Abstract
Kromozom yayılır hazırlanması floresan in situ hibridizasyon başarılı performansı (FISH) için bir ön koşuldur. Yüksek kaliteli bitki kromozom yayılır hazırlanması nedeniyle sert hücre duvarına zordur. Bitki kromozomlarına hazırlanması için onaylanmış yöntemlerden biri olarak adlandırılan bir damla hazırlanması da damla yayılan ya da hava-kurutma tekniği olarak bilinmektedir. Burada, mitotik kromozom hızlı hazırlanması için bir protokol tek ve yüksek kopya DNA probları BALIK tespiti için uygundur yayılır sunuyoruz. Bu yöntem, 50% -55% arasında bağıl nem altında gerçekleştirilen havada kuru damla yöntemin geliştirilmiş bir varyantıdır. Bu protokol, uygulama, kolay, verimli ve tekrarlanabilir hale yıkama aşamaları, daha az sayıda içerir. Bu yaklaşımın bariz faydaları başarılı FISH analizi için mükemmel bir önkoşul olarak hizmet veren iyi yayılmış, hasarsız ve çok sayıda metafaz kromozomları vardır. Bu protokolü kullanarak yüksek kaliteli chrom eldeosome yayılır ve Hordeum vulgare H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum ve Secale cereale'den için tekrarlanabilir FISH sonuçları.
Introduction
In situ hibridizasyon (FISH) Floresan kromozom düzeyinde tek ve yüksek kopya dizilerinin fiziksel haritalama için etkili bir araçtır. Koşul, yüksek kaliteli kromozom yayılımlarının hazırlanmasıdır. Hayvan ve bitki hücreleri için aynı derecede uygun olacaktır genel kromozom hazırlama protokolü vardır. Bitki kromozomların hazırlanması nedeniyle farklı türlerin içinde sert hücre duvarı ve çeşitli sitoplazma kıvamına özellikle zordur. Bitki kromozom hazırlanması için olan uygun yöntemlerden biri de damla yayılan tekniği ve hava-kurutma tekniği 1,2 olarak bilinen olarak adlandırılan bir damla bir tekniktir. Bu yöntem ilk olarak, in vitro yetiştirilen memeli hücrelerinin 3 Rothfels ve Siminovitch tarafından 1958 yılında tanıtıldı. Daha sonra Martin ve ark. 4 ve Kato ve diğ. 5 bitkiler için bu yöntemi uyarlanmıştır.
Daha yakın zamanlarda, adlı bir yöntem 'SteamDrop ve# 39; örtüşmeyen kromozom 6 hazırlanması için kullanılan su buharına geliştirildi. , Yüksek nem olumlu etkisi daha erken 7 gözlenmesine rağmen, 'SteamDrop' yüksek kaliteli kromozom hazırlıkları 6 kontrollü bir iş akışı sağlar. Buhar tedavi muhtemelen kromozomal proteinler, bazı değişikliklere bağlı kromozomların gerilmesine neden olur. Tam metafaz yeterli sayıda tutma sonraki FISH deneyler için teknik uzmanlık gerektirir yayılır rağmen metafazlarda sonuçlanan kalitesi çok yüksektir.
Burada tek ve yüksek kopya probları 5,8 FISH tespiti için uygun mitotik tahıl kromozom hazırlanması için bir protokol mevcut. Bu yöntem, Kato 50% -55% bağıl nem altında gerçekleştirilir 9 (Şekil 1) tarafından tarif havada kuru damlatma yöntemi geliştirilmiş bir varyantıdır. Bu protokol daha az sayıda içerenuygulaması kolay, verimli ve tekrarlanabilir hale yıkama adımları. Biz Hordeum vulgare H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum ve Secale cereale'den için yüksek kaliteli kromozom yayılır ve FISH sonuçları elde bu protokolü kullanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kromozom Hazırlık
- Çimlenme ve kök uçları tespit
- 22-24 ° C'de 2 gün boyunca, karanlık koşullar altında bir Petri kabı içinde nemli filtre kağıdı, iki katmanlar üzerinde 10-20 arpa tohumları filizlenmeye. Bir jilet kullanılarak tohum 1-2 cm uzunluğunda güçlü kökleri kesin.
- Parçalanmış buz-su içine soğuk musluk suyu ihtiva eden 500 ml'lik bir cam şişe yerleştirerek buz soğukluğunda su hazırlayın. Buz soğuk su havalandırmak ve metafaz hücrelerinin sıklığını artırmak için 20 saat boyunca kök ipuçları batırmayın.
- 50 ml etanol, su kökleri transfer: asetik asit (3: 1) sabitleyici 2 gün oda sıcaklığında bunları düzeltmek için. Taze hazırlanmış etanol içerisinde mağazası kökleri: asetik asit (3: 1) ile 4 ° C 'de sabitleyici bir yıla kadar kullanana kadar.
- Yıkama ve enzim tedavisi
- 5 dk iki kez 50 ml'lik bir cam beher kullanarak 30 ml buz gibi soğuk musluk suyu ile 10-20 kökleri yıkayın. Binoküler mikroskop kullanın. Içine birer kökleri tek Transferi30 mi, 0.01 M sitrat tampon maddesi (± 0.01 M sodyum sitrat, 0.01 M sitrik asit, pH 4.8) forseps kullanılarak iki kez 5 dakika boyunca bir cam beher çalkalayarak yıkayın. Tamamen sıvının ve kesme arzu edilmeyen olmayan meristematik doku bir ustura kullanılarak filtre kağıdına kökleri yerleştirin.
- Bir saat cam bitki dokusunun yumuşatmak için yaklaşık 50 dakika boyunca (Tablo 1) 37 ° C 'de, 1 ml enzim karışımında 20 kök uçları kadar inkübe edin. Enzim karışımı, 0.01 M sitrat tampon maddesi içinde seyreltilmiş,% 0.7 Selülaz R10,% 0.7 selülaz,% 1 ve% 1 Pektoliaz cytohelicase içerir. -20 ° C'de enzim karışımı saklayın ve beş kata kadar yeniden.
- Pipetleme enzim çıkarın ve artık enzimin yerine iki kez 5 mi, 0.01 M sitrat tampon maddesi ile buz kök ipuçları yıkayın.
- Kök maserasyon
- Iki kez dikkatli bir şekilde aynı saat camı 1 ml% 96 etanol ile yıkayın kök uçları. Taze hazırlanmış fiksatif (25% etanol% 75 asetik asit), etanol ile değiştirin. 10-15 kullanınKök ucu başına ul fiksatif.
- Diseksiyon iğne veya forseps ile 2 ml tüp içine fiksatif ile birlikte Aktarım kök uçları ve parçalanmaya kök meristemleri. Bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücrelerin yeniden askıya almak için boru 20 kez vurun. İki ay -20 ° C hücre süspansiyonu saklayın.
- Hücre süspansiyonunun Damlama
- 50 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde su ile ıslatılmış kağıt dokusunun 2-3 katmanları yerleştirin. 30 dakika boyunca buzdolabında buz soğuk musluk suyu altında mikroskopik slaytlar bırakın. Ve bir yerde nemli kağıt mendil üstünde kayar.
- Pipet 7-10 hücre süspansiyonu ul ve sıcak plaka üzerine yerleştirilir soğutulmuş slayt üzerine 20 cm mesafeden bırakın. Pipet 10 slayt hücre süspansiyonu aynı yerde asetik asit-etanol karışımı ul ve ek 2 dakika süreyle sıcak plaka slayt tutun. Islak doku olmadan sıcak plaka slayt yerleştirin ve 1 dakika boyunca kurumaya bırakın.
- Kalite kontrolü ve Saklamaslaytlar e
- Kromozom yayılması kalitesini kontrol etmek için bir faz-kontrast mikroskobu kullanarak slaytları edin. -20 ° C'da bir Coplin kavanoz% 96 etanol içinde daldırarak aynı gün veya mağaza ya slaytlar kullanın.
- FISH önce slaytların Tedavi öncesi; Tüm adımlar, oda sıcaklığında yürütülür
- 2x SSC, 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza Slaytları 5 dakika boyunca (20x SSC 3 M NaCl ve 300 mM trisodyum sitrat içeren). 3-10 dakika için% 45 asetik asit 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza forseps, transfer slaytlar kullanılması.
- Aktarım, 10 dakika boyunca 2 x SSC, 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza kayar. 10 dakika boyunca (2x SSC)% 4 formaldehit, 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza transfer slaytlar ve bırakın slaytlar kromozom düzeltmek için.
- 50 ml 2x SSC içeren bir Coplin kavanoza, 4 dakika her biri için slaytlar 3 kez durulama formaldehit çıkarın. Dikey% 70 seri 2 dakika,% 90 ve% 100 etanol, sırasıyla, ve kuru, slaytlar için Coplin kavanoza slaytlar kurutmakpozisyon.
İn Situ Hibridizasyon 2. Floresan (FISH)
- Her bir slayt için deiyonize formamid 10 ul 4x hibritleme tamponu, 5 ul kullanılarak toplam 20 ul hibridizasyon solüsyonu hazırlamak (200 ul tampon 80 ul 20x SSC, 8 ul 1 M Tris-HCI pH 8.0, içeren 1.6 ul 0.5 M EDTA, 11,2 ul 10 ug / ml somon spermi ve 99,2 ul DNase içermeyen su), probun 3 ul DNase içermeyen su 2 ul.
- 24 x 32 mm kapak kayma slayt ve kapak başına melezleme solüsyonu 20 ul ekleyin ve kauçuk çimento ile kapak kayma tutuklama. Sıcak bir plaka üzerinde 2 dakika boyunca 80 ° C'de, aynı anda probları ile slaytlar denatüre.
- Transferi nemli odasına slaytlar ve 37 ° CO / N kaçınarak ışık slaytlar kuluçkaya yatmaktadır. 2x SSC ile Coplin kavanoza slaytlar durulama kapak fişleri çıkarın. Ve 55-60 ° C 2x SSC içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin slaytlar 20 dakika inkübe.
- Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca bir Coplin kavanoza SSC 2x slaytlar yerleştirin. Sırasıyla,% 70,% 90 ve% 100 etanol içinde seri 2 dakika boyunca, bir Coplin kavanoza slaytlar kurutmak.
- Yoğun ışık önlemek antifade montaj orta / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline 1 ug (DAPI) ile slaytlar ve counterstain hava içinde kurutulur.
3. Mikroskobik Analizi ve Depolama
- Epifloresans mikroskop kullanılarak slaytlar analiz edin. Filtrenin seçimi prob etiketleme için kullanılan florokrom bağlıdır. Gerekirse, bir yıla kadar karanlık koşullarda 4 ° C'de mağaza slaytlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitotik metafaz yayılır mikroskopik slaytlar yukarıda tarif edilen hızlı bir havayla kurumaya bırakarak kromozom hazırlama metodu ile hazırlandı (Suppl. Şekil 1). FISH analizi, her iki, tekrarlayıcı ve tek kopyalı sekansları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Görüntüler mukabil fluorophores uyarım sağlayan bir filtre seti ile bir Epifloresans mikroskop ile elde edilen ve yüksek hassasiyetli CCD monokrom kamera tarafından ele geçirildi. Görüntü alımı için biz bir görüntü elde etme yazılımı ile bilgisayar kullanılır. 5S rDNA, [CTT] 10 ve tek kopya problar kullanılarak mitotik metafaz kromozomlarda FISH deneylerin sonuçları farklı ve Hordeum vulgare için yüksek kalitede (Figre 2A, B), H. bulbosum (Şekil 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum ve Secale cereale (Şekil 2D). Bu yaklaşımın bariz faydaları iyi yayılmış, hasarsız ve çok sayıda tanıştım vardır Başarılı FISH analizi için mükemmel bir önkoşul olarak görev aphase kromozomlar. İki ay kadar -20 ° C'de bir hücre süspansiyonu depolamak ve kromozom FISH deney gününde yayılır hazırlanması mümkündür. Bu tür kromozom üzerinde hibritleme sinyalleri kalitesi, taze hazırlanmış metafaz yayılır kıyasla büyük ölçüde azaltıldığı gözlemlenmiştir ama Taze hazırlanmış slaytlar da,% 96 etanol içinde -20 ° C 'de muhafaza edilebilir. Yöntem kolay, verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde tahıllarda yüksek kaliteli kromozom yayılır hazırlamak için de kullanılabilir ve büyük olasılıkla da başka bitki türlerinde de kullanılabilir.
Şekil 1. Hava-kuru bırakarak bitki kromozom hazırlama yöntemi prosedürü anlatan bir şema.
es / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
Hordeum vulgare H. mitotik metafaz kromozom yayılır Şekil 2. BALIK Hava-kuru bırakarak yöntemi ile hazırlanan bulbosum ve Secale cereale. (A) H. kırmızı floresan boya ile etiketlenmiş tek bir kopya prob (FPct_40752) ile vulgare. (B) H. yeşil floresan boya ile işaretlenmiş 5S rDNA probu ile vulgare. (C) Yeşil floresan boya ve etiketli CTT-microsatellite H. bulbosum (D) Yeşil floresan boya ile işaretlenmiş pSc119.2 tekrar S. cereale. Tüm kromozomların (kırmızı) DAPI ile zıt. FISH sinyallerini, sarı olarak gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 10 mikron. Bu figu büyük halini görmek için tıklayınızyeniden.
Farklı türlerin enzimin tedavi Tablo 1. İnkübasyon süresi.
Ek. Şekil 1. Faz-kontrast ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) Hordeum vulgare Örneğin hava-kuru bırakarak bitki kromozom hazırlama yönteminin mitotik metafaz kromozom yayılır görüntüler. (A) Faz kontrastlı görüntü 200X defa büyütülerek çekilmiş, ve (B) 630X büyütmede çekilen Diferansiyel girişim kontrastlı görüntü. tıklayınızBurada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kromozom, hazırlanışı deney ot familyasının (Poaceae) ait olan hububat genç kökleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm analiz türler diploid genom sette 14 nispeten uzun mitotik metafaz kromozomları (11-15 mikron) ve büyük genom türlerinin (5,1-7,9 Sterlin) aittir.
Çimlenmiş köklerinin uzunluğu meristematik doku maksimum elde etmek için en fazla 2 cm değildi. Bölünen hücrelerin eşitleme mitotik metafaz miktarı 10 yayılır geliştirilmiş bir 20 saat kadar buzlu su muamele ile elde edilmiştir.
(I) 'e göre% 50 nem ve% -55 enzim işlemi (II) süresi: iki adım yüksek kaliteli kromozom preparatların hazırlanması için çok önemlidir. Birinci nokta cam slaytlar yakınında sıcak bir plaka üzerinde ıslak kağıt dokuları yerleştirilmesiyle elde edilmiştir. Bağıl nem, bir higrometre ile ölçüldü. Bitkinin hazırlanması için uygun nemkromozomlar Kirov ve arkadaşları tarafından rapor edilen nem benzerdir. 6. Uygun nispi nemde kromozom kalitesi üzerinde olumlu etkisi sitoplazma ve hücre duvarı hidroliz şişme gerçekleşir.
Enzim tedavi süresi türleri bağımlı (Tablo 1). Enzim muamelesi süresi aynı zamanda, temel etanol / asetik asit içinde tespit ve köklerin boyutunun zaman aralığı bağlıdır. Uzun kökleri ona uygun bir sınıfa kökleri sindirimi uzun sürer, (4 ° C 'de 1 yıla kadar) sabitleyici depolanmıştır. Yetersiz sindirilmiş kök maddesi macerate zor ve uzun süreli maserasyon bir sonucu olarak, terkibin toplam süre artacaktır. Ayrıca, metafaz kromozomları BALIK deney sırasında prob penetrasyon izleyen engel olabilir sitoplazma içine gömülü kalır. Öte yandan aşırı sindirilmiş malzeme kromozoma yapısını ve zarar hedefe DN etkileyebilirFISH analizi için uygun değildir.
Hazırlanması iyileştirilmesi için ilâve bir faktörün fiksatif ikinci bir damla (1: asetik asit / etanol 3) kullanılmasıdır. Bu karışıma, asetik asit yüksek konsantrasyon sitoplazmanın sindirim uyarır ve büyük kromozomlu türlerin yayılması kromozom teşvik etmektedir. Sitoplazma azaltılması da slaytlar üzerinde kromozomların immobilizasyon sonra yer alabilir. Bu amaç için, kromozom yayılır taşıyan mikroskop dilimleri 2-10 dakika sitoplazma düzeyine bağlı olarak, oda sıcaklığında% 45 asetik asit içinde inkübe edilebilir. Kromozom sürülen Kalite kontrolü herhangi bir ek boyama (örneğin,% 1 aseto-carmin) olmayan bir faz-kontrast mikroskobuyla gerçekleştirildi. Normal olarak yüksek kaliteli kromozom yayılır ihtiva eden fazla 25 slaytlar yukarıdaki yöntemi kullanarak 20 köklerinden elde edilebilir.
5S rDNA, [CTT] 10 kullanılarak mitotik metafaz kromozomlarda FISH deneylerin sonuçları ve 6 kb uzun tek kopya prob (FPct_40752) farklı ve (Şekil 2) Yukarıda açıklanan tüm türler için yüksek bir kalite vardı. Bu yaklaşımın bariz faydaları başarılı FISH analizi için mükemmel bir önkoşul olarak hizmet veren iyi yayılmış, hasarsız ve çok sayıda metafaz kromozomları vardır. İki ay kadar -20 ° C'de bir hücre süspansiyonu depolamak ve kromozom FISH deney gününde yayılır hazırlanması mümkündür. Bu tür kromozom üzerinde hibritleme sinyalleri kalitesi, taze hazırlanmış metafaz yayılır kıyasla büyük ölçüde azaltıldığı gözlemlenmiştir ama Taze hazırlanmış slaytlar da,% 96 etanol içinde -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
Hızlı hava kuru bırakarak tekniği ile hazırlanan Kromozom yayılır FISH için uygun olduğunu ve bir kaç kez yeniden üretildi. FISH, bu kromozom hazırlama yöntemi kombinasyonu yaygın karyotipleme 11, CHROMOS için, örneğin, bitkilerde genom organizasyonu keşfetmek için tatbik edilebilirSentetik çalışmalarda ve fiziksel ve genetik harita 13 entegrasyonu için omal eşleme 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M.
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
