Introduction
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório na retina 1. Células ganglionares da retina (RGCs), recebendo entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, são os neurônios de saída da retina que enviam a informação visual ao cérebro. Estudos fisiológicos mostraram que a excitação sináptica das CGR é mediada por receptores de NMDA pós-sinapticamente (NMDAR) e os receptores de AMPA (AMPARs 3,4,5). Embora correntes pós-sinápticos excitatórios (EPSCS) em RGCs são mediadas por AMPARs e NMDAR 3,5,6,7,8, EPSCS miniatura espontâneas (mEPSCs) em RGCs exibem apenas um componente AMPARs mediada 4,5,9. No entanto, reduzindo a captação de glutamato revelou um componente NMDAR em EPSCS espontâneas 5, sugerindo que NMDAR em dendritos RGC pode ser localizado fora das sinapses excitatórias. guanilato quinases associadas a membranas (MAGUKs) como PSD-95 que os receptores de neurotransmissores, incluindo o agrupamento de receptores de glutamato e de canal iónicos em locais sinápticos, também apresentam padrões de expressão subsináptica distintas 10,11,12,13,14.
Nas últimas décadas, imuno-histoquímica confocal e pré-incorporação microscópio eletrônico de imuno-histoquímica (EM) foram utilizados para estudar a expressão do receptor de membrana. Embora imunocoloração confocal revela padrões gerais de expressão do receptor, a sua resolução mais baixa faz com que seja impossível utilizar para distinguir localização subcelular. Pré-incorporação de estudos de EM em retina de mamíferos indicam que subunidades NMDAr estão presentes em elementos pós-sinápticos no cone bipolares sinapses fita celular 15,16,17. Isto é, em aparente contraste com evidência fisiológica. No entanto, a difusão do produto da reacção é um artefacto bem conhecidos no método de imunoperoxidase pré-incorporação. Assim, esta abordagem não costumam dar os dados estatisticamente fiáveis e podem excluir distinção entre a localização de membrana sináptica contra 18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EmPor outro lado, os dados fisiológicos e anatómicos são consistentes com uma localização sináptica de AMPARs em RGCs 3,5,7,9,22. Assim, os receptores de glutamato e na sinapse MAGUKs fita da retina estão localizadas não apenas para o pós-sináptica, mas também para os compartimentos membranares perisynaptic ou extrasynaptic. No entanto, uma análise quantitativa de alta resolução destas proteínas da membrana em uma sinapse fita da retina é ainda necessária.
Aqui, nós desenvolvemos uma técnica postembedding EM imuno para examinar a localização subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades Ampar e PSD-95, seguido de estimar o número, a densidade e a variabilidade destas proteínas nas sinapses Onto RGCs rato etiquetado usando subunidade da toxina da cólera B (CTB) métodos de rastreio retrógrada.
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Protocol
Cuidados e manipulação dos animais estavam em conformidade com o NIH Animal Care e as diretrizes de uso das Comissões. dia pós-natal (P) 15-21 ratos Sprague-Dawley, injectados com 1-1,2% de CTB bilateralmente através do colículo superior, foram mantidos num 12: 12-h luz: ciclo escuro.
1. Fixação tecido da retina
- Monte os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinça com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio.
- Anestesiar o rato numa câmara fechada, com 2,0 ml de halotano (um anestésico de inalação). Determinar anesthetization adequada por estes métodos: a falta de retirada da pata traseira após pitada dedo do pé, ou a falta de reflexo de piscar. Então decapitar imediatamente com uma guilhotina. Remover os olhos com um par de tesouras de íris e colocar num prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
- Utilizando o microscópio de dissecação, remover o milhoEA cortando fora da parte dianteira do globo ocular. Remover a lente e vítreo a partir da superfície da retina interna com uma pinça.
- Descasque a esclerótica com as duas pinças até que a retina é isolado a partir da ocular.
- Cortar a retina imediatamente em 100 - 200 tiras mm de espessura com uma navalha, e sujeito a fixação pH-shift.
- Fix tiras retina em 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB a pH 6,0 durante 20 - 30 minutos e, em seguida, em 4% de paraformaldeído mais 0,01% de glutaraldeído a um pH de 10,5 para 10-20 min à temperatura ambiente.
- Após várias lavagens em PB com CaCl 0,15 mM de 2 (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect as tiras da retina com glicerol (60 min cada em 10%, 20%, 30%, em seguida, O / N em 30%) em 0,1 M PB antes de congelar substituição.
2. Freeze-substituição
NOTA: Este método de congelamento e substituição é modificada a partir de um protocolo publicado anteriormente 19,20. Além disso, é fundamental que os instrumentos são muito frios (usar luvas); otherwise, o tecido pode descongelar parcialmente quando tocado com os instrumentos. Todos estes passos são feitas no interior da câmara de AFS e os instrumentos não podem mover-se acima da borda da câmara. Da mesma forma, o resfriamento adequado de todos os produtos químicos utilizados no AFS é necessário.
- Mergulhar-congelar as tiras da retina em propano líquido a -184 ° C em um instrumento EM criopreservação (CPC). Usando um pincel fino, coloque as amostras em pequenos pedaços de fita dupla-stick ligados às bases metálicas que vão na extremidade das hastes mergulhando (pavio fora tampão extra usando o pincel).
- Mergulhar as varetas para o propano líquido e manter lá por cerca de 5 segundos, e depois transferir para o instrumento de congelamento e substituição automática (AFS), utilizando uma câmara de pequeno porte que é preenchido com nitrogênio líquido ( 'LN 2 refrigerado recipiente de transferência crio ").
- Depois de colocar a amostra congelada e instrumentos (fórceps e bisturi) para a AFS, arrefecer os instrumentos na câmara para seminutos veral antes de tocar o tecido, ou resfriá-los, colocando as pontas dos instrumentos por alguns segundos na câmara de pequeno porte (preenchido com nitrogênio líquido ( 'LN 2 refrigerado recipiente de transferência crio')).
- Uma vez no AFS, remova a amostra ea fita da parte de stub usando uma multa bisturi. Além disso, manter o controle de fluxo de gás nitrogênio, TF (TF é descrito como um "controle do regulador para LN 2 vaporizador ') aberta durante esses procedimentos.
- Antes de colocar o tecido congelado nos suportes planas-incorporação (isto é, antes de estabelecer a AFS), cortado um círculo fina a partir de uma folha de plástico transparente e colocá-lo no fundo do suporte, de modo a revestir o fundo de cada poço. Isso permite a remoção relativamente mais fácil dos blocos de amostras polimerizadas quando terminar.
NOTA: Anteriormente, foi utilizado um método alternativo para os titulares de incorporação planas, e empregando duplas cápsulas Reichert + gelatina (ver Petralia e Wenthold, 1999) <sup> 20. - Utilize a seguinte seqüência automática no AFS (usando a terminologia do instrumento): T1 = -90 ° C durante 32 horas, S1 = aumento de temperatura de 4 ° C / h (11,3 horas), T2 = -45 ° C durante 50 horas, S2 = aumento de temperatura de 5 ° C / h (9 h), T3 = 0 ° C durante 40 horas (total = 142,3 h). Pode levar 2-4 horas para colocar as amostras no AFS (a -90 ° C) antes de se iniciar a sequência temporizada.
- Mergulhe as secções congeladas em 1,5% acetato de uranila em metanol a -90 ° C durante> 32 horas no AFS. Coloque dois pedaços de tecidos (tipicamente) em cada um dos sete poços no suporte de alumínio do flat-incorporação (três encaixar no AFS).
- Colocar o tecido + fita para o acetato de uranilo / metanol nas cavidades e remover a fita depois, imediatamente antes do início de meio de inclusão (tais como Lowicryl HM20) infiltração, se é muito difícil de remover o tecido a partir da fita.
- Em seguida, aumentar a temperatura por passos para -45 ° C (+ 4 ° C por hora; na seqüência automática).
- Lave as amostras três vezes em metanol pré-arrefecido, usando uma pipeta de plástico de ponta fina para remover a solução de idade de cada titular flat-a incorporação, e em seguida, usando uma outra pipeta de plástico padrão para adicionar o metanol fresco pré-arrefecido.
- Em seguida, utilizando o mesmo método, infiltrar-se as amostras progressivamente com baixos resinas incorporação de temperatura, tais como a incorporação de meio (HM20 / metanol a 1: 1 e 2: 1, cada um durante 2 h, seguido de resina pura durante 2 horas e depois mudar as resinas e manter S / N).
- Mudar a resina novamente no dia seguinte, o ajuste do nível da resina para atingir apenas para a extremidade superior dos poços.
- Polimerizar as amostras (-45 ° C a 0 ° C em sequência automática; + 5 ° C por hora) com luz UV durante 40 horas.
- Em seguida, retire as amostras da AFS. Normalmente, blocos de amostras ainda mostrar alguma coloração rosa na cor. Coloque as amostras próximas da luz fluorescente no exaustor de fumos, químicos, à TA O / N ou mais até que apporelha completamente clara.
3. Postembedding EM immunogold Imunocitoqu�ica
NOTA: Postembedding imunocitoquímica é realizada como descrito 23,24,25.
- Corte 1 mm seções com ultramicrotome, seções mancha com toluidina azul 1%, e examiná-los para orientação seção; orientar o bloco de tecido para atingir o plano transversal de corte ideal.
- Cortar 70 cortes ultrafinos nm de espessura com ultramicrotome e recolhê-las on-revestidos Formvar carbono níquel caça-níqueis grades.
- Lavar grades uma vez em H2O destilada seguido por uma solução salina tamponada com Tris (TBS três vezes, tampão Tris 0,05 M, 0,7% de NaCl, pH 7,6) de lavagem.
- Incubar em grades 20 gotas ul de BSA a 5% em TBS durante 30 minutos, e, em seguida, em 20 gotas ul de uma mistura contendo de cabra anti-CTB (1: 3000) e um anticorpo para uma subunidade GluN2A NMDAR (anti-coelho 01:50 , GluN2B 01:30), ou um anti-coelho GluA2 / 3 (1:30)em TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN 3 O / N à temperatura ambiente.
- grelhas de lavagem em três gotas separadas (20 ul) de TBS (pH 7,6) durante 10, 10, e 20 min, seguidos pela TBS (pH 8,2) durante 5 min.
- Incubar durante 2 horas grades em gotas (20 ul) de uma mistura contendo IgG anti-coelho de burro (01:20) acoplado a partículas de 10 nm de ouro e IgG de burro anti-cabra (1:20) acoplados a partículas de ouro de 18 nm, em TBST (pH 8,2) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN 3.
- Lavar as grades em gotas 20 ul de TBS (pH 7,6) durante 5, 5, e 10 min, em seguida em água ultrapura e em seguida secá-los.
- Grades contracoloração com 5% de acetato de uranilo e citrato de chumbo a 0,3% em H2O destilada para 8 e 5 min sob condições de escuridão, respectivamente.
- Para experimentos de marcação tripla, incubar grelhas de O / N à temperatura ambiente com 20 gotas ul de uma mistura de CTB anti-cabra (1: 3000), anti-ratinho PSD-95 (1: 100), e anti-coelho GluN2A (1 : 50). Em seguida, incubar grades, durante 2 horas, em 20 gotas ul de uma mistura de IgG acoplado a 18, 10, e 5 nm de partículas de ouro em TBST (pH 8,2) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN 3. Mantenha os mesmos procedimentos que a dupla marcação para lavar e contracoloração entre e após incubação de anticorpos.
- Os controlos foram realizados na qual os anticorpos secundários foram aplicados isoladamente.
- Veja as grades em um EM e digitalizar imagens. Processar números finais no Adobe Photoshop 6.0 apenas para o brilho e contraste, se for necessário 24.
4. Quantificação
- Selecionar manualmente áreas da camada plexiforme interna (IPL), sem buracos ou rachaduras no 8,000X ampliação, em seguida, fotomontagem aleatoriamente toda a profundidade da IPL em 25,000X ampliação.
- Identificar dendrites RGC no cone duplas bipolares quando a) conter o sinal CTB transportado retrogradamente (grandes partículas de ouro), b) exibem bem definida membranas, fissuras, e densidades pós-sinápticos, c) conter pelo menos dois pequena parte do ouroicles dentro do PSD, ou mais do que uma pequena partícula de ouro ao longo da membrana de plasma extrasynaptic.
- Colete 45 - 55 RGC dendrites, com base nos critérios acima, para análise quantitativa.
- Medir os comprimentos da PSD e a membrana plasmática extrasynaptic de dendritos RGC individuais com o software ImageJ NIH. Contagem de partículas de ouro de 10 nm dentro da membrana, como a membrana associada, com base em uma espessura média de 7-9 nm para a membrana plasmática 26.
- Calcular a densidade da partícula, como o número de partículas de ouro por micrómetro linear (ouro / iM). Medir a distância entre o centro de cada uma das partículas de ouro e o meio da PSD (para localização sináptica) ou a borda do PSD (para localização extrasynaptic).
- Realizar a análise estatística pelo software. Use bicaudais testes t para comparação de médias. Concluímos significado quando P <0,05. Salvo indicação em contrário, os dados do Relatório como média ± SEM 18.
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Representative Results
Os resultados aqui apresentados demonstram contundentemente diferentes padrões de localização subsináptica de GluA 2/3 e NMDAR em dendrites RGC em retina de ratos, conforme descrito anteriormente 24,25. 77% das partículas de imunomarcação GluA 2/3 em perfis dendríticos RGC foram localizados dentro do PSD (Figura 1A), semelhante à maioria das sinapses centrais. No entanto, NMDAR foram localizados quer sinapticamente ou extrasynaptically. 83% das partículas de imunomarcação GluN2A foram localizados no PSD (Figura 1C, 2A, 2B), preferencialmente nas sinapses OFF e as partículas de ouro estavam mais concentrada no centro do PSD (Figura 2C). Em contraste, a grande maioria de rotulagem partículas para GluN2B (96%) estavam localizados fora do PSD (Figura 1B, 2A, 2B), distribuídas, principalmente ao longo da membrana de plasma extrasynaptic, com o pico de densidade de partícula, a 180 nm a partir da borda do PSD (Figura 2B). Em particular, GluN2B exibiu uma preferência para sinapses. Num subconjunto de experiências, a rotulagem simultânea de GluN2A, PSD-95 e CTB indicou que GluN2A e PSD-95 foram co-localizada na PSD de dendritos OFF RGC (Figura 1D), onde NR2A estava na membrana dendrítica enquanto PSD-95 era sob a membrana, o que sugere que eles são ancorados no PSD. Foi observada diferença significativa na densidade de ouro entre a membrana perisynaptic e membranas mitocondriais, sugerindo uma rotulagem específica no antigo (Figura 2D).
Figura 1. immunogold Labeling Mostrando Synaptic e Perisynaptic Localização de glutamato receptores na RGC dendrites Rotulado pela CTB. (A): dupla marcação immunogold de GluA2 / 3 (10 nm ouro) e CTB (18 nm de ouro). fitas pré-sinápticos indicado por setas. gol pequenapartículas d estão agrupados (seta) nos processos PSD de RGC. (B) a dupla marcação immunogold de GluN2B (10 nm ouro) e CTB (18 nm de ouro); pequenas partículas de ouro (seta) estão na membrana plasmática extrasynaptic. (C) a dupla marcação immunogold de GluN2A (10 nm ouro) e CTB (18 nm de ouro). Semelhante a GluA2 / 3, as pequenas partículas são agrupadas dentro do PSD. (D) rotulagem immunogold Triplo de GluN2A (5 nm de ouro), PSD-95 (10 nm ouro) e CTB (18 nm de ouro). GluN2A partículas de ouro pequenas (setas) e PSD-95 partículas de ouro grandes (setas) são co-localizada dentro da PSD na dendritos RGC CTB-positivas individuais. Detalhe: maior ampliação do PSD. Barra de escala: 0,1 uM (A = C = D, B). Estes são novos micrografias com base em dados publicados em Zhang e Diamond 24,25. Por favor clique aqui para viewa versão maior desta figura.
Figura 2. Comparação quantitativa de NMDAR Localização no RGC dendrites. (A) um histograma que mostra a distribuição de imuno tangencial para GluN2A (n = 53 perfis) e GluN2B (n = 56 perfis) dentro e fora do PSD. A região perisynaptic foi dividido em 60 caixas nm. (B) Um histograma que mostra a densidade de partículas de etiquetagem imunomarcação para GluN2A (n = 53 perfis) e GluN2B (n = 56 perfis). A região perisynaptic foi dividido em 180 nm lixeiras a partir da borda do PSD. (C) Um histograma que mostra a distribuição tangencial do número total de partículas de imunomarcação para GluN2A (n = 44 perfis) e GluN2B (n = 3 perfis) em todos os perfis com a rotulagem na PSD. (D) Comparação da densidade de partículas departículas de imunomarcação para GluN2B (n = 53 e 33 perfis) e GluN2A (n = 9 e 30) nas membranas perisynaptic membrana mitocondrial e, respectivamente, nos processos de RGC CTB-positivos. Estes histogramas são modificados a partir de histogramas publicados em Zhang e Diamond 24,25. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós descrevemos quatro técnicas para quantitativa pós-incorporação immunogold EM sucesso: 1) curta e fraca fixação, 2) freeze-substituição, 3) pós-incorporação coloração imuno, e 4) quantificação.
EM imuno permite a detecção de proteínas específicas em secções de tecido ultrafinas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pode ser directamente visualizada utilizando EM. Enquanto poderosa na detecção da localização subsináptica de um receptor de membrana, EM immunogold pode ser tecnicamente desafiadora e requer otimização rigorosa dos métodos de fixação e processamento de tecidos.
Para atingir um melhor equilíbrio entre a integridade da membrana e antigenicidade, testamos diferentes métodos de fixação e horários. Por exemplo, um protocolo de sucesso usado para postembedding EM NMDAR em sinapses centrais 19,20 falhou para detectar NMDAR imunorreactividade na retina. Este estudo utilizou a fixação suave e tempos de incubação curto paraevitar a redução da antigenicidade do receptor de NMDA, depois, fixação forte prolongada 16.
O método de congelamento e substituição foi desenvolvido pela primeira vez para a localização ultra-estrutural dos receptores de glutamato no início da década de 1990 27, e envolve baixa infiltração de temperatura e de polimerização in, uma resina hidrofóbico não polar, HM20 28, necessário para a rotulagem ideal postembedding immunogold. O método de congelação-substituição específico usado aqui foi desenvolvido para os receptores de glutamato rotulagem na cóclea 29 e optimizado para os receptores de glutamato em sinapses centrais 18,19,20,30, e que foi modificado adicionalmente nos últimos anos. A baixa temperatura de infiltração e a polimerização da resina ajuda a preservar a antigenicidade de moléculas lábeis ao calor e minimiza a extracção de lípidos e reacções químicas adversas entre a resina e tecido 19,31. Combinado com os métodos de fixação descrito acima, este método de congelação-p substituiçãoferece boa antigenicidade e preservação estrutural razoável.
A técnica de imuno postembedding usado aqui tem várias vantagens em comparação com o método preembedding imunoperoxidase. Embora o método de imunoperoxidase preembedding tem maior sensibilidade 15,16,17,19,20,21, a difusão do produto da reacção é inevitável, resultando na marcação não específica 26,32. Além disso, a reacção enzimática da peroxidase não é linear 21, tornando-o difícil de avaliar quantitativamente a localização precisa dos receptores subsináptica 18,21. O método postembedding imuno emprega um marcador não-difusível e executa a imunorreacção na superfície de tecido embebido em resina, que reduz artefactos difusíveis e permite maior 18,33,34 resolução espacial. As partículas de ouro pode ser directamente contados, além do mais, tornando possível estimar o número, a densidade e a variabilidade destes receptores na retina syn fitaabsides. Além disso, postembedding imuno permite a localização de vários receptores para ser simultaneamente analisada ao nível EM. Este protocolo tem sido empregada com sucesso na identificação de localização de outras proteínas de membrana (por ex., Os receptores de GABA e de potássio canais BK] [activados pelo cálcio) na haste de retina sinapses bipolares 35.
Vários fatores são cruciais para o sucesso deste protocolo. Em primeiro lugar, rápido e suave de fixação é o primeiro passo importante para a preservação da antigenicidade e estrutura fina. Em segundo lugar, o protocolo "pH-shift" para fixação é benéfico para a detecção óptima dos epítopos antigênicos e boa preservação do ultra-36. Em terceiro lugar, congelar-substituição preserva a antigenicidade dos receptores, mantendo ao mesmo tempo a estrutura fina razoável. Em quarto lugar, durante a coloração imuno, tampão TBST (com Triton X-100) é utilizado com a incubação do anticorpo, enquanto tampão TBS (sem Triton X-100) é usadapara a lavagem entre e depois da incubação dos anticorpos; isso pode minimizar alterações na estrutura fina. Em quinto lugar, durante a troca de soluções, as seções são mantidos molhados para reduzir artefatos causados por secagem do tecido.
Embora o protocolo de imuno postembedding descrito aqui fornece um método melhorado para a identificação de receptores de membrana na sinapse fita da retina, que não é tão sensível como preembedding métodos imuno-histoquímicos; mas o último não são uma boa opção, porque eles sofrem de especificidade relativamente menor e são menos passíveis de quantificação como mencionado acima. Nosso protocolo também compromete a estrutura fina, em certa medida, em comparação com o tecido mais fortemente fixo não preparado para imunomarcação. Com sorte, futuras inovações vai superar essas limitações.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos programas internos do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) e do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação (NIDCD), um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Agradecemos a instalação de NINDS EM e do núcleo NIDCD Advanced Imaging (código # ZIC DC 000081-03) para obter assistência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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