Summary

Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Published: February 18, 2016
doi:

Summary

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Abstract

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Introduction

Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur majeur dans la rétine 1. Ganglionnaires rétiniennes de cellules (CGR), recevoir une entrée synaptique glutamatergique de cellules bipolaires 2, les neurones de la rétine de sortie qui envoient des informations visuelles au cerveau. Des études physiologiques ont montré que l'excitation synaptique du CGR est médiée par postsynaptique récepteurs NMDA (de NMDARs) et les récepteurs AMPA (AMPA) 3,4,5. Bien que les courants post-synaptiques excitateurs (de EPSCs) dans CGR sont médiés par des récepteurs AMPA et NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs miniatures spontanés (mEPSCs) sur CGR présentent seulement une composante AMPA médiation 4,5,9. Toutefois, la réduction glutamate absorption révélé une composante de NMDAR dans EPSCs spontanées 5, ce qui suggère que NMDARs sur dendrites RGC peuvent être situés à l'extérieur des synapses excitateurs. guanylate kinase associée à la membrane (de MAGUKs) tels que PSD-95 que les récepteurs de neurotransmetteurs grappe, y compris les récepteurs de glutamate et de canal ioniques sur les sites synaptiques, présentent également des profils d'expression subsynaptic distinctes 10,11,12,13,14.

Au cours des dernières décennies, l'immunohistochimie confocale et-enrobage pré microscope électronique (EM) immunohistochimie ont été employés pour étudier l'expression du récepteur de la membrane. Bien immunocoloration confocal révèle les grandes tendances de l'expression du récepteur, sa résolution inférieure, il est impossible d'utiliser de distinguer localisation subcellulaire. Pré-enrobage des études de Em In rétine des mammifères indiquent que les sous-unités NMDAR sont présents dans les éléments post-synaptiques à cônes bipolaires synapses à ruban de cellules 15,16,17. Ceci est en contraste apparent à l'évidence physiologique. Toutefois, la diffusion du produit de réaction est un artefact bien connue dans la méthode de pré-enrobage immunoperoxydase. Par conséquent, cette approche ne donne généralement pas de données statistiques fiables et peut exclure distinction entre la localisation de membrane synaptique par rapport extrasynaptique 18,19,20,21 de la membrane. SurD'autre part, les données physiologiques et anatomiques sont compatibles avec une localisation synaptique des récepteurs AMPA sur CGR 3,5,7,9,22. Ainsi, les récepteurs du glutamate et à la rétine MAGUKs ruban synapse sont localisés, non seulement pour le post-synaptiques, mais aussi dans les compartiments membranaires ou périsynaptiques extrasynaptiques. Cependant, une analyse quantitative à haute résolution de ces protéines membranaires dans un ruban synapse rétine est encore nécessaire.

Ici, nous avons développé une technique postembedding EM immunologique d'examiner la localisation subsynaptic de sous-unités NMDAR, sous-unités AMPAR et PSD-95 puis en estimant le nombre, la densité et la variabilité de ces protéines au niveau des synapses SUR DES CGR de rat marquée en utilisant la sous-unité de la toxine cholérique B (CTB) méthodes de traçage rétrograde.

Protocol

Soin et la manipulation des animaux étaient conformes aux NIH de protection des animaux et les lignes directrices utilisation Comité. jour postnatal (P) 15-21 Les rats Sprague-Dawley, injectés avec 1-1,2% CTB bilatéralement par le colliculus supérieur, ont été maintenus sur un 12: la lumière de 12 h: cycle d'obscurité. 1. Fixation de tissu rétinien Assembler les matériaux et outils suivants: Un microscope à dissection, 2 pinces avec des pointes très fines, des cis…

Representative Results

Les résultats présentés ici montrent remarquablement différents modèles de localisation de subsynaptic Glua 3.2 et NMDARs dendrites sur RGC dans la rétine de rat, comme décrit précédemment 24,25. 77% de particules de 2/3 Glua immunomarquage dans RGC profils dendritiques étaient situés au sein de la PSD (figure 1A), similaire à la plupart des synapses centrales. Cependant, NMDARs étaient situées soit synaptique ou extrasynaptically. 83% de particu…

Discussion

Nous avons décrit quatre techniques pour la réussite de l'intégration post-immuno EM quantitative: 1) à court et à faible fixation, 2) de gel-substitution, 3) post-intégration immunomarquage, et 4) la quantification.

EM immunologique permet la détection de protéines spécifiques dans des coupes de tissus ultraminces. Des anticorps marqués avec des particules d'or peuvent être directement visualisées en utilisant EM. Bien que puissante dans la détection de la localisation …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les programmes intra-muros de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NINDS) et l'Institut national sur la surdité et d'autres troubles de la communication (NIDCD), des National Institutes of Health (NIH). Nous remercions l'installation NINDS EM et l'avancée noyau NIDCD d'imagerie (Code # ZIC DC 000081-03) pour l'assistance.

Materials

Paraformaldehyde EMS 15710
Glutarldehyde EMS 16019
NaH2PO4 Sigma S9638
Na2HPO4 Sigma 7782-85-6
CaCl2 Sigma C-8106
BSA Sigma A-7030
Triton X-100 Sigma T-8787
NaOH Sigma 221465
NaN3 JT Baker V015-05
Glycerol Gibco BRL 15514-011
Lowicryl HM 20 Polysciences 15924-1
Tris-Base Fisher BP151-500
Tris Fisher 04997-100
Anti-GluN2A Millipore AB1555P Dilution 1/50
Anti-GluN2B Millipore AB1557P Dilution 1/30
Anti-GluA2/3 Millipore AB1506 Dilution 1/30
Anti-PSD-95 Millipore MA1–046 Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles EMS 25704 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles EMS 25814 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles EMS 25812 Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles Jackson ImmunoResearch 705-215-147 Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. EMS FCF2010-Ni
Uranyl acetate EMS 22400-1
Methanol EMS 67-56-1
Lead citrate Leica
Leica EM AFS Leica
Leica EM CPC Leica
Ultromicrotome Leica
JEOL 1200 EM JEOL
liquid nitrogen  Roberts Oxygen
Propane Roberts Oxygen
CTB List Biological Laboratories 104 1-1.2%
Anti-CTB List Biological Laboratories 703 Dilution 1/4000

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Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y., Diamond, J. S. High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses. J. Vis. Exp. (108), e53547, doi:10.3791/53547 (2016).

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