Abstract
染色体スプレッドの調製は、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の成功した性能のための前提条件です。高品質の植物染色体スプレッドの調製により堅い細胞壁に困難です。植物染色体の調製のための承認された方法の一つは、いわゆるドロップ製剤、またドロップ拡散または空気乾燥技術として知られています。ここでは、有糸分裂染色体の高速製造のためのプロトコルは、シングルおよび高コピーDNAプローブのFISH検出に適し広がる提示します。この方法では、50％-55％の相対湿度下で行わ空気乾燥ドロップ方式の改良された変異体です。このプロトコルは、そのアプリケーションは、簡単に、効率的かつ再現可能な行う洗浄工程の数の減少を含みます。このアプローチの明白な利点は、成功したFISH分析に最適な前提条件となる損傷を受けていないと、多数の中期染色体よく普及しています。このプロトコルを用いて、我々は、高品質のCHROMを取得しましたオオムギ、Hのbulbosum、Hのmarinumの、Hのmurinum、Hのpubiflorumとライムギのためosomeスプレッドと再現性のFISH結果。
Introduction
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体レベルでのシングル、高コピー配列の物理的マッピングのための効果的なツールです。前提条件は、高品質の染色体スプレッドの調製です。動物および植物細胞にも同様に適しているであろう全く一般的な染色体調製プロトコルはありません。植物染色体の調製により堅い細胞壁と異なる種内の様々な細胞質の一貫性に特に困難です。植物染色体の調製のための有利な方法の一つは、また、ドロップ拡散技術、空気乾燥技術1,2として知られる、いわゆるドロップ技術です。この方法は、まずin vitroで増殖させた哺乳動物細胞の3のためロートフェルスとSiminovitchによって1958年に導入されました。その後、マーティンら 4と 加藤ら 5は、植物のため、この方法を適応しました。
最近では、メソッドの名前」SteamDrop＆＃39;非重複染色体6の製造のための水の蒸気を使用する開発されました。 、高湿度の正の影響が早く7観察されたが、「SteamDropは「高品質の染色体標本6の制御されたワークフローを提供します。蒸気処理は、おそらく染色体タンパク質のいくつかの修正に接続染色体の伸びが発生します。完全な中期の十分な数の保持、その後のFISH実験に広がるものの、中期スプレッドを結果の品質が非常に高く、技術的な専門知識を必要とします。
ここでは、単一および高コピープローブ5,8のFISH検出に適し分裂穀物染色体の調製のためのプロトコルを提示します。この方法は、加藤50％-55％の相対湿度下で行わ9（ 図1）によって記載され空気乾燥滴下法の改良された変異体です。このプロトコルは、削減された数を含み、そのアプリケーションは、簡単に、効率的かつ再現可能な行う洗浄工程の。このプロトコルを用いて、我々は、 オオムギ、Hのbulbosum、Hのmarinumの、Hのmurinum、Hのpubiflorumとライムギのための高品質の染色体スプレッドおよびFISHの結果を得ました。
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Protocol
1.染色体の準備
- 種子の発芽や根の先端の固定
- 22〜24℃で2日間暗条件下でのペトリ皿中の湿ったろ紙の二つの層の10〜20大麦種子を発芽。カミソリの刃を使用することにより、種子中1〜センチ長さと活発な根を切り取ります。
- 砕いた氷 - 水に冷たい水道水を入れた500mlのガラス製ボトルを置くことにより、氷のように冷たい水を準備します。氷のように冷たい水を曝気し、中期細胞の頻度を増加させるために20時間のルートヒントを浸します。
- 酢酸（3：1）を室温で2日間それらを修正するための固定液50mlのエタノールに水から根を転送します。酢酸（3：1）年まで使用まで4℃で固定液新たに調製されたエタノールに根を保管してください。
- 洗浄および酵素処理
- 50mlのガラスビーカーを使用して二回5分間、30ミリリットルの氷冷水道水で10〜20根を洗ってください。双眼顕微鏡を使用してください。 1によって根の1を転送鉗子を用いて、30 mlの0.01 Mクエン酸緩衝液（0.01 Mクエン酸+ 0.01 Mクエン酸ナトリウム、pHは4.8）と二回5分間、ガラス製ビーカーを振盪することにより洗浄します。完全に液体を除去し、カットオフ望ましくない非分裂組織をカミソリの刃を使用して濾紙上に根を置きます。
- 時計皿で植物組織を柔らかくするために約50分（ 表1）37℃で1 mlの酵素混合物中の20根の先端までインキュベートします。酵素混合物は、0.01 Mクエン酸緩衝液で希釈した0.7％のセルラーゼR10、0.7％セルラーゼ、1％のペクトリアーゼと1％のcytohelicaseが含まれています。 -20℃の酵素混合物を保管し、5回まで再利用されます。
- ピペッティングにより酵素を除去し、残存酵素を置き換えるために二回5ミリリットルの0.01Mクエン酸緩衝液で氷の上のルートヒントを洗います。
- ルートマセラシオン
- 1ミリリットル同じ時計皿で二回慎重に96％エタノールで洗浄根端。新たに調製した固定液（25％エタノール、75％酢酸）でエタノールを交換してください。 10〜15を使用してください根端あたりμlの固定液。
- 解剖針やピンセットで2 mlチューブに固定剤と一緒に転送ルートヒントや崩壊ルート分裂組織。細胞懸濁液を得るために、細胞を再懸濁するためにチューブを20回タップします。 2ヶ月のCまで-20℃で細胞懸濁液を保管してください。
- 細胞懸濁液の滴下
- 50℃のホットプレート上で水に浸したティッシュペーパーの2-3層を配置します。 30分間冷蔵庫で氷のように冷たい水道水に顕微鏡スライドを浸し。そして、湿ったティッシュペーパーの上にスライドを配置。
- 細胞懸濁液のピペット7-10μL、ホットプレート上に載せ冷却スライド上に20cmの距離からそれをドロップします。ピペットスライド上の細胞懸濁液と同じ場所に酢酸 - エタノール混合物の10μlの、さらに2分間ホットプレート上でスライドを維持します。ウェットティッシュなしでホットプレート上でスライドを置き、1分間乾燥してみましょう。
- 品質管理とstoragスライドの電子
- 染色体スプレッドの品質を制御するために位相差顕微鏡を用いてスライドをチェックします。 -20℃のコプリンジャーに96％エタノールに浸漬することにより、同じ日またはストアのいずれかのスライドを使用してください。
- FISH前スライドの前処理;全ての工程は室温で実施されます
- 5分間の2×SSCの50ミリリットルを含むコプリンジャーに入れスライド（20×SSCは、3M NaClおよび300 mMのクエン酸三ナトリウムが含まれています）。ピンセットを使用して、転送は、3-10分間、45％酢酸50 mlを含むコプリンジャーにスライドします。
- 転送は、10分間の2×SSCの50 mlを含むコプリンジャーにスライドします。転送が（2×SSC中）4％ホルムアルデヒドの50ミリリットルを含むコプリンジャーにスライドし染色体を修正するために10分間スライドを浸します。
- 50ミリリットルの2×SSCを含むコプリンジャーに、4分間ずつスライドを3回すすぐことにより、ホルムアルデヒドを除去します。それぞれ、70％、90％及び100％エタノールシリーズ中で2分間、コプリンジャーにスライドを脱水し、垂直で乾燥したスライド位置。
in situハイブリダイゼーション2.蛍光（FISH）
- 各スライドには、脱イオン化ホルムアミド10μlの、4倍のハイブリダイゼーションバッファーを5μl（200μlのバッファーは80μlの20倍のSSCが含まれ、8μlの1 Mトリス塩酸pH8.0の、1.6μlの0.5 Mを使用して、合計で20μLのハイブリダイゼーション溶液を調製EDTA、11.2μLを10μg/μlのサケ精子と99.2μlのDNaseを含まない水）、プローブの3μLおよびDNアーゼを含まない水を2μl。
- スライドごとに、ハイブリダイゼーション溶液20μlを加え、24×32ミリメートルのカバースリップで覆い、ゴムセメントでカバースリップを逮捕。ホットプレート上で2分間80℃で同時にプローブを用いてスライドを変性させます。
- 転送は、湿ったチャンバーにスライドして光を避け、37°のCO / Nでスライドをインキュベートします。 2×SSCでコプリンジャーにスライドを洗浄することによってカバースリップを外します。 55〜60℃、2×SSCを含むコプリンジャーにスライドを置き、20分間インキュベート。
- 室温で2分間、コプリンジャーにSSCを2倍のスライドを置きます。それぞれ、70％、90％及び100％エタノールシリーズ中で2分間、コプリンジャーにスライドを脱水します。
- 、抗フェードマウンティング培地中1μg/ mlの4 '、6-ジアミジノ-2- phenylindoline（DAPI）とスライドと対比を空気乾燥に強い光を避けます。
3.顕微鏡分析およびストレージ
- 落射蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析します。フィルタの選択は、プローブ標識のために使用される蛍光色素に依存します。必要に応じて、年までの暗条件下で4℃で保存するスライド。
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Representative Results
分裂中期スプレッドと顕微鏡スライドは、上記高速の空気乾燥滴下染色体の調製方法により調製した（ 補遺図1）。 FISH分析は、両方の反復及び単一コピー配列を用いて行きました。画像は、対応するフルオロフォアの励起を可能にするフィルタのセットを用いて落射蛍光顕微鏡によって得られた、高感度CCDモノクロカメラで撮影しました。画像取得のために、我々は、画像取得ソフトウェアを備えたコンピュータを使用します。 5S rDNAの、[CTT] 10、および単一コピーのプローブを用いた分裂中期染色体のFISH実験の結果は異なっていたとオオムギのための高品質の（Figre 2A、B）、H。bulbosum（ 図2C）、H。 marinumの、Hのmurinum、Hのpubiflorumとライムギのcereale（ 図2D）。このアプローチの明白な利点は、破損していないと出会った数々のは、よく普及しています成功したFISH分析に最適な前提条件としてaphase染色体。これは、2ヶ月まで-20℃で、細胞懸濁液を格納し、染色体FISH実験の日に広がる製造することが可能です。我々はそのような染色体上のハイブリダイゼーションシグナルの質を新たに調製した中期スプレッドと比較して減少することが観察されても、新たに調製したスライドを、また、96％エタノール中で-20℃で保存することができます。方法は、容易に、効率的かつ再現可能な方法で穀物で高品質の染色体スプレッドを調製するために使用することができ、ほとんどの場合、あまりにも他の植物種において使用することができます。
図1 空気乾燥滴下植物染色体の製造方法の手順を説明するスキーム 。
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オオムギ 、Hの分裂中期染色体スプレッド上の図2. FISH空気乾燥滴下法により調製しbulbosumとライムギ 。（A） 赤色蛍光色素で標識された単一コピーのプローブ（FPct_40752）とのH.ブルガレ 。 （B） 緑色蛍光色素により標識5S rDNAをプローブとのH.ブルガレ 。 （C） 緑色蛍光色素および（D）によって標識CTT-マイクロサテライトとのH. bulbosum 緑色蛍光色素によって標識pSc119.2リピートでのS. cereale。すべての染色体は（赤）、DAPIで対比染色しました。 FISHシグナルは、黄色で示されています。スケールバー=10μmである。 このfiguの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください再。
異なる種のための酵素処理の 表1 インキュベーション時間。
補遺。図1. 位相コントラストおよび微分干渉コントラスト（DIC） オオムギ の例に空気乾燥滴下植物染色体の調製法の分裂中期染色体スプレッドの画像 。（A） 位相差画像 200Xの倍率で撮影しました そして、（B）630Xの倍率で撮影した微分干渉コントラスト画像。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
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Discussion
染色体の調製実験は、イネ科（イネ科）に属している穀物の若い根を使用して行われています。すべての分析種は、二倍体ゲノムセットで14比較的長い分裂中期染色体（11-15μm）を持っており、大規模なゲノム種（5.1から7.9ポンド）に帰属します。
発芽根の長さは、分裂組織の最大値を得るために、2cm以上ではなかったです。分裂細胞の同期化は、分裂中期の量が10を広げる改善20時間長い氷水処理によって達成されました。
（I）50％-55％の相対湿度及び（II）酵素処理の持続時間：2つのステップは、高品質の染色体の調製物の製造のために重要です。最初の点は、ガラススライドの近傍にホットプレート上の湿紙組織を配置することによって達成されました。相対湿度は、湿度計を用いて測定しました。植物を調製するための最適な湿度染色体はキーロフらによって報告された湿度と同様であった。6。最適な相対湿度での染色体の質にプラスの効果は、細胞質および細胞壁加水分解の膨潤により起こります。
酵素処理の持続時間は種に依存する（ 表1）です。酵素処理の期間は、ルートのエタノール/酢酸で固定し、根の大きさの時間帯に依存します。長い根は、それが適切なグレードに根を消化するのにかかる長い、（4℃で1年まで）固定液中に保存しました。不十分な消化ルート材料が柔らかくすることは困難であり、長期的なマセラシオンの結果として、調製物の総時間が長くなります。また、中期染色体をFISH実験中に次のプローブの浸透を妨げる可能性が細胞質中に埋め込まれたまま。一方、過消化材料は、染色体そのものの構造、および損害ターゲットDNに影響を与えることができますFISH分析のためのA。
製剤の改善のための付加的な要因は、固定液の第二のドロップ（1：1、酢酸/エタノール3）の使用です。この混合物中に高濃度の酢酸は、細胞質の消化を刺激し、大規模な染色体を有する種に広がった染色体を推進しています。細胞質の減少は、スライド上の染色体の固定化後に行うことができます。この目的のために、染色体スプレッドを運ぶ顕微鏡スライドは2-10分、細胞質のレベルに応じて、室温にて45％酢酸中でインキュベートすることができます。染色体スプレッドの品質チェックは、任意の補助的な染色（ 例えば、1％アセトカルミン）なしに位相差顕微鏡を用いて行きました。通常、高品質の染色体スプレッドを含む25以上のスライドは、上記の方法を用いて、20の根から得ることができます。
5S rDNAの、[CTT] 10を使用して、分裂中期染色体のFISH実験の結果、および6 KBロング単一コピープローブ（FPct_40752）はっきりとした （図2）、上記のすべての種のための高品質でした。このアプローチの明白な利点は、成功したFISH分析に最適な前提条件となる損傷を受けていないと、多数の中期染色体よく普及しています。これは、2ヶ月まで-20℃で、細胞懸濁液を格納し、染色体FISH実験の日に広がる製造することが可能です。我々はそのような染色体上のハイブリダイゼーションシグナルの質を新たに調製した中期スプレッドと比較して減少することが観察されても、新たに調製したスライドを、また、96％エタノール中で-20℃で保存することができます。
高速空気乾燥滴下技術により調製した染色体スプレッドは、魚に適していたと回数を再現しました。 FISHこの染色体の調製方法の組み合わせは、広く11染色体分析のために、例えば、植物のゲノム組織を探索するために適用することができ、chromos合成研究において、物理的および遺伝子地図13の統合のためのOMAL マッピング 12、。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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