Abstract
إعداد ينتشر الكروموسومات هي شرط أساسي لنجاح أداء مضان في الموقع التهجين (FISH). إعداد جودة عالية ينتشر كروموسوم مصنع يمثل تحديا بسبب جدار الخلية جامدة. إحدى الطرق المعتمدة لإعداد الصبغيات النباتية هو ما يسمى إعداد قطرة، المعروف أيضا باسم نشر قطرة أو تقنية تجفيف الهواء. هنا، نقدم بروتوكول لإعداد سريع من كروموسوم الإنقسامية ينتشر مناسبة للكشف FISH تحقيقات DNA نسخة واحدة والعالية. هذا الأسلوب هو البديل الأفضل للطريقة قطرة الهواء الجاف المنفذة بموجب عقد الرطوبة النسبية من 50٪ -55٪. ويتألف هذا البروتوكول انخفاض عدد غسل خطوات صنع تطبيقه سهلة وفعالة وقابلة للتكرار. فوائد واضحة لهذا النهج بشكل جيد الانتشار، الكروموسومات الطورية التالفة والعديد من العاملين كشرط مسبق مثالية لتحليل FISH ناجحة. باستخدام هذا البروتوكول حصلنا عالية الجودة الكرومosome ينتشر والنتائج FISH استنساخه لفولغاري شعير، H. bulbosum، H. marinum، H. murinum، H. pubiflorum والشيلم cereale.
Introduction
مضان التهجين في الموقع (FISH) في هو أداة فعالة لرسم خرائط المادي للتسلسل نسخة واحدة وعالية على مستوى الكروموسومات. شرط أساسي هو إعداد ينتشر كروموسوم جودة عالية. ليس هناك كروموسوم العام إعداد بروتوكول التي من شأنها أن تكون مناسبة أيضا للخلايا الحيوانية والنباتية. إعداد الكروموسومات المصنع هو تحديا من نوع خاص بسبب جدار الخلية جامدة ومختلف الاتساق السيتوبلازم داخل الأنواع المختلفة. إحدى الطرق الملائمة لإعداد الصبغيات النباتية هو ما يسمى تقنية انخفاض المعروف أيضا باسم تقنية الانتشار قطرة وتجفيف الهواء تقنية 1،2. وقدم هذه الطريقة لأول مرة في عام 1958 من قبل Rothfels وSiminovitch لفي المختبر خلايا الثدييات نمت 3. في وقت لاحق مارتن وآخرون. (4) وكاتو وآخرون. 5 تكييف هذه الطريقة للنباتات.
وفي الآونة الأخيرة، وهي طريقة تسمى "SteamDrop &# 39؛ وقد وضعت والتي تستخدم البخار المياه لإعداد الكروموسومات غير متداخلة 6. على الرغم من أن لوحظ تأثير إيجابي من ارتفاع نسبة الرطوبة في وقت سابق من 7، 'SteamDrop' يسلم سير العمل الخاضعة للرقابة ذات جودة عالية التحضيرات كروموسوم 6. يؤدي العلاج بالبخار تمتد من الكروموسومات ربما تتصل بعض التعديلات من البروتينات الكروموسومات. نوعية الناتج ينتشر الطورية عالية جدا، على الرغم من الاحتفاظ بعدد كاف من الطورية ينتشر كاملة للتجارب FISH اللاحقة يطالب الخبرة التقنية.
هنا نقدم بروتوكول لإعداد الكروموسومات الإنقسامية الحبوب مناسبة للكشف FISH من واحد ونسخة عالية تحقيقات 5،8. هذا الأسلوب هو البديل الأفضل للطريقة إسقاط الهواء الجاف وصفه كاتو 9 تتم تحت الرطوبة النسبية من 50٪ -55٪ (الشكل 1). ويتألف هذا البروتوكول عددا أقلغسل خطوات صنع تطبيقه سهلة وفعالة وقابلة للتكرار. باستخدام هذا البروتوكول حصلنا على هوامش كروموسوم ذات جودة عالية ونتائج FISH لفولغاري شعير، H. bulbosum، H. marinum، H. murinum، H. pubiflorum والشيلم cereale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد كروموسوم
- إنبات البذور والتثبيت من النصائح الجذر
- تنبت 10-20 بذور الشعير على طبقتين من ورق الترشيح رطبة في طبق بيتري في ظل ظروف مظلمة لمدة 2 أيام في 22-24 درجة مئوية. قطع جذور قوية مع طول 1-2 سم من البذور باستخدام شفرة حلاقة.
- تحضير الماء المثلج عن طريق وضع زجاجة 500 مل يحتوي على ماء الصنبور البارد في سحقت الماء المثلج. تهوية الماء المثلج وتغمر نصائح الجذرية لمدة 20 ساعة لزيادة وتيرة الخلايا الطورية.
- نقل جذور من المياه إلى 50 مل من الايثانول: حامض الخليك (3: 1) تثبيتي لإصلاح لهم في RT لمدة 2 أيام. متجر جذور في الإيثانول الطازجة: حمض الخليك (3: 1) تثبيتي في 4 درجات مئوية حتى استخدام ما يصل إلى سنة.
- غسل وانزيم العلاج
- غسل 10-20 الجذور مع 30 مل من الجليد الباردة ماء الصنبور لمدة 5 دقائق مرتين باستخدام كوب 50 مل دورق. استخدام المجهر مجهر. نقل جذور واحدا تلو الآخر إلى30 مل 0،01 M عازلة سيترات (0.01 حمض الستريك M + M 0.01 سيترات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.8) باستخدام ملقط، ويغسل عن طريق هز كوب زجاجي لمدة 5 دقائق مرتين. وضع الجذور على الورق مرشح لإزالة السائل تماما وقطع الأنسجة غير بارضي غير مرغوب فيها باستخدام شفرة حلاقة.
- احتضان ما يصل الى 20 نصائح الجذرية في 1 مل خليط الانزيم عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة لتليين الأنسجة النباتية (الجدول 1) في الزجاج ووتش. يحتوي على خليط انزيم 0.7٪ R10 السيلولوز، 0.7٪ السيلولوز، 1٪ pectolyase و 1٪ cytohelicase مخففة في 0.01 M عازلة سيترات. تخزين خليط الانزيم في -20 ° C وإعادة استخدامها ما يصل الى خمس مرات.
- إزالة الانزيم من قبل pipetting وغسل نصائح الجذر على الجليد مع 5 مل 0.01 M عازلة سيترات مرتين ليحل محل الانزيم المتبقية.
- النقع الجذر
- نصائح الجذر غسل مع 1 مل 96٪ من الإيثانول مرتين بعناية في نفس الزجاج ووتش. استبدال الإيثانول مع الطازجة تثبيتي (75٪ حامض الخليك: 25٪ من الإيثانول). استخدام 10-15تثبيتي ميكرولتر في قمة الجذر.
- نصائح نقل الجذر جنبا إلى جنب مع تثبيتي في أنبوب 2 مل وتتفكك الخلايا الإنشائية الجذر مع إبرة تشريح أو ملقط. الاستفادة من أنبوب 20 مرات لإعادة تعليق الخلايا للحصول على تعليق خلية. تخزين تعليق خلية في -20 ° C تصل إلى شهرين.
- إسقاط تعليق الخلية
- ضع 2-3 طبقات من المناديل الورقية غارقة في المياه على طبق ساخن عند 50 درجة مئوية. تزج الشرائح المجهرية في مياه الحنفية المثلج في الثلاجة لمدة 30 دقيقة. والشرائح مكان على أعلى من المناديل الورقية الرطبة.
- ماصة 7-10 ميكرولتر من تعليق خلية وأسقطه من مسافة 20 سم على الشريحة تبريد توضع على طبق ساخن. ماصة 10 ميكرولتر من الخل حامض خليط الإيثانول في نفس المكان تعليق الخلية على الشريحة والحفاظ على الشريحة على طبق ساخن لمدة 2 دقيقة إضافية. وضع الشريحة على طبق ساخن بدون النسيج الرطب واتركها تجف لمدة 1 دقيقة.
- مراقبة الجودة وstorag(ه) من الشرائح
- تحقق الشرائح باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من لمراقبة جودة انتشار كروموسوم. استخدام الشرائح إما في نفس اليوم أو مخزن عن طريق غمر في 96٪ من الإيثانول في وعاء Coplin في -20 ° C.
- المعالجة من قبل الشرائح FISH. تتم جميع الخطوات من في RT
- مكان الشرائح في جرة Coplin تحتوي على 50 مل من 2X SSC (20x وSSC يحتوي على 3 M كلوريد الصوديوم و 300 ملي سترات الصوديوم) لمدة 5 دقائق. باستخدام ملقط، والشرائح نقل إلى جرة Coplin تحتوي على 50 مل من حمض الخليك 45٪ ل3-10 دقيقة.
- نقل الشرائح إلى جرة Coplin تحتوي على 50 مل من 2X SSC لمدة 10 دقيقة. الشرائح نقل إلى جرة Coplin تحتوي على 50 مل من 4٪ الفورمالديهايد (في 2X SSC) وتزج الشرائح لمدة 10 دقيقة لإصلاح الصبغيات.
- إزالة الفورمالديهايد قبل الشطف الشرائح 3 مرات لمدة 4 دقائق لكل منهما، في جرة Coplin تحتوي على 50 مل 2X SSC. يذوى الشرائح في جرة Coplin لمدة 2 دقيقة في سلسلة من 70٪، 90٪ و 100٪ من الإيثانول، على التوالي والشرائح الجافة في رأسيموضع.
2. نيون في الموقع التهجين (FISH)
- لكل شريحة، يعد حل التهجين 20 ميكرولتر في المجموع باستخدام 10 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات، 5 ميكرولتر من العازلة 4X التهجين (200 العازلة ميكرولتر يحتوي على 80 ميكرولتر 20X SSC، 8 ميكرولتر 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 1.6 ميكرولتر 0.5 M EDTA، 11.2 ميكرولتر 10 ميكروغرام / ميكرولتر الحيوانات المنوية السلمون و99،2 ميكرولتر خالية من الدناز الماء)، و 3 ميكرولتر من التحقيق و2 ميكرولتر من المياه خالية من الدناز.
- إضافة 20 ميكرولتر من محلول التهجين لكل شريحة والغطاء مع 24 × 32 مم زلة تغطية وإلقاء القبض على زلة غطاء مع الاسمنت والمطاط. تفسد الشرائح مع تحقيقات في وقت واحد في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على طبق ساخن.
- نقل الشرائح إلى غرفة رطبة واحتضان الشرائح في 37 ° CO / N ضوء تجنب. إزالة زلات غطاء من قبل الشطف الشرائح في جرة Coplin مع 2X SSC. مكان الشرائح في جرة Coplin تحتوي على 55-60 ° C 2X SSC واحتضان لمدة 20 دقيقة.
- ضع الشرائح إلى 2x SSC في جرة Coplin لمدة 2 دقيقة في RT. يذوى الشرائح في جرة Coplin لمدة 2 دقيقة في سلسلة من 70٪، 90٪ و 100٪ من الإيثانول، على التوالي.
- الهواء الجاف الشرائح ومباين مع 1 ميكروغرام / مل 4، 6-diamidino-2-phenylindoline (دابي) في antifade المتوسطة المتزايدة، وتجنب الضوء المكثف.
3. تحليل مجهري والتخزين
- تحليل الشرائح باستخدام المجهر epifluorescence. اختيار مرشح يعتمد على تألقي تستخدم لوضع العلامات التحقيق. إذا لزم الأمر، والشرائح تخزينها في 4 درجات مئوية تحت الظروف المظلمة تصل الى عام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إعداد الشرائح المجهرية مع هوامش الطورية الإنقسامية قبل إسقاط الصبغي سريع طريقة التحضير الهواء الجاف هو موضح أعلاه (ملحق الشكل 1). وأجري تحليل FISH من استخدام كليهما، تسلسل المتكررة ونسخة واحدة. وقد تم الحصول على الصور عن طريق المجهر epifluorescence مع مجموعة من المرشحات تمكين إثارة fluorophores المقابلة واستولت عليها وذات حساسية عالية كاميرا CCD أحادية اللون. لاقتناء صورة استخدمنا جهاز كمبيوتر مع برنامج الحصول على الصور. وكانت نتائج التجارب FISH على الكروموسومات الإنقسامية الطورية باستخدام 5S rDNA، [CTT] (10)، وتحقيقات نسخة واحدة متميزة وذات جودة عالية للشعير فولغاري (Figre 2A، B)، H. bulbosum (الشكل 2C)، H. marinum، H. murinum، H. pubiflorum والشيلم cereale (الشكل 2D). فوائد واضحة لهذا النهج بشكل جيد الانتشار وغير تالفة والتقى عددا الكروموسومات aphase بمثابة شرط مسبق مثالية لتحليل FISH ناجحة. فمن الممكن لتخزين تعليق خلية في -20 ° C تصل إلى شهرين وإعداد كروموسوم ينتشر في يوم التجربة FISH. طازجة إعداد الشرائح ويمكن أيضا تخزين في -20 ° C في 96٪ من الإيثانول، على الرغم من أننا لاحظنا أن نوعية إشارات التهجين على هذه الصبغيات يتم تقليل مقارنة ينتشر الطورية الطازجة. أساليب يمكن استخدامها لإعداد ينتشر كروموسوم عالية الجودة في الحبوب بطريقة سهلة وفعالة وقابلة للتكرار، وعلى الأرجح يمكن استخدامها في الأنواع النباتية الأخرى أيضا.
الشكل 1. مخطط اصفا الداخلي للمصنع إسقاط طريقة التحضير كروموسوم الهواء الجاف.
وفاق / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
الشكل 2. FISH على هوامش الإنقسامية الطورية كروموسوم من فولغاري شعير، H. bulbosum والشيلم cereale من طريقة إسقاط الهواء الجاف إعدادها. (A) H. فولغاري بنسخة التحقيق واحد (FPct_40752) المسمى مع صبغة الفلورسنت الأحمر. (B) H. فولغاري مع 5S rDNA التحقيق المسمى من قبل صبغة الفلورسنت الأخضر. (C) H. bulbosum مع CTT-الصغرية وصفت من قبل صبغة الفلورسنت الأخضر و (D) S. cereale مع pSc119.2 تكرار صفت من قبل صبغة الفلورسنت الأخضر. تم counterstained جميع الكروموسومات مع دابي (باللون الأحمر). وتظهر إشارات FISH باللون الأصفر. مقياس شريط = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.
الجدول 1. وقت الحضانة من العلاج انزيم لأنواع مختلفة.
ملحق. الشكل 1. المرحلة التباين وتدخل الفرق النقيض (DIC) صور الإنقسامية الطورية ينتشر كروموسوم من محطة إسقاط طريقة التحضير كروموسوم الهواء الجاف على سبيل المثال من شعير فولغاري. (A) صورة على النقيض من المرحلة التي اتخذت في التكبير 200X و (B) التفاضلية تدخل النقيض من الصورة التي اتخذت في التكبير 630X. يرجى النقرهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تنفيذ التجربة إعداد كروموسوم من استخدام جذور الشباب من الحبوب تعود لعائلة الأعشاب (النجيلية). جميع الأنواع تحليل لها 14 الإنقسامية طويلة نسبيا الكروموسومات الطورية (11-15 ميكرون) في مجموعة الجينوم مضاعفا وتنتمي إلى الأنواع واسع الجينوم (5،1-7،9 GBP).
كان طول الجذور نبتت لا يزيد عن 2 سم للحصول على الحد الأقصى من الأنسجة بارضي. وقد تحقق تزامن تقسيم الخلايا قبل 20 ساعة المعاملة الماء المثلج طويلة أن تحسين كمية الإنقسامية الطورية ينتشر 10.
خطوتين مهمة لإعداد التحضيرات كروموسوم عالية الجودة: (I) الرطوبة النسبية من 50٪ -55٪ و(II) مدة العلاج الانزيم. وقد حقق النقطة الأولى عن طريق وضع مناديل ورقية مبللة على طبق ساخن على مقربة من الشرائح الزجاجية. وقد تم قياس الرطوبة النسبية مع الرطوبة. الرطوبة المثلى لإعداد المصنعكان الكروموسومات مماثل إلى الرطوبة التي أبلغ عنها كيروف وآخرون. 6. تأثير إيجابي على جودة كروموسوم في الرطوبة النسبية المثلى يحدث تورم من السيتوبلازم وجدار الخلية المائي.
مدة العلاج الانزيم الأنواع التي تعتمد (الجدول 1). فترة العلاج انزيم يعتمد أيضا على الفترة الزمنية من تثبيت جذورها في الإيثانول / حامض الخليك وحجم الجذور. تم تخزين جذور أطول في تثبيتي (تصل إلى 1 سنة في 4 ° C)، ويعد ما يلزم لهضم الجذور إلى الرتبة المناسبة. المواد الجذر هضمها بشكل كاف صعبة للنقع وسوف تزيد من الوقت الكلي للإعداد نتيجة النقع طويلة الأمد. وعلاوة على ذلك، لا تزال الكروموسومات الطورية جزءا لا يتجزأ في السيتوبلازم التي يمكن أن تعرقل أعقب ذلك انتشار التحقيق خلال التجربة FISH. من ناحية أخرى الإفراط في هضم المواد يمكن أن تؤثر في هيكل الكروموسومات أنفسهم، والضرر الهدف DNA لتحليل FISH.
عاملا إضافيا لتحسين إعداد واستخدام قطرة الثاني من تثبيتي (3: 1، وحامض الخليك / الايثانول). تركيز عال من حمض الخليك في هذا الخليط يحفز عملية الهضم من السيتوبلازم ويعزز كروموسوم نشر في الأنواع ذات الكروموسومات كبيرة. يمكن الحد من السيتوبلازم أيضا أن يحدث بعد تجميد الكروموسومات على الشرائح. يمكن لهذا الغرض يتم تحضين شرائح المجهر يحمل كروموسوم ينتشر في حامض الخليك 45٪ في RT ل10/02 دقيقة اعتمادا على مستوى السيتوبلازم. تم إجراء فحص الجودة من هوامش كروموسوم مع المجهر المرحلة على النقيض من دون أي تلطيخ التكميلي (على سبيل المثال، 1٪ أسيتو-CARMIN). عادة أكثر من 25 الشرائح التي تحتوي على هوامش كروموسوم ذات جودة عالية يمكن الحصول عليها من 20 جذور باستخدام طريقة أعلاه.
نتائج التجارب FISH على الكروموسومات الإنقسامية الطورية باستخدام 5S rDNA، [CTT] (10)، و 6 ككان ب المدى نسخة واحدة التحقيق (FPct_40752) متميزة وذات جودة عالية لجميع الأنواع المذكورة أعلاه (الشكل 2). فوائد واضحة لهذا النهج بشكل جيد الانتشار، الكروموسومات الطورية التالفة والعديد من العاملين كشرط مسبق مثالية لتحليل FISH ناجحة. فمن الممكن لتخزين تعليق خلية في -20 ° C تصل إلى شهرين وإعداد كروموسوم ينتشر في يوم التجربة FISH. طازجة إعداد الشرائح ويمكن أيضا تخزين في -20 ° C في 96٪ من الإيثانول، على الرغم من أننا لاحظنا أن نوعية إشارات التهجين على هذه الصبغيات يتم تقليل مقارنة ينتشر الطورية الطازجة.
وكانت هوامش كروموسوم من قبل سريع تقنية إسقاط الهواء الجاف إعداد مناسبة لFISH واستنسخت عدة مرات. ويمكن تطبيق الجمع بين هذه طريقة التحضير كروموسوم مع FISH على نطاق واسع لاستكشاف منظمة الجينوم في النباتات، على سبيل المثال، لتنميط نووي 11، chromosرسم الخرائط OMAL 12، في الدراسات الاصطناعية، ودمج الخرائط الفيزيائية والوراثية 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
