Introduction
Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio nella retina 1. Cellule gangliari della retina (RGCs), che ricevono in ingresso sinaptica glutammatergica da cellule bipolari 2, sono i neuroni di uscita della retina che inviano le informazioni visive al cervello. Studi fisiologici hanno mostrato che l'eccitazione sinaptica di RGCs è mediata da recettori NMDA postsinaptica (NMDARs) e recettori AMPA (AMPARs) 3,4,5. Anche se le correnti post-sinaptiche eccitatorie (EPSCs) in RGCs sono mediate da AMPARs e NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs miniatura spontanee (mEPSCs) su RGCs mostrano solo una componente AMPARs mediata 4,5,9. Tuttavia, la riduzione del glutammato captazione rivelato una componente NMDAR in EPSCs spontanee 5, suggerendo che NMDARs su dendriti RGC possono essere situati al di fuori delle sinapsi eccitatorie. Associata alla membrana guanilato chinasi (MAGUKs) come PSD-95 che i recettori grappolo neurotrasmettitori, tra cui i recettori del glutammato e canale ionicos nei siti sinaptici, mostrano anche diversi modelli di espressione subsinaptico 10,11,12,13,14.
Negli ultimi decenni, immunoistochimica confocale e l'incorporamento di pre-microscopio elettronico immunoistochimica (EM) sono stati impiegati per studiare l'espressione del recettore di membrana. Anche se immunostaining confocale rivela ampi schemi di espressione dei recettori, la sua risoluzione più bassa rende impossibile l'utilizzo di distinguere posizione subcellulare. -Embedding Pre studi EM in retina di mammifero indicano che subunità NMDAR sono presenti negli elementi post-sinaptici a cono bipolari sinapsi nastro cellule 15,16,17. Questo è in evidente contrasto con prove fisiologica. Tuttavia, la diffusione del prodotto di reazione è un artefatto noto nel metodo dell'immunoperossidasi pre-embedding. Quindi, questo approccio di solito non dà dati statisticamente affidabili e può escludere distinzione tra la localizzazione di membrana sinaptica contro 18,19,20,21 membrana extrasinaptica. SopraD'altra parte, i dati fisiologici e anatomici sono coerenti con una localizzazione sinaptica di AMPARs su RGCs 3,5,7,9,22. Così, i recettori del glutammato e MAGUKs a sinapsi nastro retinica sono localizzate non solo al postsinaptica ma anche ai compartimenti di membrana perisynaptic o extrasinaptica. Tuttavia, è ancora necessaria una ad alta risoluzione analisi quantitativa di queste proteine di membrana in una sinapsi nastro della retina.
Qui, abbiamo sviluppato una tecnica postembedding EM immunogold per esaminare la localizzazione subsinaptico di subunità NMDAR, subunità Ampar e PSD-95 seguita da stimare il numero, la densità e la variabilità di queste proteine a livello delle sinapsi Onto RGCs ratto etichettati utilizzando tossina colerica subunità B (CTB) metodi di tracciamento retrogrado.
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Protocol
Cura e trattamento degli animali erano in conformità con NIH cura degli animali e linee guida del Comitato Usa. Postnatale giorno (P) 15-21 ratti Sprague-Dawley, iniettati con 1-1,2% CTB bilateralmente attraverso il collicolo superiore, sono stati mantenuti su un 12: luce 12-hr: ciclo scuro.
1. Fissazione tessuto retinico
- Montare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto fini, forbici, carta da filtro di cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio.
- Anestetizzare ratto in una camera chiusa con 2,0 ml alotano (un anestetico inalante). Determinare un'adeguata anestesia con questi metodi: la mancanza di ritiro della zampa posteriore dopo pizzico punta, o la mancanza di riflesso corneale. Poi decapitare immediatamente con una ghigliottina. Rimuovere gli occhi con un paio di forbici iris e mettere in un piatto di vetro contenente 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
- Utilizzando il microscopio da dissezione, rimuovere il maisEA tagliando la parte anteriore del bulbo oculare. Rimuovere la lente e vitreale dalla superficie della retina interna con una pinza.
- Sbucciare la sclera con le due pinze fino a quando la retina è isolato dal oculare.
- Tagliare la retina immediatamente in 100 - 200 strisce micron di spessore con un rasoio, e soggetti a fissaggio variazione del pH.
- Fix strisce retina in 4% paraformaldeide in 0.1 M PB a pH 6,0 per 20 - 30 min e poi in 4% paraformaldeide più 0,01% glutaraldeide a pH 10,5 per il 10 - 20 min a temperatura ambiente.
- Dopo alcuni lavaggi in PB con 0.15 mM CaCl 2 (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect le strisce retinici con glicerolo (60 min ogni a 10%, 20%, 30%, poi O / N a 30%) in 0,1 M PB prima di congelare la sostituzione.
2. Fermo-sostituzione
NOTA: Questo metodo freeze-sostituzione viene modificato da un precedente protocollo pubblicato 19,20. Inoltre, è fondamentale che gli strumenti sono molto freddi (indossare guanti); otherwise, il tessuto può scongelare parzialmente quando viene toccato con gli strumenti. Tutti questi passaggi sono fatti all'interno della camera di AFS e gli strumenti sono mai permesso di passare sopra il bordo della camera. Allo stesso modo, il corretto raffreddamento di tutte le sostanze chimiche utilizzate nella AFS è necessario.
- Tuffatevi-congelare le strisce della retina in propano liquido a -184 ° C in uno strumento EM crioconservazione (CPC). Utilizzando un pennello fine, posizionare i campioni su piccoli pezzi di nastro biadesivo attaccato ai mozziconi di metallo che vanno sulla fine delle aste a strapiombo (stoppino off tampone usando il pennello).
- Plunge le aste in propano liquido e tenere lì per circa 5 secondi, e poi il trasferimento allo strumento freeze-sostituzione automatica (AFS) con una piccola camera di trasporto che viene riempito con azoto liquido ( 'LN 2 raffreddato contenitore di trasferimento crio').
- Dopo aver posizionato il campione congelato e strumenti (pinze e bisturi) nel AFS, raffreddare gli strumenti nella camera per SEminuti veral prima di toccare il tessuto, o raffreddarli ponendo le punte degli strumenti per pochi secondi nella piccola camera di trasporto (riempito con azoto liquido ( 'LN 2 raffreddata contenitore di trasferimento crio')).
- Una volta in AFS, togliere il campione e nastro dalla stub usando una multa bisturi. Inoltre, mantenere il controllo del flusso di gas di azoto, TF (TF è descritto come un 'controllo del regolatore per LN 2 vaporizzatore') aperto durante queste procedure.
- Prima di posizionare il tessuto congelato nei supporti piatti incorporamento (cioè, prima di impostare la AFS), tagliare un cerchio sottile da un foglio di plastica trasparente e posizionarlo nella parte inferiore del supporto in modo da far corrispondere il fondo di ciascun pozzetto. Questo permette relativamente facile rimozione dei blocchi campione polimerizzati quando finito.
NOTA: In precedenza, abbiamo utilizzato un metodo alternativo per i titolari di incorporamento piatte, e impiegando doppi Reichert + capsule di gelatina (vedi Petralia e Wenthold, 1999) <sup> 20. - Utilizzare la seguente sequenza automatica in AFS (usando la terminologia strumento): T1 = -90 ° C per 32 ore, S1 = aumento di temperatura di 4 ° C / ora (11,3 ore), T2 = -45 ° C per 50 ore, S2 = aumento di temperatura di 5 ° C / ora (9 ore), T3 = 0 ° C per 40 ore (totale = 142,3 ore). Si può prendere 2 - 4 ore di inserire campioni nel AFS (a -90 ° C) prima di iniziare la sequenza temporizzata.
- Immergere le sezioni congelate di 1,5% di acetato di uranile in metanolo a -90 ° C per> 32 ore in AFS. Mettere due pezzi di tessuti (in genere) in ciascuno dei sette pozzi nel supporto di alluminio piatto embedding (tre assemblata nel AFS).
- Posizionare il tessuto + nastro nella acetato di uranile / metanolo nei pozzetti e rimuovere il nastro dopo, appena prima dell'inizio mezzo di inclusione (ad esempio Lowicryl HM20) infiltrazione, se è troppo difficile rimuovere il tessuto dal nastro.
- Poi aumentare la graduale della temperatura a -45 ° C (+ 4 ° C per ora; in sequenza automatica).
- Lavare i campioni per tre volte in metanolo pre-raffreddata, utilizzando una pipetta di plastica a punta fine per rimuovere la vecchia soluzione da ciascun titolare piatta-embedding, e quindi utilizzando un'altra pipetta di plastica standard per aggiungere il metanolo fresco preraffreddato.
- Poi, usando lo stesso metodo, infiltrarsi campioni progressivamente con basse resine temperatura incorporamento come mezzo di inclusione (HM20 / metanolo 1: 1 e 2: 1, ciascuno per 2 ore, seguita da resina pura per 2 ore e quindi modificare le resine e mantenere O / N).
- Cambiare la resina nuovamente il giorno successivo, regolando il livello della resina per raggiungere solo al bordo superiore dei pozzetti.
- Polimerizzare i campioni (-45 ° C a 0 ° C in sequenza automatica; + 5 ° C per ora) con luce UV per 40 hr.
- Quindi rimuovere i campioni dal AFS. In genere, i blocchi di esempio mostrano ancora un po 'di colore rosa a colori. Posizionare i campioni vicini alla luce fluorescente nella cappa, a RT O / N o più a lungo fino a quando non apporecchio del tutto chiaro.
3. Postembedding EM Immunogold Immunocitochimica
NOTA: Postembedding immunocitochimica viene eseguita come descritto 23,24,25.
- Tagliare 1 micron sezioni con ultramicrotomo, sezioni macchia con 1% toluidina-blu, e li esaminerà per l'orientamento sezione; orientare il blocco di tessuto per ottenere il piano trasversale ottimale di sezionamento.
- Tagliare 70 nm sezioni ultrasottili di spessore con ultramicrotomo e alla loro raccolta di nichel di slot griglie Formvar-carbonio rivestite.
- Lavare griglie una volta in H 2 O distillata O seguita da una soluzione salina tamponata con Tris tre volte (TBS, 0,05 M di tampone Tris, 0.7% NaCl, pH 7,6) lavaggio.
- Incubare griglie 20 gocce microlitri di 5% BSA in TBS per 30 minuti, e poi in 20 gocce microlitri di una miscela contenente capra anti-CTB (1: 3.000) ed un anticorpo per un NMDAR subunità (anti-rabbit GluN2A 01:50 , GluN2B 1:30), o un anti-rabbit GluA2 / 3 (1:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) con 2% BSA e 0,02 M NaN 3 O / N a RT.
- griglie Lavare su tre gocce separate (20 microlitri) di TBS (pH 7,6) per 10, 10, e 20 minuti, seguiti da TBS (pH 8,2) per 5 min.
- Incubare griglie per 2 ore in gocce (20 mL) di una miscela contenente asino IgG anti-coniglio (1,20) accoppiata a 10 nm particelle d'oro e IgG asino anti-capra (1:20) accoppiata a particelle d'oro 18 nm in TBST (pH 8.2) con 2% BSA e 0,02 M NaN 3.
- Lavare griglie in 20 gocce microlitri di TBS (pH 7,6) per 5, 5, e 10 min, poi in acqua ultrapura e poi asciugare.
- Griglie di contrasto con il 5% di acetato di uranile e lo 0,3% di piombo citrato di H 2 O distillata per 8 e 5 minuti in condizioni di oscurità, rispettivamente.
- Per gli esperimenti triple-etichettatura, incubare le griglie O / N a temperatura ambiente con 20 gocce microlitri di una miscela di anti-capra CTB (1: 3.000), anti-topo PSD-95 (1: 100), e anti-coniglio GluN2A (1 : 50). Poi incubare griglie per 2 ore su 20 gocce microlitri di una miscela di IgG accoppiata a 18, 10 e 5 particelle di oro nm in TBST (pH 8.2) con 2% BSA e 0,02 M NaN 3. Mantenere le stesse procedure doppia marcatura per il lavaggio e controcolorazione tra e dopo l'incubazione degli anticorpi.
- I controlli sono stati eseguiti in cui gli anticorpi secondari sono stati applicati solo.
- Vedi griglie su un EM e digitalizzare immagini. Elaborare dati definitivi in Adobe Photoshop 6.0 solo per la luminosità ed il contrasto se necessario 24.
4. Quantificazione
- Selezionare manualmente aree del livello plessiforme interno (IPL), senza buchi o crepe a 8,000X ingrandimento, quindi fotomontaggio a caso tutta la profondità di IPL a 25,000X ingrandimento.
- Identificare dendriti RGC a cono diadi bipolari quando a) contengono il segnale CTB retrograda trasportato (grandi particelle d'oro), b) mostrano ben definito membrane, crepacci, e densità post-sinaptici, c) contengono almeno due piccola parte in oroicles all'interno del PSD, o più di una piccola particella d'oro lungo la membrana plasmatica extrasinaptica.
- Raccogliere 45 - 55 dendriti RGC, sulla base di criteri di cui sopra, per l'analisi quantitativa.
- Misurare le lunghezze del PSD e la membrana plasmatica extrasinaptica dei singoli dendriti RGC con il software NIH ImageJ. Conteggio particelle d'oro entro 10 nm della membrana come associata alla membrana, basato su uno spessore medio di 7 - 9 nm per la membrana plasmatica 26.
- Calcolare la densità di particelle come il numero di particelle d'oro per micrometro lineare (oro / micron). Misurare la distanza tra il centro di ogni particella oro e la metà del PSD (per la posizione sinaptica) o il bordo del PSD (per la posizione extrasinaptica).
- Effettuare analisi statistiche da parte del software. Utilizzare due code t-test per confrontare le medie. Concludere significato quando P <0,05. Se non diversamente indicato, i valori di rapporto come media ± SEM 18.
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Representative Results
I risultati qui presentati dimostrano sorprendentemente diversi modelli di localizzazione subsinaptico di GluA 2/3 e NMDARs sui dendriti RGC in retina di ratto, come descritto in precedenza 24,25. 77% di GluA 2/3 particelle immunogold in RGC profili dendritiche erano situati all'interno del PSD (Figura 1A), simile alla maggior sinapsi centrali. Tuttavia, NMDARs erano situati sia sinapticamente o extrasynaptically. 83% di particelle immunogold GluN2A stati localizzata nel PSD (Figura 1C, 2A, 2B), preferenzialmente alle sinapsi OFF, e le particelle di oro erano più concentrato al centro del PSD (Figura 2C). Al contrario, la grande maggioranza di etichettatura particelle per GluN2B (96%) erano situati all'esterno del PSD (Figura 1B, 2A, 2B), distribuiti prevalentemente lungo la membrana plasmatica extrasinaptica, con la densità di picco di particelle a 180 nm dal bordo della PSD (Figura 2B). In particolare, GluN2B mostrato una preferenza per sinapsi ON. In un sottogruppo di esperimenti, l'etichettatura simultanea di GluN2A, PSD-95 e CTB indicato che GluN2A e PSD-95 sono stati colocalized nel PSD di dendriti OFF RGC (Figura 1D), dove NR2A era nella membrana dendritiche mentre PSD-95 è stato al di sotto la membrana, suggerendo che sono ancorati al PSD. È stata osservata una differenza significativa di densità d'oro tra la membrana perisynaptic e membrane mitocondriali, suggerendo una etichettatura specifica nel primo (Figura 2D).
Figura 1. Immunogold etichettatura Mostrando Synaptic e Perisynaptic localizzazione di glutammato recettori a RGC dendriti etichettati da CTB. (A): doppia marcatura immunogold di GluA2 / 3 (10 nm oro) e CTB (18 nm oro). nastri presinaptica indicati da frecce. piccolo gold particelle sono raggruppati (freccia) nel PSD di RGC processi. (B) doppia marcatura immunogold di GluN2B (10 nm oro) e CTB (18 nm d'oro); particelle d'oro di piccole dimensioni (freccia) si trovano sulla membrana plasmatica extrasinaptica. (C) doppia marcatura immunogold di GluN2A (10 nm oro) e CTB (18 nm oro). Simile a GluA2 / 3, piccole particelle sono raggruppati all'interno del PSD. (D) Triple etichettatura immunogold di GluN2A (5 nm oro), PSD-95 (10 nm oro) e CTB (18 nm oro). particelle GluN2A oro (piccole frecce) e PSD-95 particelle di oro (grandi frecce) sono co-localizzati all'interno del PSD sui singoli dendriti RGC CTB-positivi. Nel riquadro: maggiore ingrandimento della PSD. Barra della scala: 0,1 micron (A = C = D, B). Si tratta di nuove microscopio in base ai dati pubblicati nel Zhang e Diamante 24,25. Cliccate qui per viewa più grande versione di questa figura.
Figura 2. Confronto quantitativo di NMDAR Localizzazione in RGC dendriti. (A) Un istogramma che mostra la distribuzione tangenziale immunogold per GluN2A (n = 53 profili) e GluN2B (n = 56 profili) all'interno e all'esterno della PSD. La regione perisynaptic è stato diviso in 60 scomparti nm. (B) Un istogramma che mostra la densità di etichettatura delle particelle immunogold per GluN2A (n = 53 profili) e GluN2B (n = 56 profili). La regione perisynaptic era diviso in 180 bidoni nm dal bordo del PSD. (C) Un istogramma che mostra la distribuzione tangenziale del numero totale di particelle immunogold per GluN2A (n = 44 profili) e GluN2B (n = 3 profili) a tutti i profili con un'etichettatura a PSD. (D) Confronto di densità di particelle diparticelle immunogold per GluN2B (n = 53 e 33 profili) e GluN2A (n = 9 e 30) nelle membrane perisynaptic e la membrana mitocondriale, rispettivamente, nei processi RGC CTB-positivi. Questi istogrammi vengono modificati da istogrammi pubblicati Zhang e Diamante 24,25. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo descritto quattro tecniche per il successo post-embedding immunogold EM quantitativa: 1) fissazione breve e debole, 2) freeze-sostituzione, 3) post-embedding colorazione immunogold, e 4) la quantificazione.
EM immunogold permette il rilevamento di proteine specifiche in sezioni di tessuto ultrasottili. Gli anticorpi marcati con particelle d'oro possono essere visualizzati direttamente usando EM. Mentre potente nel rilevare la localizzazione subsinaptico di un recettore di membrana, EM immunogold può essere tecnicamente impegnativo, e richiede una rigorosa ottimizzazione dei metodi di fissazione dei tessuti e lavorazione.
Per raggiungere un equilibrio ottimale tra l'integrità della membrana e antigenicità, abbiamo provato diversi metodi e tempi di fissazione. Ad esempio, un protocollo di successo usato per postembedding EM NMDAR alle sinapsi centrali 19,20 riuscito a rilevare NMDAR immunoreattività nella retina. Questo studio ha impiegato delicato fissazione e tempi di incubazione brevievitare di ridurre del recettore NMDA antigenicità dopo forte, la fissazione prolungato 16.
Il metodo di congelamento di sostituzione è stato sviluppato per la localizzazione ultrastrutturali dei recettori del glutammato nei primi anni 1990 27, e prevede l'infiltrazione bassa temperatura e la polimerizzazione in una non polare, resina idrofoba, HM20 28, necessaria per l'etichettatura ottimale postembedding immunogold. Il metodo freeze-sostituzione specifico utilizzato qui è stato sviluppato per recettori etichettatura glutammato nella coclea 29 e ottimizzato per i recettori del glutammato nelle sinapsi centrali 18,19,20,30, ed è stato ulteriormente modificato negli ultimi anni. L'infiltrazione bassa temperatura e la polimerizzazione della resina aiuta a preservare l'antigenicità di molecole termolabili e minimizza l'estrazione dei lipidi e reazioni chimiche avverse tra resina e tessuti 19,31. In combinazione con i metodi di fissazione sopra descritte, questo metodo freeze-sostituzione provides buona antigenicità e ragionevole di conservazione strutturale.
La tecnica postembedding immunogold usato qui ha diversi vantaggi rispetto al metodo preembedding dell'immunoperossidasi. Sebbene il metodo preembedding dell'immunoperossidasi ha una maggiore sensibilità 15,16,17,19,20,21, diffusione del prodotto di reazione è inevitabile, conseguente etichettatura aspecifica 26,32. Inoltre, la reazione enzimatica della perossidasi non è lineare 21, rendendo difficile valutare quantitativamente la precisa localizzazione di recettori subsinaptico 18,21. Il metodo postembedding immunogold impiega un marcatore non diffondente ed esegue la immunoreaction sulla superficie del tessuto resina incorporato, che riduce gli artefatti diffusibili e consente una maggiore risoluzione spaziale 18,33,34. particelle d'oro possono essere direttamente contati, inoltre, che consentano di stimare il numero, la densità e la variabilità di questi recettori a syn nastro retinicaabsidi. Inoltre, postembedding immunogold consente la localizzazione di molteplici recettori da simultaneamente esaminata a livello di EM. Questo protocollo è stato impiegato con successo per identificare la localizzazione di altre proteine di membrana (ad es., I recettori GABA e potassio canali [BK] calcio-activated) in retina asta sinapsi bipolari 35.
Diversi fattori sono cruciali per il successo di questo protocollo. In primo luogo, veloce e gentile fissazione è il primo passo importante per la conservazione della antigenicità e struttura fine. In secondo luogo, il protocollo "pH-shift" per il fissaggio è utile per il rilevamento ottimale degli epitopi antigenici e buona conservazione ultrastrutturale 36. In terzo luogo, freeze-sostituzione conserva l'antigenicità dei recettori, pur mantenendo la struttura fine ragionevole. In quarto luogo, durante la colorazione immunogold, tampone TBST (con Triton X-100) viene utilizzato con incubazione anticorpi, mentre tampone TBS (senza Triton X-100) è usatoper il lavaggio tra e dopo l'incubazione di anticorpi; questo può ridurre al minimo alterazioni nella struttura fine. In quinto luogo, durante lo scambio di soluzioni, le sezioni sono tenuti bagnato per ridurre gli artefatti causati da asciugatura dei tessuti.
Mentre il protocollo immunogold postembedding qui descritto fornisce un metodo migliorato per identificare recettori di membrana alla sinapsi nastro retinica, non è abbastanza sensibile come preembedding immunoistochimiche; ma quest'ultima non sono una buona opzione perché soffrono di specificità relativamente bassa e sono meno suscettibili di quantificazione come notato sopra. Il nostro protocollo compromette anche di struttura fine in una certa misura, rispetto al tessuto più forte fisso non preparata per immunomarcatura. Si spera, le innovazioni future superare questi limiti.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai programmi intramurale del National Institute of Neurological Disorder and Stroke (NINDS) e National Institute on Deafness altri disturbi della comunicazione e (NIDCD), del National Institutes of Health (NIH). Ringraziamo l'impianto NINDS EM e il nucleo NIDCD Advanced Imaging (codice # ZIC DC 000.081-03) per l'assistenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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