Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Published: February 18, 2016 doi: 10.3791/53547
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

Introduction

גלוטמט הוא הנוירוטרנסמיטר העיקרי המעורר ברשתית 1. תאי גנגליון רשתית (RGCs), קבלת הקלט הסינפטי glutamatergic מתאי דו קוטבית 2, הם נוירונים הפלט של הרשתית ששולחות מידע חזותי אל המוח. מחקרים פיזיולוגיים הראו כי עירור הסינפטי של RGCs מתווכת postsynaptically ידי קולטני NMDA (NMDARs) ואת הקולטנים AMPA (AMPARs) 3,4,5. למרות זרמים סינפתטי (EPSCs) ב RGCs מתווכות על ידי AMPARs ו NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs מיניאטורי ספונטנית (mEPSCs) על RGCs להפגין רק מרכיב בתיווך AMPARs 4,5,9. עם זאת, צמצום ספיגת גלוטמט חשף מרכיב NMDAR ב EPSCs ספונטנית 5, דבר המצביע על כך NMDARs על דנדריטים RGC יכול להיות ממוקם מחוץ סינפסות מעוררות. קינאזות guanylate קרום הקשורים (MAGUKs) כגון PSD-95 כי קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכול, כולל קולטני גלוטמט ערוץ יוןים באתרי הסינפטי, גם להפגין דפוסי ביטוי subsynaptic ברורים 10,11,12,13,14.

במהלך העשורים האחרונים, אימונוהיסטוכימיה confocal ו מיקרוסקופ אלקטרונים טרום הטבעה (EM) אימונוהיסטוכימיה הועסק ללמוד ביטוי קולטן קרום. למרות immunostaining confocal חושף דפוסים רחבים של ביטוי הקולטן, הרזולוציה הנמוכה יותר שלה עושה את זה אי אפשר להשתמש בו כדי להבחין במיקום subcellular. מחקרי EM טרום מוטבע הרשתית יונקת עולים כי יחידות משנת NMDAR נוכחי אלמנטי postsynaptic ב סינפסות סרט מדוך דו קוטבי 15,16,17. זאת בניגוד לכאורה ראיות פיזיולוגיות. עם זאת, דיפוזיה של מוצר התגובה הנה חפצה ידועה בשיטת אימונו-טרום ההטבעה. לפיכך, הגישה זו לא כוללת בדרך כלל נתונים אמינים סטטיסטית ועשויים לכלול הבחנה בין לוקליזציה קרום הסינפטי לעומת 18,19,20,21 קרום extrasynaptic. עַלמצד השני, נתונים פיסיולוגיים אנטומיים עולים בקנה אחד עם לוקליזציה הסינפטי של AMPARs על RGCs 3,5,7,9,22. לפיכך, קולטני גלוטמט MAGUKs ב סינפסה סרט רשתית הם נקודות לא רק על-סינפטי אלא גם על תאי קרום perisynaptic או extrasynaptic. עם זאת, ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של חלבונים בממברנה אלו סינפסה סרט רשתית עדיין יש צורך.

הנה, פיתחנו טכניקה immunogold postembedding EM לבחון את לוקליזציה subsynaptic של יחידות משנה NMDAR, תת-יחידות AMPAR ו PSD-95 ואחריו בהערכת מספר, צפיפות והשונות של החלבונים האלה ב סינפסות על RGCs חולדה שכותרתו באמצעות B למקטע רעלן הכולרה (CTB) שיטות איתור מדרדרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

טיפול הטיפול בבעלי חיים היו בהתאם טיפול בבעלי חיים NIH והנחיות ועדת שימוש. ביום הלידה (P) 15-21 חולדות Sprague-Dawley, הזריקו 1-1.2% CTB בילטרלי דרך colliculus מעולה, נשמרו על 12: אור 12-hr: מחזור כהה.

1. קיבוע רקמת הרשתית

  1. להרכיב את חומרים והכלים באים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים עדינים מאוד, מספריים, נייר סינון תאי, פיפטה פלסטיק שקופיות מיקרוסקופ.
  2. להרדים חולדה בתא סגור עם 2.0 מ"ל halothane (הרדמה נשימתית). לקבוע הרדמה נאותה בשיטות הבאות: חוסר נסיגת כפה האחורי לאחר קמצוץ הבוהן, או חוסר רפלקס מצמוץ. ואז לערוף מיד עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת זכוכית המכיל paraformaldehyde 4% חיץ פוספט 0.1 M (PB) ב- pH 7.4.
  3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להסיר את התירסea ידי ניתוק החלק הקדמי של גלגל העין. הסר את העדשה זגוגי מפני שטח הרשתית הפנימית עם מלקחיים.
  4. מקלף את בלובן העין עם שני מלקחיים עד הרשתית מבודדת עיינית.
  5. חותכים את הרשתית מיד לתוך 100 - 200 רצועות מיקרומטר בעובי בתער, ובכפוף קיבעון pH משמרת.
  6. תקן רצועות הרשתית paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PB ב 6.0 pH למשך 20 - 30 דקות ולאחר מכן ב 4% paraformaldehyde בתוספת 0.01% glutaraldehyde ב- pH 10.5 במשך 10 - 20 דקות ב RT.
  7. לאחר שטיפות כמה PB עם 0.15 מ"מ CaCl 2 (pH 7.4 ב 4 ° C), cryoprotect רצועות רשתית עם גליצרול (60 דקות כל אחד ב 10%, 20%, 30%, אז O / N ב 30%) ב 0.1 M PB לפני להקפיא חילוף.

2. החלפת Freeze

הערה: השיטה זו להקפיא החלפה היא שונה מן הפרוטוקול שפורסם קודם לכן 19,20. כמו כן, חשוב כי המכשירים הם מאוד קרים (ללבוש כפפות); otherwise, הרקמה עשויה להפשיר חלקית כאשר נגע עם המכשירים. כל הצעדים האלה נעשים בתוך החדר AFS ו המכשירים הם לא יכולים לנוע מעל השוליים של החדר. באופן דומה, קירור הולם של כל הכימיקלים המשמשים AFS הוא הכרחי.

  1. לצלול-להקפיא את רצועות הרשתית פרופן נוזלי -184 מעלות צלזיוס מכשיר cryopreservation EM (CPC). בעזרת המברשת בסדר, מניח את הדגימות על חתיכות קטנות של קלטת מקל פעמים המצורפות בדלי המתכת שהולכים על הקצה של המוטות הצוללות (פתיל את החיץ נוסף באמצעות המברשת).
  2. לצלול את המוטות אל פרופן נוזלי ולשמור שם בערך 5 שניות, ולאחר מכן להעביר אל המכשיר להקפיא החלפה אוטומטית (AFS) באמצעות תא תחבורה קטן כי הוא מלא עם חנקן נוזלי ( "LN 2 מקורר מיכל העברת cryo ').
  3. לאחר הצבת מדגם ומכשירים קפוא (מלקחיים אזמל) לתוך AFS, לקרר את המכשירים בתא עבור seדקות veral לפני נגיעה רקמות, או לקרר אותם על ידי הנחת טיפים של המכשירים במשך כמה שניות לתוך תא תחבורה קטן (מלאים בחנקן נוזלי ( "LN 2 מקורר מיכל העברת cryo ')).
  4. מדי פעם את AFS, להסיר את מדגם הקלטת מן הבדל באמצעות אזמל בסדר. כמו כן, לשמור על בקרת זרימת גז חנקן, TF (TF מתואר שליטת רגולטור עבור LN 2 vaporiser ') פתוחה במהלך הליכים אלה.
  5. לפני הצבת הרקמה הקפואה לתוך מחזיקי שטוח הטבעה (כלומר, לפני הגדרת AFS), לחתוך עיגול דק מסדין פלסטיק שקוף ומניחים אותו לתוך החלק התחתון של בעל כדי השורה התחתונה של כל טוב. זה מאפשר הסרה יחסית קלה של אבן polymerized הדגימה בסיום.
    הערה: בעבר, השתמשתי בשיטה אלטרנטיבית לבעלי ההטבעה השטוחים, והעסקת קפסולות רייכרט + ג'לטין כפולות (ראה Petralia ו Wenthold, 1999) <sup> 20.
  6. השתמש רצף אוטומטית הבאים AFS (תוך שימוש בטרמינולוגיה מכשיר): T1 = -90 מעלות צלזיוס במשך 32 שעות, S1 = הטמפרטורה לעלייה של 4 מעלות צלזיוס / hr (11.3 שעות), T2 = -45 מעלות צלזיוס במשך 50 שעות, S2 = הטמפרטורה לעלייה של 5 מעלות צלזיוס / hr (9 שעות), T3 = 0 מעלות צלזיוס למשך 40 שעות (סה"כ = 142.3 שעות). זה עלול לקחת 2 - 4 שעות למקום דגימות AFS (ב -90 ° C) לפני תחילת רצף מתוזמן.
  7. לטבול את החלקים הקפואים ב יצטט uranyl 1.5% מתנול ב -90 מעלות צלזיוס במשך> 32 שעות ב AFS. מניח שתי חתיכות של רקמות (בדרך כלל) בכל אחד משבע הבארות בעל אלומיניום שטוח הטבעה (שלוש להשתלב AFS).
    1. הנח את הרקמה + הקלטת לתוך מתנול יצטט uranyl / בבארות והסירו את הסרט מאוחר יותר, בסמוך עד בינוני הטבעת תחילה (כגון Lowicryl HM20) הסתננות, אם זה קשה מדי כדי להסיר את רקמה מהקלטת.
  8. ואז להגדיל את בשלבי הטמפרטורה ל -45 מעלות צלזיוס (+ 4 ° C לכל hr; ברצף האוטומטי).
  9. שטוף את הדגימות שלוש פעמים מתנול precooled, באמצעות פיפטה פלסטיק קנס שקצו להסיר את הפתרון ישן מכל בעל שטוח הטבעה, ולאחר מכן באמצעות אחר פיפטה פלסטיק רגיל להוסיף מתנול הטרי precooled.
  10. לאחר מכן, תוך שימוש באותה השיטה, לחדור הדגימות בהדרגה עם שרפי הטבעה בטמפרטורה נמוכה כגון הטבעה הבינונית (HM20 / מתנול ב 1: 1 ו -2: 1, כל אחד עבור 2 שעות, ואחריו שרף טהור עבור שעה 2 ולאחר מכן לשנות את השרפים ולשמור O / N).
  11. שנה את השרף שוב למחרת, התאמת רמת השרף להגיע רק עד לקצה העליון של הבארות.
  12. לפלמר הדגימות (-45 ° C עד 0 ° C ברצף אוטומטי; + 5 ° C לכל hr) עם האור UV במשך 40 שעות.
  13. ואז להסיר את הדגימות מן AFS. בדרך כלל, בלוקים מדגמים עדיין להראות קצת הוורדרדות בצבע. מניח את הדגימות קרובות אור ניאון במנדף כימי, ב RT O / N או יותר עד שהם אפליקציההאוזן לגמרי ברור.

3. Postembedding EM immunogold Immunocytochemistry

הערה: immunocytochemistry Postembedding מתבצע כמתואר 23,24,25.

  1. חותכי 1 מיקרומטר החלק עם ultramicrotome, סעיפי כתם עם 1% toluidine כחול, ולבחון אותם להתמצאות סעיף; כוון את לחסום הרקמות כדי להשיג את המטוס הרוחבי האופטימלי של חתך.
  2. חותכים 70 סעיפים ultrathin ננומטר עבה עם ultramicrotome ולאסוף אותם על רשתות חריץ ניקל מצופה Formvar-חמצני.
  3. לשטוף ורשתות פעם אחת המזוקק H 2 O ואחריו מלוח טריס שנאגר שלוש פעמים (TBS, 0.05 חיץ M טריס, 0.7% NaCl, pH 7.6) לשטוף.
  4. דגירה רשתות ב 20 טיפות μl של BSA 5% ב TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב 20 טיפות μl של תערובת המכילה עז נגד CTB (1: 3,000) ו נוגדן כדי GluN2A (נגד ארנב למקטע NMDAR אחד 01:50 , GluN2B 1:30), או GluA2 נגד ארנב / 3 (1:30)ב TBS-טריטון (TBST, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) עם BSA 2% ו 0.02 M NaN 3 O / N ב RT.
  5. רשתות לשטוף על שלוש טיפות נפרדות (20 μl) של TBS (pH 7.6) במשך 10, 10, ו -20 דקות, ואחריו TBS (pH 8.2) במשך 5 דקות.
  6. דגירה רשתות עבור שעה 2 על טיפות (20 μl) של תערובת המכילה IgG נגד ארנב חמור (1:20) מצמידים 10 חלקיקי זהב ננומטר IgG נגד עז חמור (1:20) מצמידים את חלקיקי זהב 18 ננומטר ב TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3.
  7. לשטוף רשתות ב 20 טיפות μl של TBS (pH 7.6) במשך 5, 5, ו -10 דקות, ולאחר מכן במים ultrapure ולאחר מכן לייבש אותם.
  8. רשתות Counterstain עם אצטט uranyl 5% ו -0.3% ציטראט הובלת H המזוקק 2 O עבור 8 ו -5 דקות בתנאים כהים, בהתאמה.
  9. בניסויים משולש תיוג, דגירת רשתות O / N ב RT עם 20 טיפות μl של תערובת של אנטי-העז CTB (1: 3,000), אנטי עכבר PSD-95 (1: 100), ו GluN2A נגד ארנב (1 : 50). ואז דגירה רשתות עבור שעה 2 על 20 טיפות μl של תערובת של IgGs מצמידים 18, 10, ו -5 חלקיקי זהב ננומטר TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3. שמור אותו נוהל כמו תיוג כפול לרחצה counterstaining בין ואחרי הדגירה נוגדן.
  10. בקרות בוצעו בו נוגדנים משני יושמו לבד.
  11. רשתות צפה על תמונות EM ו digitalize. לעבד נתונים סופיים ב- Adobe Photoshop 6.0 ​​רק עבור בהירות והניגודיות אם יש צורך 24.

כימות 4.

  1. ידני באזורים הנבחרים של שכבת plexiform הפנימי (IPL) ללא חורים או סדקים בהגדלת 8,000X, ואז באקראי פוטומונטאז את מלוא עומקה של IPL בהגדלת 25,000X.
  2. זהה דנדריטים RGC ב צמדים דו קוטביים חרוטים כשהם א) מכילים את אות CTB מועבר retrogradely (חלקיקים זהב גדולים), ב) ממברנות מוגדרות היטב תערוכה, בתרי, צפיפויות postsynaptic, ג) להכיל לפחות שני חלק זהב קטןicles בתוך PSD, או יותר חלקיק זהב אחד קטן לאורך הממברנה extrasynaptic.
  3. אסוף 45 - 55 דנדריטים RGC, על פי קריטריונים לעיל, על ניתוח כמותי.
  4. מדוד את האורכים של PSD ו קרום פלזמת extrasynaptic של דנדריטים RGC פרט עם תוכנת ImageJ NIH. רוזן חלקיקי זהב בתוך 10 ננומטר של קרום כמו קרום קשור, המבוסס על עובי ממוצע של 7 - 9 ננומטר עבור קרום פלזמת 26.
  5. חישוב צפיפות החלקיקים כמספר חלקיקי זהב לכל מיקרומטר ליניארי (זהב / מיקרומטר). למדוד את המרחק בין מרכז של כל חלקיק זהב באמצע PSD (עבור מיקום הסינפטי) או קצה PSD (עבור מיקום extrasynaptic).
  6. בביצוע ניתוחים סטטיסטיים על ידי התוכנה. השתמש שני זנב t- הבדיקות להשוות אמצעים. להסיק משמעות כאשר P <0.05. אלא אם צוין אחרת, ערכי דוח כמו הממוצע ± SEM 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המוצגות כאן להפגין דפוסי לוקליזציה subsynaptic שונות לחלוטין של GluA 2/3 ו- NMDARs על דנדריטים RGC ברשתית חולדה, כפי שתואר לעיל 24,25. 77% של חלקיקים immunogold GluA 2/3 פרופילים הדנדריטים RGC אותרו בתוך PSD (איור 1 א), בדומה למרבית סינפסות המרכזית. עם זאת, NMDARs אותרו גם synaptically או extrasynaptically. 83% של חלקיקים immunogold GluN2A היו נקודתיים של PSD (איור 1 ג, 2 א, 2 ב), מעדיפים ב סינפסות OFF, לבין חלקיקי זהב היו מרוכזים יותר במרכזו של PSD (איור 2 ג). לעומת זאת, הרוב הגדול של תיוג חלקיקים עבור GluN2B (96%) היו ממוקמים מחוץ PSD (איור 1 ב ', 2 א, 2 ב), מופץ בעיקר לאורך הממברנה extrasynaptic, עם צפיפות חלקיקי שיא ב 180 ננומטר מהקצה של PSD (תרשים 2B). בפרט, GluN2B הציג העדפה סינפסות ON. משנה של ניסויים, תיוג סימולטני של GluN2A, PSD-95 ו- CTB ציינו כי GluN2A ו PSD-95 היו colocalized ב PSD של דנדריטים RGC OFF (איור 1D), שבו NR2A היה בקרום הדנדריטים בעוד PSD-95 היה מתחת הממברנה, דבר המצביע על כך שהם מעוגנים על PSD. הבדל משמעותי בצפיפות זהב בין קרום perisynaptic וממברנות המיטוכונדריה נצפה, דבר המצביע על תיוג ספציפי (2D האיור) לשעבר.

איור 1
באיור 1. תיוג immunogold מציג הסינפטי perisynaptic לוקליזציה של גלוטמט רצפטורים ב RGC דנדריטים שכותרתו ידי CTB. (א): תיוג immunogold כפול של GluA2 / 3 (10 ננומטר זהב) ו CTB (18 זהב ננומטר). סרטי Presynaptic שמציינים ראשי חץ. gol הקטןחלקיקים ד מקובצים (חץ) בתהליכי PSD של RGC. (ב) תיוג immunogold כפול של GluN2B (10 ננומטר זהב) ו CTB (זהב 18 ננומטר); חלקיקי זהב קטנים (חץ) הם מופעלים על הממברנה extrasynaptic. (C) תיוג immunogold כפול של GluN2A (10 ננומטר זהב) ו CTB (18 זהב ננומטר). בדומה GluA2 / 3, חלקיקים קטנים מקובצים בתוך PSD. (ד) תיוג immunogold טריפל של GluN2A (5 ננומטר זהב), PSD-95 (10 ננומטר זהב) ו CTB (18 זהב ננומטר). חלקיקי זהב GluN2A (חיצים קטנים) ו PSD-95 חלקיקי זהב (חיצים גדולים) הם שותף מקומי בתוך PSD על דנדריטים RGC הפרט CTB חיובי. הבלעה: בהגדלה גבוהה יותר של PSD. סרגל קנה מידה: 0.1 מיקרומטר (A = C = D, B). אלה הם micrographs חדש המבוסס על נתונים שפורסמו ב זאנג היהלומים 24,25. נא ללחוץ כאן vieווה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. השוואה כמותית של לוקליזציה NMDAR ב RGC דנדריטים. (א) היסטוגרמה המציגה את התפלגות משיק של immunogold עבור GluN2A (n = 53 פרופילים) ו GluN2B (n = 56 פרופילים) בתוך ומחוץ PSD. אזור perisynaptic חולק 60 פחי ננומטר. (ב) היסטוגרמה מראה צפיפות תיוג של חלקיקים immunogold עבור GluN2A (n = 53 פרופילים) ו GluN2B (n = 56 פרופילים). אזור perisynaptic חולק 180 פחי ננומטר מהקצה של PSD. (ג) היסטוגרמה המציגה את ההתפלגות המשיקה של המספר הכולל של חלקיקי immunogold עבור GluN2A (n = 44 פרופילים) ו GluN2B (n = 3 פרופילים) בכלל השאלונים עם תיוג בתוך PSD. (ד) השוואת צפיפות החלקיקים שלחלקיקים immunogold עבור GluN2B (n = 53 ו -33 פרופילים) ו GluN2A (n = 9 ו -30) בממברנות perisynaptic קרום המיטוכונדריה, בהתאמה, בתהליכי RGC CTB חיובי. היסטוגרמות אלה משתנים מ היסטוגרמות שפורסמו זאנג יהלומים 24,25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תארנו ארבע טכניקות שלאחר הטבעת כמותית מוצלחת immunogold EM: 1) קיבוע קצר וחלש, 2) להקפיא-החלפה, 3) שלאחר הטבעה מכתימה immunogold, ו -4) כימות.

EM immunogold מאפשרת זיהוי של חלבונים ספציפיים בסעיפי רקמות ultrathin. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב ניתן דמיינו ישירות באמצעות EM. בעוד עוצמה באיתור לוקליזציה subsynaptic של קולטן קרום, immunogold EM יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, ודורש אופטימיזציה קפדני של שיטות עיבוד קיבעון רקמות.

לשמור על איזון מיטבי בין שלמות הממברנה antigenicity, בדקנו שיטות קיבוע שונים ובזמנים. לדוגמה, פרוטוקול מוצלח המשמש postembedding EM NMDAR ב סינפסות המרכזי 19,20 לא הצליחו לאתר immunoreactivity NMDAR ברשתית. נעשתה בעבודת קיבעון עדין פעמי דגירה קצרותלמנוע צמצום של antigenicity הקולטן NMDA לאחר קיבוע חזק, ממושך 16.

השיטה להקפיא החלפה פותחה לראשונה עבור לוקליזציה ultrastructural של קולטני גלוטמט בתחילת 1990 27, והיא כרוכה חדירה בטמפרטורה נמוכה פילמור שרף פולרי, הידרופובי, 28 HM20, הדרושים תיוג immunogold postembedding אופטימלי. שיטת ההחלפה להקפיא המסוימת המשמשת כאן פותחה עבור קולטני גלוטמט תיוג בשבלול 29 אופטימיזציה עבור קולטני גלוטמט סינפסות המרכזי 18,19,20,30, וזה כבר שונה יותר בשנים אחרונות. חדירת בטמפרטורה נמוכה פילמור של שרף עוזר לשמר antigenicity של מולקולות-יציב חום וממזער מיצוי השומנים תגובות כימיות רצויות בין שרף ורקמות 19,31. בשילוב עם שיטות הקיבוע שתוארו לעיל, עמ 'שיטת הקפאת החלפה זוrovides antigenicity טוב ושימור מבני סביר.

טכניקת postembedding immunogold משמשת כאן יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטת אימונו preembedding. למרות שהשיטה preembedding אימונו יש רגישות גבוהה יותר 15,16,17,19,20,21, דיפוזיה של המוצר התגובה היא בלתי נמנעת, וכתוצאה מכך תיוג ספציפי 26,32. יתר על כן, התגובה אנזים peroxidase אינו ליניארי 21, מה שהופך אותו קשה להעריך באופן כמותי את לוקליזציה subsynaptic מדויק של קולטני 18,21. שיטת postembedding immunogold מעסיקה סמן הלא diffusible ומבצעת את immunoreaction על פני שטח של רקמות שרף-משובץ, אשר מפחיתים חפצי diffusible ומתיר 18,33,34 ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר. חלקיקי זהב ניתן לספור ישירות, יתר על כן, מה שהופכים אותו ניתן להעריך את המספר, צפיפות ושונה של קולטנים אלה syn סרט הרשתיתאפסיסים. בנוסף, postembedding immunogold מאפשר לוקליזציה של קולטנים מרובים להיבחן בו זמנית ברמת EM. פרוטוקול זה הועסק בהצלחה בזיהוי לוקליזציה של חלבונים בממברנה אחרים (למשל., קולטני GABA ואשלגן המופעל סידן [BK] ערוצים) סינפסות דו קוטבית מוט רשתית 35.

מספר גורמים הם קריטיים להצלחה בפרוטוקול זה. קיבעון ראשית, מהיר ועדין היא הצעד החשוב הראשון לשימור antigenicity ומבנה משובחים. שנית, בפרוטוקול "pH המשמרת" קיבעון מועיל לגילוי אופטימלי של אפיטופים אנטיגני ושימור ultrastructural טוב 36. שלישית, להקפיא החלפה משמרת את antigenicity של קולטנים, תוך שמירה על מבנה עדין סביר. רביעית, במהלך מכתים immunogold, חיץ TBST (עם טריטון X-100) משמש עם הדגירה נוגדן, בעוד TBS חיץ (ללא טריטון X-100) משמשלשטיפה בין ואחרי הדגירה של נוגדנים; זה עשוי למזער שינויים במבנה בסדר. החמישית, במהלך חילופי פתרונות, חלקים נשמרים רטובים להפחית חפצים הנגרמים על ידי ייבוש רקמות.

בעוד פרוטוקול postembedding immunogold המתואר כאן מספק שיטה משופרת לזיהוי קולטנים הממברנה הסינפסה סרט רשתית, זה לא כל כך רגיש כמו preembedding שיטות immunohistochemical; אבל האחרון הם לא אופציה טובה כי הם סובלים סגוליים נמוכים יחסית והם פחות מקובלים כימות כאמור לעיל. הפרוטוקול שלנו גם פשרות מבנה עדין במידה מסוימת, לעומת רקמות קבועות ביתר שאת לא מוכנה immunolabeling. יש לקוות, חידושים בעתיד יהיה להתגבר על המגבלות האלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכניות המיפוי של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) ואת המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (NIDCD), של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). אנו מודים מתקן NINDS EM ואת ליבת ההדמיה המתקדמת NIDCD (קוד # ZIC DC 000,081-03) לקבלת סיוע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde EMS 15710
Glutaraldehyde EMS 16019
NaH2PO4 Sigma S9638
Na2HPO4 Sigma 7782-85-6
CaCl2 Sigma C-8106
BSA Sigma A-7030
Triton X-100 Sigma T-8787
NaOH Sigma 221465
NaN3 JT Baker V015-05
Glycerol Gibco BRL 15514-011
Lowicryl HM 20 Polysciences 15924-1
Tris-Base Fisher BP151-500
Tris Fisher 04997-100
Anti-GluN2A Millipore AB1555P Dilution 1/50
Anti-GluN2B Millipore AB1557P Dilution 1/30
Anti-GluA2/3 Millipore AB1506 Dilution 1/30
Anti-PSD-95 Millipore MA1–046 Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles EMS 25704 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles EMS 25814 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles EMS 25812 Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles Jackson ImmunoResearch 705-215-147 Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. EMS FCF2010-Ni
Uranyl acetate EMS 22400-1
Methanol EMS 67-56-1
Lead citrate Leica
Leica EM AFS Leica
Leica EM CPC Leica
Ultramicrotome Leica
JEOL 1200 EM JEOL
liquid nitrogen  Roberts Oxygen
Propane Roberts Oxygen
CTB List Biological Laboratories 104 1 - 1.2%
Anti-CTB List Biological Laboratories 703 Dilution 1/4,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

Tags

Neuroscience גיליון 108 נוירוביולוגיה רשתית הסינפטי והפצה perisynaptic מיקרוסקופית אלקטרונים immunogold תא גנגליון ברשתית NMDA AMPA PSD-95
ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. … More

Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses. J. Vis. Exp. (108), e53547, doi:10.3791/53547 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter