温下
- 在含有50ml 2×SSC的科普林缸地方载玻片（20×SSC含有3M NaCl的和300mM的柠檬酸三钠）5分钟。使用镊子，转印滑动到含有3-10分钟加入50ml 45％乙酸的科普林缸。
- 转移幻灯片包含10分钟50毫升2X SSC的科普林缸。转移到载玻片含有50ml 4％甲醛的科普林缸（在2×SSC），并浸泡载玻片10分钟，以固定的染色体。
- 通过漂洗载玻片3次，每次4分钟，在含50ml 2×SSC中科普林缸清除甲醛。脱水在科普林缸载玻片2分钟在一系列的70％，90％和100％的乙醇，分别和干片在垂直位置。
2. 荧光原位杂交（FISH）
- 对于每一个幻灯片，准备20微升杂交液共使用10微升去离子甲酰胺，5微升4×杂交缓冲液（200微升缓冲液中含有80微升20X SSC，8微升的1M的Tris-HCl pH值8.0，1.6微升0.5M的EDTA，11.2微升10微克/微升的鲑精和99.2微升DNA酶的水），3微升探针和2μl的DNA酶的水。
- 加入20微升的每张幻灯片和盖杂交液用24×32毫米遮滑逮捕盖玻片用橡皮泥。同时变性幻灯片探针在80℃下，在热板2分钟。
- 转移到幻灯片湿室和孵化的幻灯片，在37°CO / N避光。冲洗的幻灯片在科普林罐2X SSC取出盖玻片。在含55-60℃2×SSC和一个科普林缸地方幻灯片孵育20分钟。
- 放置载玻片到2X SSC在科普林缸在室温2分钟。脱水的幻灯片在科普林缸为串联的分别为70％，90％和100％的乙醇，2分钟。
- 风干载玻片和染液用1微克/毫升4'，6-二脒基-2- phenylindoline吲哚（DAPI）在抗褪色封固剂，避免强光。
3.微观分析和存储
- 分析用落射荧光显微镜载玻片。过滤器的选择取决于用于探针标记的荧光染料。如果有必要，在4℃黑暗条件下长达一年的时间在商店的幻灯片。
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Representative Results
显微镜载玻片与有丝分裂的中期扩展是由上述的快速风干滴染色体制备方法制备（增刊，图1）。 FISH进行了分析，同时使用，重复和单拷贝序列。图像由一个落射荧光显微镜获得具有一组过滤器能够对应荧光团的激发和通过高灵敏度的CCD单色照相机捕获。用于图像采集，我们使用的计算机具有图像采集软件。采用5S rDNA序列，[铁通] 10和单拷贝探针的有丝分裂中期染色体上的荧光原位杂交实验的结果是独特的，高品质的大麦 （Figre 2A，B），H 球茎 （ 图2C），H。 海鱼，H murinum，H pubiflorum和黑麦 （图2D）。这种方法的显而易见的好处是良好的传播，无损坏和大量的满足 aphase染色体作为成功的FISH分析一个完美的先决条件。能够以存储在细胞悬浮液在-20℃至两个月以制备染色体涂在FISH实验当天。新鲜制备的载玻片也可以储存在-20℃下在96％的乙醇，尽管我们观察到杂交信号上这种染色体的质量相比，新制备中期扩展减小。该方法可以用于制备在谷物高质量染色体敷于一种简单，有效的和可再现的方式，最有可能可以在其他植物物种中使用过。
图 1. 计划描述风干滴植物染色体制备方法的过程。
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图2.鱼大麦 ，H的有丝分裂中期染色体利差球茎和黑麦编写的风干丢弃方法。（A） H.大麦与单拷贝探针（FPct_40752）标记有红色荧光染料。 （B）的 H.大麦与5S rDNA的探针标记的绿色荧光染料。 （C） 球茎大麦与CTT-微标记由绿色荧光染料和 （D） S.黑麦与pSc119.2重复标记的绿色荧光染料。所有染色体进行复用DAPI（红色）。 FISH信号显示为黄色。比例尺= 10微米。 请点击此处查看本figu的放大版本。回覆。
表1. 孵化酶处理对不同品种的时间。
增刊。图1. 相衬和微分干涉对比（DIC）对 大麦 的例子中，空气干燥滴植物染色体制备方法的有丝分裂中期染色体差图像 。（A）中 相位对比图像 在放大200倍的拍摄 和 （B）在630X的放大倍率采取微分干涉对比图像。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
染色体制备实验已进行了使用属于禾本科（禾本科）谷物幼根。所有分析的品种有14相对较长的有丝分裂中期染色体（11-15微米）的二倍体基因组集，属于大型基因组的物种（5.1-7.9 GBP）的。
发芽根长度不超过2厘米，以获得最大的分生组织。分裂细胞同步是由一个20小时长冰-水处理该改进的有丝分裂中期的扩散量10来实现的。
两个步骤是在制备高品质的染色体制剂重要：（I）的50％的相对湿度-55％和酶处理的（Ⅱ）的持续时间。第一点是通过将湿纸组织在热板上在玻片的附近来实现。相对湿度的测定使用湿度计。对于植物的制备的最佳湿度染色体类似于报道基洛夫等人的湿度 。6。上处于最佳相对湿度的染色体质量的积极效应发生由细胞质和细胞壁水解的肿胀。
酶治疗的持续时间是物种依赖性的（ 表1）。酶处理的时间也取决于在乙醇/乙酸根固定和根的大小的时间跨度。较长的根已存储在固定液（高达1年，在4°C）中，时间越长消化根部到适当的等级。充分消化的根材料难以浸渍并会增加制剂的总时间作为长期持续浸渍的结果。此外，中期染色体保持嵌入到细胞质中，可能妨碍FISH实验过程中随之而来的探头渗透。另一方面过度消化材料可以影响染色体本身的结构，并破坏靶DN一种用于FISH分析。
用于制备的改善的另外一个因素是使用固定剂的第二降（3：1，乙酸/乙醇）的。高浓度的乙酸在该混合物的刺激细胞质的消化，并促进染色体中的物种与大染色体扩散。细胞质还原也可以在幻灯片染色体的固定化之后进行。为了这个目的携带染色体差显微镜载玻片可以在45％的乙酸中，在室温孵育2-10分钟，这取决于细胞质水平。用相位差显微镜进行染色体差的质量检查，没有任何补充染色（例如，1％的乙酰-CARMIN）。通常超过25幻灯片含有高品质的染色体差可以从使用上述方法20根来获得。
采用5S rDNA序列，[铁通] 10对有丝分裂中期染色体的FISH实验的结果，和6K的b长单拷贝探针（FPct_40752）分别为不同的高品质的上述（ 图2）中描述的所有物种和。这种方法的显而易见的好处是作为成功的FISH分析了完善的前提条件良好的蔓延，没有损坏和大量的中期染色体。能够以存储在细胞悬浮液在-20℃至两个月以制备染色体涂在FISH实验当天。新鲜制备的载玻片也可以储存在-20℃下在96％的乙醇，尽管我们观察到杂交信号上这种染色体的质量相比，新制备中期扩展减小。
制备由快速风干滴技术染色体差均适宜FISH和被再现的次数。该染色体的制备方法与FISH的组合可以被广泛地应用到探索在植物基因组中的组织，例如，对于核型11，彩色石印OMAL映射12，在合成的研究，以及对物理和遗传图谱13的集成。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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