Introduction
Glutamat er den dominerende excitatoriske neurotransmitter i nethinden 1. Retina-ganglieceller (RGC'er), der modtager glutamaterge synaptiske input fra bipolære celler 2, er output-neuroner i nethinden, der sender visuel information til hjernen. Fysiologiske undersøgelser viste, at synaptisk excitation af RGC'er medieres postsynaptisk af NMDA-receptorer (NMDARs) og AMPA-receptorer (AMPARs) 3,4,5. Selvom excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSCs) i RGC'er formidles af AMPARs og NMDARs 3,5,6,7,8, spontane miniature EPSCs (mEPSCs) på RGC'er udviser kun en AMPARs-medieret komponent 4,5,9. Men reduktion glutamatoptagelse afslørede en NMDAR komponent i spontane EPSCs 5, hvilket antyder, at NMDARs på RGC dendritter kan være placeret uden for excitatoriske synapser. Membranassocierede guanylat kinaser (MAGUKs) såsom PSD-95 at klynge neurotransmitterreceptorer, herunder glutamatreceptorer og ionkanals ved synaptiske steder, også udviser distinkte subsynaptic ekspressionsmønstre 10,11,12,13,14.
I de seneste årtier, konfokal immunhistokemi og præ-embedding elektronmikroskop (EM) immunhistokemi har været ansat til at studere membran receptor udtryk. Selv konfokal immunfarvning afslører brede mønstre af receptorekspression, dens lavere opløsning gør det umuligt at bruge til at skelne subcellulær placering. Pre-indlejring EM studier i pattedyrs nethinden viser, at NMDAR underenheder er til stede i postsynaptiske elementer ved kegle bipolære celle bånd synapser 15,16,17. Dette er i tilsyneladende modsætning til fysiologiske beviser. Imidlertid diffusion af reaktionsprodukt er et velkendt artefakt i præ-embedding immunperoxidase-metoden. Derfor er denne fremgangsmåde ikke normalt give statistisk pålidelige data og kan udelukke skelnen mellem lokalisering til synaptisk membran versus ekstrasynaptiske membran 18,19,20,21. PåDerimod fysiologiske og anatomiske data stemmer overens med et synaptisk lokalisering af AMPARs på RGC'er 3,5,7,9,22. Således er glutamatreceptorer og MAGUKs på retinal bånd synapse lokaliseret ikke alene til den postsynaptiske men også de perisynaptic eller ekstrasynaptiske membran rum. Dog er der stadig behov for en høj opløsning kvantitativ analyse af disse membranproteiner i en retinal bånd synapse.
Her har vi udviklet en postembedding EM immunguld teknik til at undersøge subsynaptic lokalisering af NMDAR underenheder, Ampar underenheder og PSD-95 efterfulgt af anslå antallet, tæthed og variation af disse proteiner på synapser onto rotte RGC'er mærket hjælp kolera toksin subunit B (CTB) retrograd tracing metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleje og håndtering af dyr var i overensstemmelse med NIH Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Postnatal dag (P) 15-21 Sprague-Dawley-rotter, der var injiceret med 1-1,2% CTB bilateralt gennem den overlegne colliculus, blev opretholdt på en 12: 12-timers lys: mørke-cyklus.
1. Retinal vævsfiksering
- Saml følgende materialer og redskaber: En dissektionsmikroskop, 2 pincet med meget fine tips, sakse, cellulose filter papir, plastik pipette og et objektglas.
- Anesthetize rotte i et lukket kammer med 2,0 ml halothan (en inhalant bedøvelse). Bestem tilstrækkelig bedøvelse ved disse metoder: manglende tilbagetrækning af bagerste pote efter tå knivspids, eller mangel på blink refleks. Så halshugge straks med en guillotine. Fjern øjnene med et par iris saks og anbringes i en glasskål indeholdende 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatpuffer (PB) ved pH 7,4.
- Ved hjælp af dissektionsmikroskop, fjerne majsea ved at afskære den forreste del af øjeæblet. Fjern linsen og glaslegemet fra den indre nethinde overflade med en pincet.
- Peel sclera med de to pincet indtil nethinden er isoleret fra øjestykket.
- Skær nethinden straks i 100 - 200 um-tykke strimler med en barberkniv, og med forbehold pH-skift fiksering.
- Fix nethinde strimler i 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer ved pH 6,0 for 20 - 30 minutter og derefter i 4% paraformaldehyd plus 0,01% glutaraldehyd ved pH 10,5 til 10 - 20 minutter ved stuetemperatur.
- Efter flere vaske i PB med 0,15 mM CaCl2 (pH 7,4 ved 4 ° C), cryoprotect de retinale strips med glycerol (60 min hver i 10%, 20%, 30%, så O / N i 30%) i 0,1 M PB før fryse substitution.
2. Freeze-substitution
BEMÆRK: Denne fryse-substitutionsmetoden er modificeret fra en tidligere offentliggjort protokol 19,20. Det er også afgørende, at instrumenterne er meget koldt (handsker); oellers kendetegner kan vævet tø delvist ved berøring med instrumenterne. Alle disse trin udføres i AFS kammeret og instrumenterne er aldrig tilladt at flytte over kanten af kammeret. Tilsvarende korrekt afkøling af alle kemikalier, der anvendes i AFS er nødvendig.
- Plunge-indefryse retinale strimler i flydende propan ved -184 ° C i en EM kryopræservering instrument (CPC). Ved hjælp af en fin pensel, placere prøverne på små stykker af dobbelt-stick tape knyttet til metal stubbe, der går på enden af de kaster stænger (væge off ekstra buffer ved hjælp af pensel).
- Styrte stængerne i den flydende propan og blive deri i ca. 5 sek, og derefter overføre til den automatiske fryse-substitution instrument (AFS) med en lille transport kammer, der er fyldt med flydende nitrogen ( 'LN2 afkølet cryo transfer container').
- Efter placering af frosne prøve og instrumenter (pincet og skalpel) i AFS, køle instrumenterne i kammeret for seVeral minutter, før du rører vævet, eller køle dem ved at placere spidsen af instrumenterne i et par sekunder ind i det lille transport kammer (fyldt med flydende kvælstof ( 'LN 2 afkølede cryo transfer container «)).
- Når i AFS, fjerne prøven og tape fra stub med en fin skalpel. Hold også nitrogengas flow kontrol, TF (TF beskrives som en "regulator kontrol for LN 2 fordamper) åben i disse procedurer.
- Forud for at placere det frosne væv ind i de flade-embedding holdere (dvs., før opsætning af AFS), klippe en tynd cirkel fra en klar plastfolie og læg det i bunden af holderen, så som til linje bunden af hver brønd. Dette tillader relativt lettere fjernelse af polymeriserede eksemplar blokke når du er færdig.
BEMÆRK: Tidligere brugte vi en alternativ metode til de flade integreringstilladelserne indehavere, og beskæftiger dobbelt Reichert + gelatinekapsler (se Petralia og Wenthold, 1999) <sup> 20. - Brug følgende automatiske sekvens i AFS (ved hjælp af instrumentet terminologi): T1 = -90 ° C i 32 timer, S1 = temperaturstigning på 4 ° C / time (11,3 timer), T2 = -45 ° C i 50 timer, S2 = temperaturstigning på 5 ° C / time (9 timer), T3 = 0 ° C i 40 timer (total = 142,3 timer). Det kan tage 2 - 4 timer at placere prøver i AFS (ved -90 ° C), før start af tidsstyret sekvens.
- Fordyb de frosne sektioner i 1,5% uranylacetat i methanol ved -90 ° C i> 32 timer i AFS. Placer to stykker af væv (typisk) i hver af de syv brønde i aluminium indehaveren af fladskærms-embedding (tre passer ind i AFS).
- Placer vævet + bånd i uranylacetat / methanol i brøndene og fjern tapen senere, lige før begyndelsen indstøbningsmedium (såsom Lowicryl HM20) infiltration, hvis det er for vanskeligt at fjerne væv fra båndet.
- Derefter øges temperaturen trinvis til -45 ° C (+ 4 ° C pr time; i den automatiske sekvens).
- Vask prøverne tre gange i forvejen afkølet methanol, ved hjælp af en spids plastik pipette til at fjerne den gamle løsning fra hver lejlighed-embedding holder, og derefter bruge en anden standard plastik pipette for at tilføje den forkølet frisk methanol.
- Derefter bruger samme metode, infiltrere prøverne progressivt med lav temperatur indlejring harpikser, såsom indlejringsmedium (HM20 / methanol ved 1: 1 og 2: 1, hver i 2 timer, efterfulgt af ren harpiks i 2 timer og derefter ændre harpikserne og holde O / N).
- Skift harpiksen igen den næste dag, justering af niveauet af harpiksen at nå lige til den øverste kant af brøndene.
- Polymerisere prøverne (-45 ° C til 0 ° C i automatisk sekvens; + 5 ° C pr time) med UV-lys i 40 timer.
- Fjern derefter prøverne fra AFS. Typisk sample blokke viser stadig nogle pinkness i farve. Placer prøverne tæt på fluorescerende lys i stinkskab, ved stuetemperatur O / N eller længere, indtil de appøre helt klar.
3. Postembedding EM immunoguld Immuncytokemi
BEMÆRK: Postembedding immuncytokemi udføres som beskrevet 23,24,25.
- Skær 1 um sektioner med ultramikrotom, bejdse sektioner med 1% toluidin-blåt, og undersøge dem for afsnit orientering; orientere vævsblokken at opnå den optimale tværgående plan af sektionering.
- Skær 70 nm tykke ultratynde sektioner med ultramikrotom og samle dem på Formvar-carbon-belagt nikkel slot net.
- Wash riste én gang i destilleret H2O efterfulgt af en Tris-bufret saltvand tre gange (TBS, 0,05 M Tris-puffer, 0,7% NaCl, pH 7,6) vask.
- Inkuber gitre i 20 pi dråber 5% BSA i TBS i 30 min, og derefter i 20 pi dråber af en blanding indeholdende gede-anti-CTB (1: 3.000) og et antistof mod én NMDAR underenhed (anti-kanin GluN2A 01:50 , GluN2B 01:30), eller et anti-kanin GluA2 / 3 (01:30)i TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) med 2% BSA og 0,02 M NaN3 O / N ved stuetemperatur.
- Vask gitre på tre separate dråber (20 pi) af TBS (pH 7,6) i 10, 10 og 20 min, efterfulgt af TBS (pH 8,2) i 5 minutter.
- Inkuber gitre i 2 timer på dråber (20 pi) af en blanding indeholdende æsel anti-kanin IgG (1:20) koblet til 10 nm guldpartikler og æsel-anti-gede-IgG (1:20) koblet til 18 nm guldpartikler i TBST (pH 8,2) med 2% BSA og 0,02 M NaN3.
- Vask gitre i 20 pi dråber af TBS (pH 7,6) i 5, 5, og 10 min, derefter i ultrarent vand og derefter tørre dem.
- Kontrastfarve gitre med 5% uranylacetat og 0,3% bly citrat i destilleret H2O til 8 og 5 min under mørke forhold, hhv.
- Til forsøg triple-mærkning, inkuberes gitre O / N ved stuetemperatur med 20 pi dråber af en blanding af anti-gede-CTB (1: 3.000), anti-muse PSD-95 (1: 100), og anti-kanin GluN2A (1 : 50). Derefter inkuberes gitre i 2 timer på 20 pi dråber af en blanding af IgG'er koblet til 18, 10 og 5 nm guldpartikler i TBST (pH 8,2) med 2% BSA og 0,02 M NaN3. Hold samme procedurer som dobbelt mærkning til vask og modfarvning mellem og efter antistof inkubation.
- Kontroller blev udført i hvilken de sekundære antistoffer blev anvendt alene.
- Vis gitre på en EM og digitalisere billeder. Proces endelige tal i Adobe Photoshop 6.0 kun for lysstyrke og kontrast, hvis det er nødvendigt 24.
4. Kvantificering
- Manuelt udvalgte områder af den indre plexiform lag (IPL) uden huller eller revner på 8,000X forstørrelse, derefter fotomontage tilfældigt den fulde dybde af IPL på 25,000X forstørrelse.
- Identificer RGC dendritter på kegle bipolære dyader når de a) indeholder retrogradt transporteres CTB signal (store guldpartikler), b) udviser veldefinerede membraner, kløfter og postsynaptiske tætheder, c) indeholder mindst to små guld delicles i PSD, eller mere end en lille guld partikel langs ekstrasynaptiske plasmamembranen.
- Saml 45 - 55 RGC dendritter, baseret på ovennævnte kriterier, til kvantitativ analyse.
- Måle længderne af PSD og ekstrasynaptiske plasmamembran individuelle RGC dendritter med NIH ImageJ software. Count guldpartikler inden for 10 nm af membranen som membranassocierede, baseret på en gennemsnitlig tykkelse af 7 - 9 nm for plasmamembranen 26.
- Beregn partikeldensitet som antallet af guldpartikler pr lineær mikrometer (guld / um). Mål afstanden mellem midten af hver guld partikel og midten af PSD (for synaptisk placering) eller kanten af PSD (for ekstrasynaptiske placering).
- Statistisk analyse ved hjælp af software. Brug to-tailed t-test til sammenligning af middelværdier. Indgå betydning, når P <0,05. Medmindre andet er angivet, rapportværdier som middelværdi ± SEM 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne præsenteres her demonstrerer påfaldende forskellige subsynaptic lokalisering mønstre af GLUa 2/3 og NMDARs på RGC dendritter i rotte nethinden, som tidligere 24,25 beskrevet. 77% af GLUa 2/3 immunogold partikler i RGC dendritiske profiler blev placeret i PSD (figur 1A), der ligner mest centrale synapser. Men NMDARs blev placeret enten synaptisk eller extrasynaptically. 83% af GluN2A immunogold partikler blev lokaliseret i PSD (figur 1C, 2A, 2B), fortrinsvis ved OFF synapser og guldpartiklerne var mere koncentreret i midten af PSD (figur 2C). I modsætning hertil blev det store flertal af partikler mærkning af GluN2B (96%), der ligger uden for PSD (figur 1B, 2A, 2B), fordelt primært langs ekstrasynaptiske plasmamembranen, med toppen partikeldensitet ved 180 nm fra kanten af PSD (figur 2B). Navnlig GluN2B udviste en præference for ON synapser. I en undergruppe af eksperimenter, samtidig mærkning af GluN2A, PSD-95 og CTB indikerede, at GluN2A og PSD-95 blev colocalized i PSD af OFF RGC dendritter (Figur 1D), hvor NR2A var i den dendritiske membran mens PSD-95 var under membranen, hvilket tyder på, at de er forankret i PSD. En væsentlig forskel i guld tæthed mellem perisynaptic membran og mitochondriemembraner blev observeret, hvilket tyder på en særlig mærkning i det tidligere (figur 2D).
Figur 1. immunguld Mærkning Viser Synaptic og Perisynaptic Lokalisering af glutamatreceptorer på RGC dendritter mærket af CTB. (A): double immunguld mærkning af GluA2 / 3 (10 nm guld) og CTB (18 nm guld). Præsynaptiske bånd angivet med pilespidser. lille gold partikler er grupperet (pil) i PSD af RGC processer. (B) dobbelt immunguld mærkning af GluN2B (10 nm guld) og CTB (18 nm guld); små guldpartikler (pil) er på den ekstrasynaptiske plasmamembranen. (C) dobbelt immunguld mærkning af GluN2A (10 nm guld) og CTB (18 nm guld). Svarende til GluA2 / 3, er små partikler grupperet i PSD. (D) Triple immunguld mærkning af GluN2A (5 nm guld), PSD-95 (10 nm guld) og CTB (18 nm guld). GluN2A guldpartikler (små pile) og PSD-95 guldpartikler (store pile) er co-lokaliseret i PSD på individuelle CTB-positive RGC dendritter. Indsat: højere forstørrelse af PSD. Målestok: 0,1 um (A = C = D, B). Det er nye mikrografier baseret på data offentliggjort i Zhang og Diamond 24,25. Klik her for at viewa større version af dette tal.
Figur 2. Kvantitativ Sammenligning af NMDAR Lokalisering i RGC dendritter. (A) Et histogram viser den tangentielle fordeling af immunoguld for GluN2A (n = 53 profiler) og GluN2B (n = 56 profiler) i og uden for PSD. Den perisynaptic region var opdelt i 60 nm siloer. (B) Et histogram viser mærkning tæthed af immunoguld partikler til GluN2A (n = 53 profiler) og GluN2B (n = 56 profiler). Den perisynaptic region var opdelt i 180 nm siloer fra kanten af PSD. (C) Et histogram viser den tangentielle fordelingen af det samlede antal immunoguld partikler for GluN2A (n = 44 profiler) og GluN2B (n = 3 profiler) på alle profiler med mærkning i PSD. (D) Sammenligning af partikeldensitet afimmunoguld partikler for GluN2B (n = 53 og 33 profiler) og GluN2A (n = 9 og 30) i de perisynaptic membraner og mitokondrier membran, henholdsvis i CTB-positive RGC processer. Disse histogrammer ændres fra histogrammer offentliggjort i Zhang og Diamond 24,25. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet fire teknikker for vellykket kvantitativ post-embedding immunogold EM: 1) korte og svage fiksering, 2) fryse-substitution, 3) post-embedding immunguld-farvning, og 4) kvantificering.
EM immunguld tillader påvisning af specifikke proteiner i ultratynde vævssnit. Antistoffer mærket med guldpartikler direkte kan visualiseres under anvendelse af EM. Mens magtfulde i påvise subsynaptic lokalisering af en membran receptor, kan EM immunogold være teknisk udfordrende, og kræver streng optimering af væv fiksering og forarbejdningsmetoder.
At finde en optimal balance mellem membran integritet og antigenicitet, vi testede forskellige fiksering metoder og tidspunkter. For eksempel kan en vellykket protokol, der bruges til postembedding EM NMDAR på centrale synapser 19,20 ikke har kunnet påvise NMDAR immunoreaktivitet i nethinden. Denne undersøgelse anvendte blid fiksering og korte inkubationstider tilundgå at reducere af NMDA antigenicitet efter stærk, langvarig fiksering 16.
Fryse-substitution metode blev først udviklet til ultrastrukturel lokalisering af glutamatreceptorer i begyndelsen af 1990'erne 27, og involverer lav temperatur infiltration og polymerisation i et ikke-polært, hydrofob harpiks, HM20 28, der er nødvendige for optimal postembedding immunguld mærkning. Den specifikke fryse-substitution metode bruges her er udviklet til mærkning glutamatreceptorer i cochlea 29 og optimeret til glutamatreceptorer i centrale synapser 18,19,20,30, og den er blevet ændret yderligere i de seneste år. Den lave temperatur infiltration og polymerisering af harpiksen bidrager til at bevare antigeniciteten af varmelabile molekyler og minimerer lipid ekstraktion og uønskede kemiske reaktioner mellem harpiks og væv 19,31. Kombineret med de ovenfor beskrevne fiksering metoder, dette fryse-substitutionsmetoden provides god antigenicitet og rimelig strukturel konservering.
Den postembedding immunguld teknik, der anvendes her har flere fordele i forhold til preembedding immunperoxidase metoden. Selvom preembedding immunperoxidase metode har højere følsomhed 15,16,17,19,20,21, diffusion af reaktionsprodukt er uundgåelig, hvilket resulterer i uspecifik mærkning 26,32. Endvidere er peroxidase enzymreaktionen ikke lineær 21, hvilket gør det vanskeligt kvantitativt at evaluere den præcise subsynaptic lokalisering af receptorer 18,21. Den postembedding immunguld fremgangsmåde anvender en ikke-diffunderbare markør og udfører den immunreaktion på overfladen af resin-embedded tissue, hvilket reducerer diffunderbare artefakter og tillader højere rumlig opløsning 18,33,34. Guldpartikler direkte kan tælles i øvrigt gør det muligt at estimere antallet, tæthed og variabilitet af disse receptorer ved retinal bånd synapses. Desuden postembedding immunogold muliggør lokalisering af multiple receptorer, der skal samtidigt undersøgt på EM-niveau. Denne protokol er blevet anvendt med held til at identificere lokaliseringen af andre membranproteiner (f.eks., GABA-receptorer og calcium-aktiverede kalium [BK] kanaler) i retinal rod bipolære synapser 35.
Flere faktorer er afgørende for succes i denne protokol. Først, hurtig og skånsom fiksering er det første vigtige skridt for bevarelsen af antigenicitet og fin struktur. Andet, "pH-shift" protokol for fiksering er til gavn for optimal detektion af de antigene epitoper og god ultrastrukturelle konservering 36. Tredje, fryse-substitution bevarer antigeniciteten af receptorerne, og samtidig opretholde rimelige fin struktur. Fjerde, under immunoguld farvning, TBST puffer (med Triton X-100) anvendes med antistof inkubation mens TBS-buffer (uden Triton X-100) anvendestil vask mellem og efter inkubation af antistoffer; dette kan minimere ændringer i fin struktur. Femte, under udskiftning af opløsninger, er sektioner holdes våd at reducere artefakter forårsaget af væv tørring.
Mens den her beskrevne postembedding immunguld protokol giver en forbedret fremgangsmåde til identifikation membranreceptorer på retinal bånd synapse, er det ikke helt så følsom som preembedding immunhistokemiske metoder; men sidstnævnte er ikke en god løsning, fordi de lider af relativt lavere specificitet og er mindre modtagelige for kvantificering som nævnt ovenfor. Vores protokol kompromitterer også fin struktur i nogen grad, sammenlignet med kraftigere fikseret væv ikke forberedt immunolabeling. Forhåbentlig vil fremtidige innovationer overvinde disse begrænsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af intramuralt Programmer for National Institute of Neurologiske og Stroke (NINDS) og National Institute on Døvhed og anden kommunikation Disorders (NIDCD), af National Institutes of Health (NIH). Vi takker NINDS EM faciliteten og NIDCD avancerede billedbehandling kerne (kode # ZIC DC 000.081-03) for at få hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
- Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
- Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
- Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
- Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
- Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
- Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
- Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
- Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
- Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
- Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
- Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
- Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
- Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
- Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
- Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
- Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
- Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
- Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
- Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
- Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
- Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
- Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).
