Abstract
Herstellung von Chromosom-Spreads ist eine Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH). Herstellung von hochwertigen Pflanzenchromosom Spreads ist eine Herausforderung durch die starre Zellwand. Eine der anerkannten Methoden zur Herstellung von Pflanzenchromosomen ist eine so genannte Drop Zubereitung, die auch Drop Verstreuen oder lufttrocknende Technik bekannt. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die schnelle Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads für die FISH Nachweis einzelner und hohe Kopier DNA-Sonden. Dieses Verfahren ist eine verbesserte Variante des lufttrockenen Tropfenverfahren unter einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% bis 55% durchgeführt. Dieses Protokoll besteht aus einer verringerten Anzahl von Waschschritten machte die Anwendung einfach, effizient und reproduzierbar. Offensichtliche Vorteile dieses Ansatzes sind gut verbreitet, unbeschädigt und zahlreiche Metaphasechromosomen als eine perfekte Voraussetzung für eine erfolgreiche FISH-Analyse dient. Mit diesem Protokoll hochwertigen chrom wir erhaltenOsome Spreads und reproduzierbare FISH-Ergebnisse für Hordeum vulgäre, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum und Secale cereale.
Introduction
Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist ein effektives Werkzeug für die physische Zuordnung von Ein- und hohe Kopien Sequenzen an der chromosomalen Ebene. Voraussetzung ist die Herstellung von qualitativ hochwertigen Chromosomenspreads. Es gibt keine allgemeine Chromosomen Vorschrift, die gleichermaßen für die Tier- und Pflanzenzellen wären. Herstellung von Pflanzenchromosomen ist besonders herausfordernd aufgrund der starren Zellwand und Zellplasma verschiedener Konsistenz innerhalb verschiedener Arten. Einer der vorteilhaften Verfahren zur Herstellung von Pflanzenchromosomen ist eine sogenannte Drop-Technik auch als Drop Spreiztechnik und lufttrocknenden Technik 1,2 bekannt. Diese Methode wurde erstmals 1958 von Rothfels und Siminovitch für die in vitro gezüchtet Säugerzellen 3 eingeführt. Später Martin et al. 4 und Kato et al. 5 geeignet ist diese Methode für die Pflanzen.
In jüngerer Zeit ist ein Verfahren namens '& SteamDrop# 39; entwickelt, das Wasserdampf zur Herstellung von nicht überlappenden Chromosomen 6 verwendet. Zwar wurde der positive Einfluss der hohen Luftfeuchtigkeit früheren 7 beobachtet, 'SteamDrop' liefert eine gesteuerte Workflow von hochwertigen Chromosomenpräparate 6. Die Dampfbehandlung bewirkt Dehnung der Chromosomen wahrscheinlich zu einigen Änderungen der chromosomalen Proteinen verbunden. Die Qualität der resultierenden Metaphasespreitungen ist sehr hoch, obwohl der Halte ausreichende Anzahl von kompletten Metaphasespreitungen zur anschließenden FISH Experimente erfordert technisches Know-how.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Herstellung von Getreide mitotischen Chromosomen für die FISH Nachweis einzelner und hohe Kopier Sonden 5,8. Dieses Verfahren ist eine verbesserte Variante des von Kato 9 unter einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% bis 55% durchgeführt (Abbildung 1) beschriebenen lufttrockenen Tropfverfahren. Dieses Protokoll eine reduzierte Anzahl umfasstder Waschschritte machen seine Anwendung einfach, effizient und reproduzierbar. Unter Verwendung dieses Protokolls erlangten hochwertigen Chromosomenspreads und FISH-Ergebnisse für Hordeum vulgäre, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum und Secale cereale.
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Protocol
1. Chromosomenpräparation
- Keimung der Samen und die Fixierung des Wurzelspitzen
- Keimen 10-20 Gerstensamen auf zwei Lagen von feuchtem Filterpapier in einer Petrischale unter dunklen Bedingungen 2 Tage bei 22-24 ° C. Abgeschnitten kräftige Wurzeln mit der Länge von 1-2 cm vom Samen unter Verwendung einer Rasierklinge.
- Bereiten Sie eiskaltes Wasser, indem ein 500 ml-Glasflasche mit kaltem Leitungswasser in zerstoßenes Eis-Wasser. Lüften Sie den eiskalten Wasser und tauchen Sie den Wurzelspitzen 20 Stunden, um die Frequenz des Metaphase-Zellen zu erhöhen.
- Bringen Wurzeln aus dem Wasser, um 50 ml Ethanol: Essigsäure (3: 1) Fixierungsmittel, um sie bei Raumtemperatur für 2 Tage zu beheben. Speicher Wurzeln in eine frisch hergestellte Ethanol: Essigsäure (3: 1) Fixiermittel bei 4 ° C bis zur Verwendung bis zu einem Jahr.
- Waschen und Enzymbehandlung
- 5 min zweimal mit einem 50 ml Becherglas waschen 10-20 Wurzeln mit 30 ml eiskaltem Leitungswasser. Verwenden Binokular. Übertragen Wurzeln nacheinander in30 ml 0,01 M Citratpuffer (0,01 M Citronensäure + 0,01 M Natriumcitrat, pH 4,8) unter Verwendung einer Pinzette und wäscht zweimal durch Schütteln des Becherglas für 5 min. Platzieren Wurzeln auf Filterpapier, um die Flüssigkeit vollständig zu entfernen und Trenn unerwünschte nicht Meristemgewebe mit einer Rasierklinge.
- Inkubieren bis 20 Wurzelspitzen in 1 ml Enzymgemisch bei 37 ° C für ca. 50 min, das Pflanzengewebe erweichen (Tabelle 1) in einem Uhrglas. Enzymmischung enthält 0,7% Cellulase R10, 0,7% Cellulase, 1% Pectolyase und 1% Cytohelicase in 0,01 M Citratpuffer verdünnt. Speichern das Enzymgemisch bei -20 ° C und bis zu fünf Mal wiederverwendet.
- Entfernen Sie das Enzym durch Pipettieren und waschen Sie die Wurzelspitzen auf Eis mit 5 ml 0,01 M Citratpuffer zweimal, um das restliche Enzym zu ersetzen.
- Root Mazeration
- Wash Wurzelspitzen mit 1 ml 96% igem Ethanol zweimal vorsichtig auf die gleiche Uhrglas. Ethanol mit frisch zubereiteten Fixierungsmittel (25% Ethanol 75% Essigsäure) zu ersetzen. Verwenden Sie 10-15ul Fixiermittel pro Wurzelspitze.
- Übertragungswurzelspitzen zusammen mit dem Fixierungsmittel in ein 2-ml-Röhrchen und zerfallen Wurzelmeristemen mit Seziernadel oder Pinzette. Tippen Sie auf das Rohr 20 mal zu resuspendieren Zellen, um eine Zellsuspension zu erhalten. Bewahren Sie die Zellsuspension bei -20 ° C bis zu zwei Monate.
- Dropping der Zellsuspension
- Man gibt 2-3 Schichten von mit Wasser getränkten Papiertuch auf einer heißen Platte bei 50 ° C. Tauchen Objektträger in eiskaltem Leitungswasser in den Kühlschrank für 30 Minuten. Ort und gleitet auf dem feuchten Papiertuch.
- Pipette 7-10 ul der Zellsuspension und legen Sie sie in einem Abstand von 20 cm auf die gekühlten Schieber auf der Heizplatte gelegt. Je 10 & mgr; l Essigsäure-Ethanol-Gemisch auf der gleichen Stelle wie Zellsuspension auf der Folie und halten Sie den Schieber auf der heißen Platte für weitere 2 min. Setzen Sie den Schieber auf der heißen Platte ohne die Feuchttuch und lassen Sie es für 1 min trocknen.
- Qualitätskontrolle und storage von Dias
- Überprüfen Sie Dias mit einem Phasenkontrastmikroskop, um die Qualität des Chromosoms Ausbreitung zu kontrollieren. Verwenden Sie Folien entweder am selben Tag oder Wert auf in 96% Ethanol bei -20 ° C eingetaucht in eine Coplin-Gefäß.
- Eine Vorbehandlung der Folien vor FISH; Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt
- Die Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 50 ml 2 × SSC (20x SSC enthält 3 M NaCl und 300 mM Trinatriumcitrat) für 5 min. Mit einer Pinzette, Transferfolien in einen Coplin-Gefäß mit 50 ml 45% Essigsäure für 3-10 min.
- Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 50 ml 2 × SSC für 10 Minuten. Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 50 ml 4% Formaldehyd (in 2x SSC) und tauchen Folien für 10 Minuten, um Chromosomen zu beheben.
- Entfernen Formaldehyd durch Spülen der Objektträger 3 mal pro 4 min, in einer Glasküvette mit 50 ml 2 × SSC. Dehydratisieren Folien in einer Coplin-Gefäß für 2 min in der Reihe von 70%, 90% und 100% Ethanol um und trocken gleitet in einem vertikalenPosition.
2. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
- Für jede Folie, bereiten eine Hybridisierungslösung von 20 ul insgesamt mit 10 ul deionisiertem Formamid, 5 & mgr; l 4x Hybridisierungspuffer (200 ul Puffer enthält 80 ul 20x SSC, 8 ul 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 ul 0,5 M EDTA, 11,2 & mgr; l 10 ug / ul Lachssperma und 99,2 ul DNase-freies Wasser), 3 & mgr; l der Sonde und 2 ul DNase-freiem Wasser.
- In 20 ul Hybridisierungslösung pro Folie und Deckel mit einem 24 x 32 mm Deckglas und die Festnahme des Deckglas mit Gummi-Zement. Denaturieren Folien mit Sonden gleichzeitig bei 80 ° C für 2 Minuten auf einer heißen Platte.
- Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Objektträger bei 37 ° CO / N Vermeidung von Licht. Entfernen Sie Deckgläser durch Spülen der Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 2x SSC. Die Objektträger in eine Glasküvette mit 55-60 ° C 2 × SSC und Inkubation für 20 min.
- Legen Sie die Folien an SSC in einer Coplin-Gefäß für 2 min bei RT 2x. Dehydratisieren Folien in einer Coplin-Gefäß für 2 min in der Reihe von 70%, 90% und 100% Ethanol auf.
- Der Luft trocknen die Folien und Gegenfärbung mit 1 ug / ml 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindolin (DAPI) in Antibleich Eindeckmedium, vermeiden Sie intensives Licht.
3. Die mikroskopische Analyse und Speicherung
- Analysieren Sie die Folien mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop. Die Auswahl der Filter hängt von der Fluorochrom für die Sondenmarkierung eingesetzt. Falls erforderlich, speichern gleitet bei 4 ° C bei schlechten Lichtverhältnissen bis zu einem Jahr.
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Representative Results
Objektträger mit den mitotischen Metaphase-Spreads wurden mit dem oben beschriebenen schnellen Luft trocknen Tropf Chromosom Herstellungsverfahren hergestellt (Suppl. 1). FISH-Analyse wurde unter Verwendung von beiden, sich wiederholende und Einzelkopie-Sequenzen durchgeführt. Bilder wurden durch ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Satz von Filtern ermöglicht Anregung entsprechender Fluorophore erhalten und durch eine hochempfindliche CCD monochrome Kamera eingefangen. Für die Bildaufnahme verwendet wird ein Computer mit einer Bildaufnahme-Software. Ergebnisse der FISH Experimente an mitotischen Metaphase-Chromosomen mit 5S rDNA, [CTT] 10 und Einzelkopie-Sonden waren deutliche und von hoher Qualität für Hordeum vulgäre (Figre 2A, B), H. bulbosum (2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum und Secale cereale (2D). Offensichtliche Vorteile dieses Ansatzes sind gut verbreitet, unbeschädigt und zahlreiche erfüllt eine Phasen Chromosomen wie eine perfekte Voraussetzung für eine erfolgreiche FISH-Analyse dient. Es ist möglich, die Zellsuspension bei 20 ° C bis zu zwei Monate lagern und herzustellen Chromosom breitet sich auf den Tag der FISH-Experiment. Frisch hergestellten Folien können auch bei -20 ° C in 96% Ethanol aufbewahrt werden, obwohl wir beobachtet, daß die Qualität der Hybridisierungssignale auf solchen Chromosomen, verglichen mit den frisch präparierten Metaphasespreitungen reduziert. Die Verfahren können verwendet werden, um qualitativ hochwertige Chromosomenspreads Getreide in eine einfache, effiziente und reproduzierbare Weise herzustellen und wahrscheinlich auch in anderen Pflanzenarten zu nutzen.
Abbildung 1. Eine Regelung des Verfahrens der Luft trocknen Tropfpflanzenchromosom Herstellungsverfahren zu beschreiben.
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Abbildung 2. FISH auf mitotische Metaphasechromosom Spreads von Hordeum vulgare, H. bulbosum und Secale cereale von der Luft trocknen Tropfverfahren hergestellt. (A) H. vulgare durch eine einzelne Kopie Sonde (FPct_40752) mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert. (B) H. vulgare mit 5S rDNA-Sonde mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff markiert. (C) H. bulbosum CTT-Mikrosatelliten von einem grün fluoreszierenden Farbstoff und (d) gekennzeichneten S. cereale mit pSc119.2 Wiederholung durch einen grünen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Alle Chromosomen wurden mit DAPI (in rot) gegengefärbt. FISH-Signale werden in gelb dargestellt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figu ansehenRe.
Tabelle 1 Inkubationszeit Enzymbehandlung von verschiedenen Arten.
Suppl. Abbildung 1. Phasenkontrast und Interferenzkontrast (DIC) Bilder von mitotischen Metaphase-Chromosom Spreads der Luft trocknen Tropfpflanzenchromosom Herstellungsverfahren am Beispiel von Hordeum vulgare. (A) Phasenkontrastbild bei 200-facher Vergrößerung und (B) Differentialinterferenzkontrastbild bei 630X Vergrößerung. Bitte klickenSie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Chromosom Vorbereitung Experiment wurde unter Verwendung von jungen Wurzeln von Getreide zu der Familie der Gräser (Poaceae) gehören, durchgeführt. Alle untersuchten Arten haben 14 relativ lange mitotischen Metaphase-Chromosomen (11-15 & mgr; m) in der diploiden Genom-Set und gehören zu großen Genom-Arten (5,1-7,9 GBP).
Länge der gekeimten Wurzeln nicht mehr als 2 cm, maximal Meristemgewebe erhalten. Synchronisation von sich teilenden Zellen wurde durch eine 20 Stunden lang Eis-Wasser-Behandlung, verbessert die Menge der mitotischen Metaphase-Spreads 10 erreicht.
Zwei Schritte sind wichtig für die Herstellung von hochwertigen Chromosomenpräparate: (I) die relative Feuchtigkeit von 50% bis 55% und (II) die Dauer der Enzymbehandlung. Der erste Punkt wurde gemessen, indem feuchte Papiergewebe auf einer heißen Platte in der Nähe der Glasobjektträger erreicht. Die relative Feuchtigkeit wurde mit einem Hygrometer gemessen. Die optimale Feuchtigkeit für die Herstellung von PflanzenChromosomen war ähnlich wie die Feuchtigkeit durch Kirov et al. 6. Der positive Effekt auf das Chromosom Qualität zu optimalen relativen Feuchte erfolgt durch Quellung des Cytoplasmas und der Zellwand Hydrolyse.
Die Dauer der Enzymbehandlung ist speziesabhängig (Tabelle 1). Die Periode der Enzymbehandlung hängt außerdem von der Zeitspanne von dem Wurzelhalt in Ethanol / Essigsäure und der Größe der Wurzeln. Die längeren Wurzeln wurden in der Fixierungsmittel (bis zu 1 Jahr bei 4 ° C), die länger gelagert, es braucht, um Wurzeln zu der richtigen Sorte verdauen. Unzureichend verdaut Wurzelmaterial ist schwer zu zerkleinern und die Gesamtzeit der Vorbereitung als Folge der lang anhaltende Mazeration erhöhen. Darüber hinaus bleiben Metaphasechromosomen ins Zytoplasma, die behindern könnten anschließenden Sondenpenetration während des FISH Experiment eingebettet. Auf der anderen Seite kann über verdaute Material, die Struktur der Chromosomen selbst und Schäden Ziel DN beeinflussenEin für die FISH-Analyse.
Ein zusätzlicher Faktor für die Verbesserung der Herstellung ist die Verwendung der zweiten Tropfen der Fixierungsmittel (3: 1 Essigsäure / Ethanol). Hohe Essigsäurekonzentration in dieser Mischung fördert die Verdauung von Zytoplasma und fördert Chromosom Ausbreitung in Art mit großen Chromosomen. Zytoplasma Reduktion kann auch nach der Immobilisierung der Chromosomen auf Folien nehmen. Hierzu Objektträger tragenden Chromosom-Spreads ist in 45% iger Essigsäure bei RT für 2-10 min, je nach Zytoplasma Ebene inkubiert werden. Qualitätskontrolle von Chromosom-Spreads wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop ohne zusätzliche Färbung (zB 1% Aceto-Carmin) durchgeführt. Normalerweise mehr als 25 Objektträgern mit hoher Qualität Chromosomenspreads aus 20 Wurzeln mit dem vorstehenden Verfahren erhalten werden.
Ergebnisse der FISH Experimente an mitotischen Metaphase-Chromosomen mit 5S rDNA, [CTT] 10, und 6 kb langen Einzelkopie-Sonde (FPct_40752) waren deutliche und von hoher Qualität für alle oben (Abbildung 2) beschriebenen Arten. Offensichtliche Vorteile dieses Ansatzes sind gut verbreitet, unbeschädigt und zahlreiche Metaphasechromosomen als eine perfekte Voraussetzung für eine erfolgreiche FISH-Analyse dient. Es ist möglich, die Zellsuspension bei 20 ° C bis zu zwei Monate lagern und herzustellen Chromosom breitet sich auf den Tag der FISH-Experiment. Frisch hergestellten Folien können auch bei -20 ° C in 96% Ethanol aufbewahrt werden, obwohl wir beobachtet, daß die Qualität der Hybridisierungssignale auf solchen Chromosomen, verglichen mit den frisch präparierten Metaphasespreitungen reduziert.
Chromosomen-Spreads durch die schnelle Luft trocknen Tropftechnik hergestellt waren geeignet für Fisch und wurden mehrmals wiedergegeben. Kombination dieses Chromosom Herstellungsverfahren mit FISH konnten weit angewendet, um die Genomorganisation in Pflanzen zu erforschen, zum Beispiel werden, Karyotypisierung 11, chromosomal Mapping 12, Synthesestudien und für die Integration der physikalischen und genetischen Karten 13.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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