The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Glutamat ist der hauptsächliche exzitatorische Neurotransmitter im Netzhaut 1. Retinalen Ganglienzellen (RGC), glutamatergen synaptischen Input von bipolaren Zellen 2 sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut erhalten, die visuelle Information an das Gehirn senden. Physiologische Untersuchungen zeigten, dass die synaptische Erregung von RGCs vermittelt wird postsynaptisch von NMDA-Rezeptoren (NMDARs) und AMPA-Rezeptoren (AMPARs) 3,4,5. Obwohl exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in RGCs durch AMPARs und NMDARs 3,5,6,7,8, zeigen spontane Miniatur EPSCs (mEPSCs) auf RGCs vermittelt werden nur eine AMPARs vermittelte Komponente 4,5,9. Allerdings ergab Glutamataufnahme Reduktion eines NMDAR Komponente in spontanen EPSCs 5, was darauf hindeutet, dass NMDARs auf RGC Dendriten können außerhalb von Synapsen befinden. Membranassoziierten Guanylat-Kinasen (MAGUKs) wie PSD-95, dass Cluster Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich Glutamat-Rezeptoren und Ionenkanals bei synaptischen Websites, auch deutliche subsynaptischen Expressionsmuster 10,11,12,13,14 aufweisen.
In den letzten Jahrzehnten konfokalen Immunhistochemie und Pre-Einbettung Elektronenmikroskop (EM) Immunhistochemie wurden zu studieren Membran-Rezeptor-Expression eingesetzt. Obwohl konfokalen Immunfärbung breites Muster der Rezeptorexpression offenbart, macht seine geringere Auflösung unmöglich subzellulären Ort zu unterscheiden zu können. Pre-Einbettung EM-Studien in Säugernetzhaut zeigen, dass NMDAR Untereinheiten in postsynaptischen Elemente bei Konus Bipolarzelle Band Synapsen 15,16,17 vorhanden sind. Dies ist in der scheinbaren Gegensatz zu physiologischen Beweise. Jedoch Diffusion von Reaktionsprodukt ist ein bekannter Artefakt in der Pre-Einbettungs Immunperoxidase-Verfahren. Daher ist dieser Ansatz nicht in der Regel statistisch verlässliche Daten geben und Unterscheidung zwischen Lokalisierung zu synaptischen Membran gegen extrasynaptischen Membran 18,19,20,21 ausschließen. Aufdie andere Hand, physiologischen und anatomischen Daten sind mit einem synaptischen Lokalisation von AMPARs auf RGCs 3,5,7,9,22 konsistent. Somit Glutamatrezeptoren und MAGUKs bei Netzhautband Synapse nicht nur lokalisiert der postsynaptischen sondern auch auf die perisynaptic oder extrasynaptischen Membran Fächern. Jedoch ist ein hochauflösender quantitative Analyse dieser Membranproteine in einer Netzhautband Synapse wird noch benötigt.
Hier entwickelten wir ein postembedding EM Immunogold Technik die subsynaptischen Lokalisierung von NMDAR-Untereinheiten, AMPAR Untereinheiten und PSD-95, gefolgt von der Schätzung der Anzahl, Dichte und die Variabilität dieser Proteine an Synapsen auf Ratten RGCs untersucht markierten Choleratoxin-Untereinheit B mit (CTB) Rückverfolgung Methoden.
Wir haben vier beschriebenen Techniken für eine erfolgreiche quantitative Post-Einbettung Immun EM: 1) kurze und schwache Fixierung, 2) Gefriersubstitution, 3) nach dem Einbetten von Immunfärbung und 4) Quantifizierung.
EM Immunogold ermöglicht den Nachweis von spezifischen Proteinen in ultradünne Gewebeschnitten. Markierte Antikörper mit Goldpartikeln kann direkt unter Verwendung von EM visualisiert werden. Während mächtig in die subsynaptischen Lokalisierung eines Membranrezeptors z…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die Interne Programme des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) und National Institute on Taubheit und andere Communication Disorders (NIDCD), von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Wir danken dem NINDS EM Anlage und die NIDCD Advanced Imaging-Kern (Code # ZIC DC 000081-03) um Hilfe.
Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
BSA | Sigma | A-7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
NaOH | Sigma | 221465 | |
NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
Tris | Fisher | 04997-100 | |
Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
Methanol | EMS | 67-56-1 | |
Lead citrate | Leica | ||
Leica EM AFS | Leica | ||
Leica EM CPC | Leica | ||
Ultromicrotome | Leica | ||
JEOL 1200 EM | JEOL | ||
liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
Propane | Roberts Oxygen | ||
CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |