Introduction
Glutamat retinada 1 majör eksitatör nörotransmiter olduğunu. Bipolar hücreleri 2 glutamaterjik sinaptik girdi alan retina ganglion hücrelerinin (RGCs), beyne görsel bilgi göndermek retinanın çıkış nöronları vardır. Fizyolojik çalışmaları RGCs sinaptik uyarım NMDA reseptörlerinin (NMDARs) ve AMPA reseptörleri (AMPARs) 3,4,5 tarafından postsynaptically aracılık ettiğini göstermiştir. RGCs eksitatuvar postsinaptik akımlar (EPSCs) AMPARs ve NMDARs aracılık ettiği, ancak RGCs ilgili 3,5,6,7,8 spontan minyatür EPSCs (mEPSCs) sadece AMPARs aracılı bileşen 4,5,9 sergiler. Ancak, glutamat alımını azaltarak RGC dendritler üzerinde NMDARs uyarıcı sinaps dışında olabilir düşündüren, spontan EPSCs 5 bir NMDAR bileşeni saptandı. Membran ilişkili guanilat kinazlar PSD-95 olarak (MAGUKs) o glutamat reseptörleri ve iyon kanalının da dahil olmak üzere küme nörotransmitter reseptörleri,sinaptik s, ayrıca ayrı subsynaptic ekspresyonu 10,11,12,13,14 sergiler.
Son yıllarda, konfokal immünohistokimya ve ön gömme elektron mikroskobu (EM) immünohistokimya üzerinde zar reseptör ekspresyonunu incelemek için istihdam edilmiştir. konfokal immün reseptör ekspresyonunun geniş desenler ortaya koymaktadır rağmen, onun düşük çözünürlüklü imkansız hücre içi konumu ayırt etmek kullanmayı kolaylaştırır. Memeli retinada ön gömme EM çalışmaları NMDAR alt birimleri koni bipolar hücre şerit sinaps 15,16,17 de postsinaptik elemanları mevcut olduğunu göstermektedir. Bunun sebebi, fizyolojiksel kanıt açıkça aksine. Bununla birlikte, reaksiyon ürünü difüzyon ön gömme immünoperoksidaz yöntemi iyi bilinen bir sonucudur. Bu nedenle, bu yaklaşım genellikle istatistiksel güvenilir veriler vermez ve extrasynaptic membran 18,19,20,21 karşı sinaptik membran lokalizasyonu arasındaki ayrımı hariç tutabilir. üzerindeÖte yandan, fizyolojik ve anatomik veriler RGCs 3,5,7,9,22 üzerine AMPARs bir sinaptik lokalizasyonu ile uyumludur. Böylece, retina şerit sinaps glutamat reseptörleri ve MAGUKs postsinaptik değil, aynı zamanda perisynaptic veya extrasynaptic zar bölmelerine sadece lokalizedir. Ancak, retina şerit sinaps bu zar proteinlerinin yüksek çözünürlüklü kantitatif analiz hala ihtiyaç duyulmaktadır.
Burada, kolera toksin altbirim B kullanılarak etiketli (CTB) sıçan RGCs üzerine sinaps bu proteinlerin sayısı, yoğunluğu ve değişkenliği tahmin izledi NMDAR alt birimden, Ampar alt birimlerin ve PSD-95 subsynaptic lokalizasyonu incelemek için bir postembedding EM immunogold tekniği geliştirdi retrograd izleme yöntemleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bakım ve hayvanların taşıma NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komite Kurallarına göre idi. 12 saat ışık: Postnatal gün (P) bilateral üstün colliculus ile 1-1.2% CTB enjekte 15-21 Sprague-Dawley sıçanları, 12 muhafaza edildi karanlık döngüsü.
1. Retina Doku Fixation
- Bir diseksiyon mikroskobu, çok ince ipuçları, makas, selüloz filtre kağıdı, plastik pipet ve bir mikroskop lamı ile 2 forseps: Aşağıdaki malzemeler ve aletler monte edin.
- 2.0 mi, halotan (bir uçucu anestezik) ile kapalı bir bölme sıçan anestezisi. ayak tutam veya göz kırpma refleksi eksikliği sonra arka pençe çekilmesi eksikliği: bu yöntemlerle yeterli anesthetization belirleyin. Sonra, bir giyotinle birlikte derhal başını kesmek. pH 7.4'te 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB) içinde% 4 paraformaldehid içeren bir cam tabak içinde iris makas ve yer ile gözler çıkarın.
- diseksiyon mikroskobu kullanarak, mısır kaldırmakgöz küresinin ön keserek ad. forseps ile iç retina yüzeyinden lens ve vitreus çıkarın.
- Retina Göz yuvası izole edilene kadar iki forseps ile sklera soyun.
- Bir jilet ile 200 mikron kalınlığında şeritler ve pH-shift tespitin tabi - 100 içine hemen retina kesti.
- Oda sıcaklığında 20 dakika için 10 - pH 10.5, 30 dakika ve daha sonra% 4 paraformaldehid artı% 0.01 glutaraldehid - 20 pH 6.0'da 0.1 M PB içinde% 4 paraformaldehit retina şeritler düzeltildi.
- (4 ° C'de pH 7.4), 0.15 mM CaCI2 ile PB pek çok kez yıkamadan sonra, 0.1 (% 30 O / N sonra% 10,% 20,% 30, her 60 dakikada bir) M gliserol ile retina şeritler cryoprotect ikamesi dondurmak için önce PB.
2. Freeze-ikamesi
NOT: Bu donma-ikame yöntemi erken yayınlanmış bir protokol 19,20 modifiye edilir. Ayrıca, araçlar (eldiven giymek) çok soğuk olduğu önemlidir; Oaletleri ile dokunulduğunda therwise, doku kısmen çözülme olabilir. Bu adımların hepsi AFS odasının içinde yapılır ve cihazlar odasının kenarına üzerinde hareket etmek asla izin verilmez. Benzer şekilde, AFS kullanılan bütün kimyasal maddelerin uygun soğutma gereklidir.
- -Dalma donma bir EM kriyoprezervasyon enstrüman (TBM) içinde -184 ° C'de sıvı propan retina şeritler. ince bir fırça kullanarak, (fırça kullanarak ekstra tampon kapalı fitil) dalan çubukların ucunda gitmek metal taslakları bağlı çift sopa bant küçük parçalar üzerinde örnekleri yerleştirin.
- Sıvı propan içine çubuklar dalma ve yaklaşık 5 saniye boyunca orada tutun ve sonra sıvı nitrojen ile doldurulmuş küçük bir taşıma odasını kullanarak otomatik dondurarak ikame enstrüman (AFS) transfer ( 'LN 2 cryo transferi konteyner soğutmalı').
- AFS içine donmuş örnek ve aletleri (forseps ve neşter) yerleştirdikten sonra, se için odasında aletleri serinVeral dakika doku dokunmadan, ya da küçük nakil odasına birkaç saniye için araçların ipuçları koyarak bunları soğutmak önce (sıvı azot ile dolu () 'LN 2 cryo transferi konteyner soğutmalı').
- AFS kez ince bir neşter kullanılarak saplama numune ve bandı çıkarın. Ayrıca, azot gazı akış kontrol altında tutmak, TF bu işlemler sırasında açık (TF 'LN 2 buharlaştırıcı için regülatör kontrol' olarak tarif edilmiştir).
- (AFS kurmadan önce, yani) düz gömme sahipleri içine donmuş doku yerleştirmeden önce, şeffaf bir plastik levha ince bir daire kesip ve her iyi alt hattına kadar tutucu dibine yerleştirin. Bittiğinde Bu polimerize örnek blok görece daha kolay çıkarılmasını sağlar.
NOT: Daha önce, çift Reichert + jelatin kapsülleri (Petralia ve Wenthold, 1999 bakınız) istihdam düz katıştırma sahiplerine alternatif bir yöntem kullanılabilir, ve <sup> 20. - = 4 ° C / saat (11.3 saat), T2 ile 32 saat, S1 = artış sıcaklığı için T1 = -90 ° C -45 ° C 50 saat, S2 için: AFS (enstrüman terminolojiyi kullanarak) aşağıdaki otomatik dizisini kullanın = 5 ° C / saat (9 saat), (toplam = 142.3 saat) 40 saat süre ile T3 = 0 ° C artış sıcaklığı. önce zamanlı dizisi başlamadan (-90 ° C'de) AFS örnekleri yerleştirmek için 4 saat - 2 adet sürebilir.
- AFS> 32 saat boyunca -90 ° C'de metanol içinde% 1.5 uranil asetat içinde dondurulmuş bölümler bırakın. Düz gömme alüminyum tutucu yedi kuyu her dokuların (tipik olarak) iki adet yerleştirin (üç AFS uyması).
- kuyularda uranil asetat / metanol içine doku + bandı yerleştirin ve bant doku kaldırmak çok zor ise, hemen önce infiltrasyon (örneğin Lowicryl HM20 gibi) başlangıç gömme ortamına, daha sonra bandı çıkarın.
- Daha sonra sıcaklık adım adım artış, saat başına -45 ° C (+ 4 ° C; Otomatik sırayla).
- Her düz gömme sahibinden eski çözüm kaldırmak için ince uçlu bir plastik pipet kullanarak, ve sonra soğutulmuş taze metanol eklemek için başka bir standart plastik pipet kullanarak, önceden soğutulmuş metanol numuneleri üç kez yıkayın.
- 1 ve 2: Daha sonra, aynı yöntemi kullanarak, örneğin 1 de ortamı (HM20 / metanol gömme kütlesi olarak düşük sıcaklık gömme reçine ile kademeli örnekleri infiltre 2 saat boyunca saf reçine ardından 2 saat süre ile, 1 her biri, ve daha sonra reçine değiştirme ve) O / N tutun.
- Sadece kuyu üst kenarına ulaşmak için reçine seviyesinin ayarlanması, ertesi gün tekrar reçine değiştirin.
- örnekleri polimerize (-45 ° C, otomatik sırayla 0 ° C'ye kadar, saatte ortalama + 5 ° C) 40 saat süre ile, UV ışığı ile.
- Sonra AFS örnekler kaldırın. Tipik olarak, örnek bloklar hala renkli bazı pinkness göstermektedir. RT O kimyasal davlumbaz floresan ışık yakın örnekleri, koyun / N veya daha uzun onlar kadar uygulamaKulak tamamen net.
3. Postembedding EM immunogold İmmünositokimya
Not: 23,24,25 tarif edildiği gibi Postembedding immünositokimya gerçekleştirilir.
- % 1 toluidin mavisi ile 1 mikron Ultramikrotomla bölümleri, leke bölümleri kesmek ve bölüm oryantasyonu için onları incelemek; Kesit optimal enine uçağı elde etmek için doku bloğu yönlendirmek.
- Ultramikrotomla 70 nm kalınlığında ultra ince bölümleri kesmek ve Formvar-karbon kaplı nikel yuvası ızgaraları onları toplamak.
- Yıkama bir Tris-tamponlu tuzlu su, üç kez (TBS, 0.05 M Tris tamponu,% 0.7 NaCl, pH 7.6) yıkama izledi damıtılmış H2O içinde bir kez ağlar.
- ve bir NMDAR alt-birimi (anti-tavşan GluN2A 1:50 ila bir antikor: keçi anti-CTB ihtiva eden bir karışım 20 ul damla (3,000 1) daha sonra, 30 dakika TBS içinde% 5 BSA, 20 ul damlalar ızgaraları inkübe ve , GluN2B 1:30), ya da bir anti-tavşan GluA2 / 3 (1:30)% 2 BSA ile TBS-Triton (TBST,% 0.01 Triton X-100, pH 7.6) ve 0.02 M Nan 3 O / RT N.
- 5 dakika TBS (pH 8.2) ve ardından üç ayrı 10 için TBS damla (20 ul) (pH 7.6), 10, ve 20 dk yıkama ızgaraları.
- TBST içinde 18 nM altın parçacıklarına bağlanmıştır 10 nm altın parçacıkları ve eşek anti-keçi IgG (1:20) bağlı eşek anti-tavşan IgG (1:20) ihtiva eden bir karışım damla 2 saat (20 ul) için ızgaraları inkübe 2% BSA ve 0.02 M NaN 3 (pH 8.2).
- ultra saf su içinde, daha sonra 5, 5 ve 10 dakika süre ile TBS 20 ul damlalar (pH 7.6) 'de ızgaraları yıkayın ve kurutun.
- Sırasıyla, karanlık koşullarda 8 ve 5 dakika için damıtılmış H2O içinde% 5 uranil asetat ve% 0.3 kurşun sitrat ile karşı-ızgaralar.
- Paket etiketleme deneyleri için, ızgaralar inkübe O / anti-keçi CTB bir karışımının 20 ul damla (1: 3000) oda ısısında N, anti-fare PSD-95 (1: 100) ve anti-tavşan GluN2A (1 : 50). Ardından 2 2 saat süreyle ızgaraları inkübe2% BSA ve 0.02 M NaN 3 TBST içinde 18, 10, ve 5 nm ve altın parçacıklarına bağlanmıştır IgG'lerin bir karışımı (pH 8.2) içinde 0 ul düşer. Yıkama arasında ve antikor inkübasyondan sonra counterstaining çift etiketleme gibi aynı prosedürleri tutun.
- Kontroller ikincil antikorlar, tek başına uygulandığında edildiği yapılmıştır.
- Bir EM isimli ızgaraları ve digitalize görüntüler. 24 gerekirse, sadece parlaklık ve kontrast için Adobe Photoshop 6.0 final rakamları işleyin.
4. sayısallaştırılması
- El ile 8,000X büyütmede delik veya çatlak olmadan iç pleksiform tabakasının (IPL) seçkin alanlar, daha sonra rastgele 25,000X büyütmede IPL tam derinliğini fotomontaj.
- bunlar: a) retrograd taşınan CTB sinyali (büyük altın parçacıkları) içerir, b) sergiler iyi tanımlanmış membranlar, yarıklar ve postsinaptik yoğunlukları, c) en az iki küçük altın bölümü içerdiğinde konik bipolar çiftlerinde de RGC dendrit tespitPSD içindeki icles veya extrasynaptic plazma zarı boyunca, birden fazla küçük bir altın parçacığı.
- kantitatif analiz için yukarıdaki kriterlere göre, 55 RGC dendrit - 45 toplayın.
- PSD ve NIH ImageJ yazılımı ile bireysel RGC dendritler extrasynaptic plazma zarı uzunlukları ölçün. Membranın 10 nm olan altın parçacıkları sayısı 7, bir ortalama kalınlığına göre, membran bağlantılı - plazma zarı 26 9 nm.
- Doğrusal mikrometre (altın / um) başına altın parçacıkları sayısı parçacık yoğunluğu hesaplayın. Her altın parçacığının merkezi ve (sinaptik konumu için) PSD ortasında ya da (extrasynaptic konumu için) PSD kenarı arasındaki mesafeyi ölçün.
- yazılım tarafından istatistiksel analiz. karşılaştırmak için iki kuyruklu t-testi kullanın. önemi p <0.05 varıldı. Aksi belirtilmedikçe, rapor değerleri ± SEM 18 demek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce 24,25 açıklandığı gibi burada sunulan sonuçlar, sıçan retina RGC dendritler üzerinde çarpıcı farklı subsynaptic lokalizasyon GluA 2/3 kalıplarını ve NMDARs göstermektedir. RGC dendritik profillerde GluA 2/3 immünolojik parçacıklarının% 77, merkezi sinapslara benzer PSD (Şekil 1A) içinde yer. Ancak, NMDARs ya sinaptik veya extrasynaptically bulunurdu. GluN2A immünolojik partiküllerin% 83 PSD lokalize edilmiştir (Şekil 1 c, 2a, 2b), tercihen kapalı sinaps ve altın parçacıkları en PSD (Şekil 2C) merkezine daha konsantre edildi. Bunun aksine, GluN2B (% 96) için partiküller, etiketleme büyük bir kısmı kenarından 180 nm'de zirve parçacık yoğunluğu, esas olarak extrasynaptic plazma zarı boyunca dağıtılmış, PSD (Şekil 1B, 2A, 2B) dışında bulunan edildi PSD (Şekil 2B). Özellikle, GluN2B üzerindeki sinapslar için bir tercih gösterdi. Deneyler, GluN2A PSD-95 ve CTB eşzamanlı etiketleme bir alt PSD-95 altında ise GluN2A ve PSD-95 NR2A dendritik membran olduğu kapalı RGC dendritler (Şekil 1D), bir PSD lokalize olduğunu göstermiştir membran, onlar PSD demirlemiş düşündürmektedir. Perisynaptic membran ve mitokondriyal membranlar arası altın yoğunluğunda önemli bir fark, birincisinin (Şekil 2D) belirli bir etiketleme öne gözlenmiştir.
CTB tarafından Etiketli RGC Dendritler de Synaptic ve Glutamat Reseptör perisynaptic Yerelleştirme Gösterilen Şekil 1. immunogold etiketleme. (A): GluA2 / 3 (10 nm altın) ve CTB (18 nm altın) çift immunogold etiketleme. Presinaptik şeritler ok uçları ile gösterilir. küçük gold parçacıklar PSD RGC süreçlerinde (ok) kümelenir. (B) GluN2B (10 nm altın) ve CTB (18 nm altın) çift immunogold etiketleme; Küçük altın parçacıkları (ok) extrasynaptic plazma membranı üzerinde bulunmaktadır. (C) GluN2A (10 nm altın) ve CTB (18 nm altın) çift immunogold etiketleme. GluA2 / 3'e benzer, küçük parçacıklar PSD içinde kümelenmiş. (D) GluN2A (5 nm altın) Üçlü immunogold etiketleme, PSD-95 (10 nm altın) ve CTB (18 nm altın). GluN2A altın parçacıkları (küçük oklar) ve PSD-95 altın parçacıkları (büyük oklar) co-lokalize bireysel CTB-pozitif RGC dendritler üzerinde PSD içindedir. Ankastre: PSD yüksek büyütme. Ölçek çizgisi: 0.1 um (A = C = D, B). Bunlar Zhang ve Diamond 24,25 yayınlanan verilere dayalı yeni mikrografikleridir. Vie için tıklayınızBu rakamın wa daha büyük bir versiyonu.
RGC Dendritler içinde NMDAR Yerelleştirme Şekil 2. Kantitatif Karşılaştırılması. (A) GluN2A (n = 53 profil) ve GluN2B (n = 56 profiller) için immünolojik teğet dağılımını gösteren bir histogram içinde ve PSD dışında. perisynaptic bölge 60, mil depo ayrılmıştır. (B) GluN2A (n = 53 profil) ve GluN2B (n = 56 profiller) için İmmünogold parçacıkların etiketleme yoğunluğunu gösteren bir histogram. perisynaptic bölgesi PSD kenarından 180 nm depo ayrılmıştır. (C) PSD içindeki etiketleme ile tüm profillere de GluN2A (n = 44 profil) ve GluN2B (n = 3 profil) için immünolojik parçacıkların sayısının teğet dağılımını gösteren bir histogram. (D) Parçacık yoğunluğunun karşılaştırmasıCTB pozitif RGC işlemlerinde ise GluN2B (n = 53, 33 profilleri) ve GluN2A (n = 9 ve 30), perisynaptic zarlarında ve mitokondriyal membran için immünolojik parçacıklar. Bu histogramlar Zhang ve Diamond 24,25 yayınlanan histogramlar modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başarılı kantitatif sonrası gömme immunogold EM için dört teknikleri tarif etmişlerdir: 1) kısa ve zayıf tespit, 2) donma-ikamesi, 3)-sonrası gömme immunogold boyama ve 4) ölçümü.
EM immünolojik ultra ince doku kesitlerinde spesifik proteinlerin belirlenmesini sağlar. altın partikülleri ile etiketlenmiş antikorlar ile doğrudan EM kullanılarak görüntülenebilir. Bir zar reseptörü subsynaptic lokalizasyonu tespit güçlü iken, EM immünolojik teknik açıdan zor olabilir ve doku fiksasyon ve işleme yöntemlerinin sıkı optimizasyon gerektirir.
membran bütünlüğü ve antijenite arasında optimal bir denge, biz farklı tespit yöntemleri ve süreleri test edilmiştir. Örneğin, merkezi sinaps 19,20 en postembedding EM NMDAR için kullanılan, başarılı bir protokol retinada NMDAR immünoreaktivite tespit edemedi. Bu çalışma için yumuşak fiksasyon ve kısa inkübasyon süreleri istihdamGüçlü, uzun tespit sonrası 16 NMDA reseptör antijenite azaltılması kaçının.
Dondurularak değiştirme yöntemi ilk 1990'ların başında 27 glutamat reseptörlerinin ultrastrüktürel lokalizasyonu için geliştirilmiş ve iyi postembedding immünolojik etiketleme için gerekli polar olmayan, hidrofob reçine, HM20 28, düşük sıcaklık infiltrasyonu ve polimerizasyonu edildi. Burada kullanılan özel dondurularak ikame yöntemi koklea 29 etiketleme glutamat reseptörleri için geliştirilmiş ve merkezi sinaps 18,19,20,30 glutamat reseptörleri için optimize edilmiştir ve son yıllarda daha da modifiye edilmiş oldu. Reçinenin düşük sıcaklık infiltrasyonu ve polimerizasyon ısıya duyarlı moleküllerin antijenitesini korumaya yardımcı olur ve lipid ekstraksiyonu ve reçine ve doku 19,31 arasındaki ters kimyasal reaksiyonları en aza düşürmektedir. Yukarıda tarif edilen tespit yöntemleri, bu dondurma-ikame yöntemi s ile kombineİyi antijenisiteyi ve makul yapısal koruma rovides.
Burada kullanılan postembedding immünolojik tekniği preembedding immünoperoksidaz yöntemi ile karşılaştırıldığında birçok avantaja sahiptir. Preembedding immünoperoksidaz yöntemi yüksek hassasiyet 15,16,17,19,20,21 sahip olmasına rağmen, reaksiyon ürünü difüzyon spesifik olmayan etiketleme 26,32 sonuçlanan kaçınılmazdır. Ayrıca, peroksidaz enzim reaksiyonu zor nicel reseptörlerin 18,21 hassas subsynaptic lokalizasyonu değerlendirmek için yapım, 21 doğrusal değildir. Postembedding immünolojik yöntem olmayan yayılabilir işaretleyici kullanır ve yayılabilir eserler azaltır ve daha yüksek uzamsal çözünürlük 18,33,34 izin reçineden gömülmüş doku yüzeyinde immunoreaksiyonunu gerçekleştirir. Altın parçacıkları doğrudan mümkün retina şerit syn de bu reseptörlerin sayısı, yoğunluğu ve değişkenliği tahmin yapma, dahası, sayılabilirapsis. Buna ek olarak, immünolojik postembedding birden fazla reseptör lokalizasyonu aynı EM seviyesinde incelenebilir sağlar. Bu protokol başarıyla retina çubuk bipolar sinapsların 35 diğer membran proteinleri (örn., GABA reseptörleri ve kalsiyum ile aktive edilen potasyum [BK] kanalları) lokalizasyonu belirlenmesi istihdam edilmiştir.
Çeşitli faktörler bu protokolün başarısı için hayati öneme sahiptir. Birinci, hızlı ve nazik tespit antijenite ve ince yapısının korunması için ilk önemli adımdır. İkincisi, sabitleme için "pH-shift" protokol antijenik epitopların optimal algılama ve iyi ultrastrüktürel korunması 36 için faydalıdır. Makul ince yapı korurken Üçüncü olarak, donma-ikame, reseptörlerin antijenliğini korur. Dördüncü olarak, antikor, inkübasyon ile birlikte kullanılır (Triton X-100) ile immünolojik boyama, TBST tamponu içinde sırasında kullanılır (Triton X-100 olmadan) TBS tamponuile antikorlar inkübasyonundan sonra yıkama için; Bu ince yapı değişiklikleri en aza indirebilir. Beşinci olarak, çözümlerin değişimi sırasında, bölümler doku kurutma kaynaklanan eserler azaltmak için ıslak tutulur.
Burada açıklanan postembedding immunogold protokolü retina şerit sinaps zar reseptörlerine belirlenmesi için geliştirilmiş bir yöntem sağlar iken, immunohistokimyasal yöntemler preembedding gibi oldukça duyarlı değildir; nispeten düşük bir özgüllük muzdarip yukarıda belirtildiği gibi miktar daha az uygundurlar, çünkü ikinci iyi bir seçenek değildir. immunolabeling için hazırlanan daha kuvvetli sabit dokuya kıyasla protokol, aynı zamanda, bir ölçüde ince yapı zayıflatır. Umarım, gelecek yenilikler bu sınırlamaları aşmak olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü (NIDCD), (NIH) İntramural Programları tarafından desteklendi. Biz NINDS EM tesis ve yardım için NIDCD gelişmiş görüntüleme çekirdek (kod # ZIC DC 000081-03) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
- Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
- Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
- Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
- Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
- Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
- Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
- Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
- Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
- Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
- Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
- Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
- Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
- Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
- Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
- Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
- Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
- Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
- Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
- Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
- Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
- Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
- Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).
