Abstract
Bereiding van chromosoom spreads is een voorwaarde voor de succesvolle uitvoering van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Voorbereiding van hoogwaardige plantaardige chromosoom spreads is een uitdaging te wijten aan de starre celwand. Eén van de erkende werkwijzen voor de bereiding van plantaardige chromosomen is een zogenaamd druppel preparaat, ook wel drop verspreiding of lucht-droogtechniek. Hier presenteren we een protocol voor de snelle bereiding van mitotische chromosoom spreads geschikt voor de FISH detectie van enkele en hoog kopie DNA-sondes. Deze werkwijze is een verbeterde variant van de luchtdroge neerzetten uitgevoerd onder een relatieve vochtigheid van 50% -55%. Dit protocol omvat een gereduceerd aantal wasstappen van zijn aanvraag eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Duidelijke voordelen van deze aanpak zijn goed gespreid, onbeschadigd en tal metafasechromosomen dienen als een perfecte voorwaarde voor een succesvolle FISH analyse. Met behulp van dit protocol verkregen wij hoogwaardige chromOsome spreads en reproduceerbare FISH resultaten voor Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum en Secale cereale.
Introduction
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een doeltreffend instrument voor de fysieke kaart brengen van enkele en hoog kopie sequenties op het chromosomaal niveau. Voorwaarde is de bereiding van hoge kwaliteit chromosoom spreads. Er is geen algemene chromosoom voorbereiding protocol dat even geschikt voor dier- en plantencellen zou zijn. Bereiding van plantaardige chromosomen is bijzonder uitdagend te wijten aan de starre celwand en diverse cytoplasma consistentie binnen verschillende soorten. Eén van de gunstige werkwijzen voor de bereiding van plantaardige chromosomen is een zogenaamd druppel techniek ook wel drop strooitechniek en air-droogtechniek 1,2. Deze werkwijze werd eerst geïntroduceerd in 1958 door rothfels en Siminovitch in vitro gekweekt zoogdiercellen 3. Later Martin et al. 4 en Kato et al. 5 aangepaste methode voor planten.
Recenter een werkwijze genaamd "SteamDrop &# 39; ontwikkeld dat waterdamp voor de bereiding van niet-overlappende chromosomen 6. Hoewel de positieve invloed van een hoge luchtvochtigheid was eerder 7 waargenomen, 'SteamDrop' levert een gecontroleerde workflow van hoogwaardige chromosoom voorbereiding 6. De stoombehandeling veroorzaakt rekken chromosomen waarschijnlijk verbonden met een aantal wijzigingen van chromosomale eiwitten. De kwaliteit van de verkregen metafase smeersels is zeer hoog, hoewel behoud van voldoende totale metafase spreads volgende FISH experimenten vereist technische expertise.
Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding van de mitotische granen chromosomen die geschikt zijn voor de FISH detectie van enkele en hoog kopie sondes 5,8. Deze werkwijze is een verbeterde variant van de luchtdroge dropping beschreven door Kato 9 uitgevoerd onder relatieve vochtigheid van 50% -55% (figuur 1). Dit protocol omvat een gereduceerd aantalvan wasstappen maken van de toepassing ervan eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Met behulp van dit protocol verkregen wij hoogwaardige chromosoom spreads en FISH resultaten voor Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum en Secale cereale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chromosome Voorbereiding
- Zaadontkieming en fixatie van wortelpunten
- 10-20 zaden ontkiemen gerst twee lagen vochtig filtreerpapier in een petrischaal onder donkere omstandigheden gedurende 2 dagen bij 22-24 ° C. Snijd krachtige wortels met een lengte van 1-2 cm uit het zaad door gebruik van een scheermesje.
- Bereid ijskoud water door het plaatsen van een 500 ml glazen fles met koud leidingwater in gemalen ijs-water. Beluchten het ijskoude water en dompel wortel tips voor 20 uur om de frequentie van de metafasecellen verhogen.
- Transfer wortels water tot 50 ml ethanol: azijnzuur (3: 1) fixeermiddel ze op te lossen bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. WINKEL wortels in een vers bereide ethanol: azijnzuur (3: 1) fixatief bij 4 ° C tot gebruik tot een jaar.
- Wassen en enzymbehandeling
- Was de 10-20 wortels met 30 ml ijskoud kraanwater gedurende 5 minuten tweemaal met een 50 ml glazen beker. Gebruik binoculair microscoop. Overdracht roots een voor een in30 ml 0,01 M citraatbuffer (0,01 M citroenzuur + 0,01 M natriumcitraat, pH 4,8) met behulp van een tang en was door schudden bekerglas gedurende 5 min tweemaal. Plaats wortels op filterpapier om de vloeistof volledig te verwijderen en cut-off ongewenste niet-meristeemweefsel met een scheermesje.
- Incubeer maximaal 20 wortelpunten in 1 ml enzymmengsel bij 37 ° C gedurende 50 min naar het plantenweefsel te verzachten (tabel 1) in een horlogeglas. Enzymmengsel bevat 0,7% cellulase R10, 0,7% cellulase, 1% en 1% Pectolyase cytohelicase verdund in 0,01 M citraatbuffer. Bewaar het enzymmengsel bij -20 ° C en opnieuw maximaal vijf keer.
- Verwijder het enzym door pipetteren en was de wortel tips op ijs met 5 ml 0,01 M citraatbuffer twee keer om de resterende enzym te vervangen.
- Root maceratie
- Was wortelpunten met 1 ml 96% ethanol tweemaal zorgvuldig in dezelfde horlogeglas. Vervang ethanol met vers bereide fixatief (75% azijnzuur 25% ethanol). Gebruik 10-15ul fixatief per wortel tip.
- Transfer wortelpunten samen met het fixeermiddel in een 2 ml buisje en desintegreren wortel meristemen met een dissectie naald of pincet. Tik de buis 20 tijden resuspendeer cellen om een celsuspensie te verkrijgen. Bewaar de celsuspensie bij -20 ° C tot twee maanden.
- Het laten vallen van de celsuspensie
- Plaats 2-3 lagen water doordrenkte papieren tissue op een hete plaat bij 50 ° C. Dompel microscopische preparaten in ijskoud water uit de kraan in de koelkast gedurende 30 minuten. En plaats glijdt bovenop de vochtige papieren tissue.
- Pipet 7-10 ul van celsuspensie en zet het op een afstand van 20 cm op de gekoelde dia geplaatst op de hete plaat. Pipetteer 10 gl azijnzuur-ethanol mengsel op dezelfde plaats als celsuspensie op de dia en houd de schuif op de hete plaat gedurende nog 2 min. Plaats de dia op de hete plaat zonder het natte doekje en laat het drogen gedurende 1 minuut.
- Kwaliteitscontrole en opbergdoose glijbanen
- Controleer slides met een fasecontrastmicroscoop de kwaliteit van het chromosoom spread besturen. Gebruik slides hetzij dezelfde dag of op te slaan door onderdompeling in 96% ethanol in een Coplin jar bij -20 ° C.
- Voorbehandeling van dia's voor vis; alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd
- Plaats de glaasjes in een Coplin pot met 50 ml 2x SSC (20x SSC bevat 3 M NaCl en 300 mM trinatriumcitraat) gedurende 5 min. Met behulp van een tang, overdracht van dia's een Coplin pot met 50 ml 45% azijnzuur voor 3-10 min.
- Transfer schuift een Coplin pot met 50 ml 2 x SSC gedurende 10 minuten. Overdracht dia's een Coplin pot met 50 ml van 4% formaldehyde (in 2x SSC) en dompel dia's voor 10 min om chromosomen te lossen.
- Verwijder formaldehyde door spoelen van de glaasjes 3 keer gedurende 4 minuten elk, in een Coplin pot met 50 ml 2 x SSC. Uitdrogen objectglaasjes in een Coplin jar gedurende 2 min in series van 70%, 90% en 100% ethanol, respectievelijk droge schuift verticaalpositie.
2. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH)
- Voor elk objectglaasje, stelt een hybridisatie-oplossing van 20 ul in totaal via 10 pl gedeioniseerd formamide, 5 ui 4x hybridisatiebuffer (200 pl buffer bevat 80 pl 20x SSC, 8 pi 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 ui 0,5 M EDTA, 11,2 gl 10 ug / ul zalmsperma en 99,2 ul DNase-vrij water), 3 pl van de probe en 2 gl DNase-vrij water.
- Voeg 20 ul van hybridisatie-oplossing per glijbaan en deksel met een 24 x 32 mm dekglas en arresteren de cover slip met rubber cement. Denatureren slides met probes gelijktijdig bij 80 ° C gedurende 2 minuten op een hete plaat.
- Transfer schuift een vochtige kamer en incubeer glijbanen bij 37 ° CO / N vermijden licht. Verwijder dekglaasjes door het spoelen van de dia's in een Coplin pot met 2x SSC. Plaats de glaasjes in een Coplin pot met 55-60 ° C 2x SSC en incubeer gedurende 20 min.
- Plaats de dia's 2x SSC in een Coplin jar gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Uitdrogen objectglaasjes in een Coplin jar gedurende 2 min in series van 70%, 90% en 100% ethanol, respectievelijk.
- Lucht drogen de dia's en tegenkleuring met 1 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) in antifade montage medium, vermijd intens licht.
3. Microscopische Analyse en opslag
- Analyseer de dia's met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. De keuze van de filter afhankelijk van de fluorochroom voor probe labeling. Eventueel slides opslag bij 4 ° C onder donkere omstandigheden tot een jaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microscopische objectglaasjes met metafase mitotische smeersels werden bereid met een snelle drogen dropping chromosoom bereidingsmethode beschreven (Suppl. Figuur 1). FISH analyse werd uitgevoerd met zowel repetitief en single-copy sequenties. Beelden werden verkregen door een epifluorescentiemicroscoop met een set van filters waardoor excitatie van overeenkomstige fluoroforen en opgevangen door een zeer gevoelige CCD monochrome camera. Voor het beeld overname gebruikten we een computer met een beeld acquisitie software. De resultaten van de FISH experimenten op mitotische metafase chromosomen behulp 5S rDNA, [CTT] 10 en losse probes waren gescheiden en van een uitstekende kwaliteit voor Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (figuur 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum en Secale cereale (figuur 2D). Duidelijke voordelen van deze aanpak zijn goed gespreid, onbeschadigd en tal ontmoetten APhase chromosomen die als een perfecte voorwaarde voor een succesvolle FISH analyse. Het is mogelijk om de celsuspensie te bewaren bij -20 ° C tot twee maanden en voorbereiding het chromosoom spreads op de dag van de FISH experiment. Vers bereide objectglaasjes kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in 96% ethanol, hoewel we vastgesteld dat de kwaliteit van hybridisatiesignalen op zulke chromosomen verminderd vergeleken met het vers bereide metafase spreads. De werkwijzen kunnen worden gebruikt om hoge-kwaliteit chromosoom spreads granen bereiden op een eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare wijze en waarschijnlijk kan worden gebruikt in andere plantensoorten ook.
Figuur 1. Een schema beschrijft de procedure van de lucht drogen dropping fabriek chromosoom bereidingswijze.
es / ftp_upload / 53.470 / 53470fig2.jpg "/>
Figuur 2. FISH op mitotische metafase chromosoom spreads van Hordeum vulgare, H. bulbosum en Secale cereale opgesteld door de lucht drogen dropping methode. (A) H. vulgare één enkele kopie probe (FPct_40752) gemerkt met een rode fluorescerende kleurstof. (B) H. vulgare met 5S rDNA probe gelabeld met een groen fluorescerende kleurstof. (C) H. bulbosum met CTT-microsatelliet gelabeld met een groen fluorescerende kleurstof en (D) S. cereale met pSc119.2 herhalen gelabeld met een groen fluorescerende kleurstof. Alle chromosomen werden tegengekleurd met DAPI (in het rood). FISH signalen worden getoond in het geel. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenopnieuw.
Tabel 1. Incubatietijd enzym behandeling van verschillende soorten.
Suppl. Figuur 1. Fase-contrast en differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van mitotische metafase chromosoom spreads van de lucht-droge dropping fabriek chromosoom bereidingswijze op het voorbeeld van Hordeum vulgare. (A) Het fase-contrast bij 200X vergroting genomen en (B) het differentieel interferentie contrast genomen bij 630X vergroting. Klikhier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het chromosoom voorbereiding experiment is uitgevoerd met behulp van de jonge wortels van granen behoren tot het gras familie (Poaceae). Alle geanalyseerde soorten hebben 14 relatief lange mitotische metafasechromosomen (11-15 pm) in het diploïde genoom set en behoren tot grote genoom-soorten (5,1-7,9 GBP).
Lengte van ontkiemde wortels niet meer dan 2 cm tot maximaal meristeem weefsel te verkrijgen. Synchronisatie van delende cellen werd bereikt door een 20 uur lange ijswater behandeling die verbeterde de hoeveelheid mitotische metafase spreads 10.
Twee stappen zijn belangrijk voor de bereiding van hoogwaardige chromosoompreparaten: (I) de relatieve vochtigheid van 50% -55% en (II) de duur van de enzymbehandeling. Het eerste punt werd bereikt door natte papieren tissues op een hete plaat in de nabijheid van de glasplaatjes. De relatieve vochtigheid werd gemeten met een hygrometer. De optimale vochtigheid voor de bereiding van plantaardigechromosomen was vergelijkbaar met de vochtigheid die door Kirov et al. 6. Het positieve effect op het chromosoom kwaliteit met optimale relatieve vochtigheid optreedt met zwelling van het cytoplasma en de celwand hydrolyse.
De duur van de behandeling is afhankelijk enzym species (Tabel 1). De periode enzym behandeling hangt ook af van de tijdspanne van wortelgroei in ethanol / azijnzuur en de grootte van de wortels. De langere wortels werden opgeslagen in het fixeermiddel (tot 1 jaar bij 4 ° C), hoe langer het duurt om wortels te verteren om de juiste graad. Onvoldoende gedigereerd wortelmateriaal moeilijk te macereren en de totale voorbereidingstijd toenemen als gevolg van langdurige maceratie. Bovendien metafase chromosomen ingebed blijven in cytoplasma zou kunnen belemmeren daaropvolgende sondepenetratie tijdens de FISH experiment. Anderzijds kan via gedigereerde materiaal de structuur van de chromosomen zelf en schade doel DN beïnvloedenEen voor FISH analyse.
Een bijkomende factor ter verbetering van het preparaat is het gebruik van de tweede druppel fixatief (3: 1, azijnzuur / ethanol). Hoge concentratie van azijnzuur in dit mengsel bevordert de vertering van cytoplasma en bevordert chromosoom Binnendringen in species met grote chromosomen. Cytoplasma reductie kan ook plaatsvinden na immobilisatie van de chromosomen op objectglaasjes. Hiertoe microscoop objectglaasjes die het chromosoom spreads in 45% azijnzuur bij kamertemperatuur kan worden gedurende 2-10 min afhankelijk cytoplasma niveau. Kwaliteitscontrole van chromosoom spreads werd uitgevoerd met een fasecontrastmicroscoop zonder aanvullende kleuring (bijvoorbeeld 1% aceto-carmin). Gewoonlijk meer dan 25 slides met hoogwaardige chromosoom spreads kunnen worden verkregen uit wortels 20 met de hierboven beschreven methode.
De resultaten van de FISH experimenten op mitotische metafasechromosomen met 5S rDNA, [CTT] 10, en 6 kb lange losse sonde (FPct_40752) waren duidelijk en van een hoge kwaliteit voor alle soorten hoger (figuur 2) beschreven. Duidelijke voordelen van deze aanpak zijn goed gespreid, onbeschadigd en tal metafasechromosomen dienen als een perfecte voorwaarde voor een succesvolle FISH analyse. Het is mogelijk om de celsuspensie te bewaren bij -20 ° C tot twee maanden en voorbereiding het chromosoom spreads op de dag van de FISH experiment. Vers bereide objectglaasjes kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in 96% ethanol, hoewel we vastgesteld dat de kwaliteit van hybridisatiesignalen op zulke chromosomen verminderd vergeleken met het vers bereide metafase spreads.
Chromosoom spreads opgesteld door de snelle lucht drogen dropping techniek geschikt waren voor vissen en werden gereproduceerd een aantal keren. Combinatie van deze chromosoom bereidingswijze met FISH zeer breed worden toegepast op de organisatie van het genoom in planten staand bijvoorbeeld voor karyotypering 11, chromosomal mapping 12, synthetische studies en voor de integratie van fysische en genetische kaarten 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M.
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
