Abstract
تسعى العديد من الدراسات لتحديد ورسم خريطة لمناطق الدماغ تشارك في أنظمة فسيولوجية معينة. ج-فو-بروتو الجين الورمي، جين الفورية المبكرة، وأعرب في الخلايا العصبية في استجابة للمؤثرات المختلفة. المنتج البروتين يمكن أن يتم الكشف بسهولة مع تقنيات المناعى مما يؤدي إلى استخدام الكشف ج-مكتب الإحصاء الاتحادي في الخريطة مجموعات من الخلايا العصبية التي تعرض التغيرات في نشاطهم. في هذه المقالة، ركزنا على تحديد الدماغ العصبية السكان المعنيين في التكيف التنفس الصناعي لنقص الأكسجين أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم. وقد وصفت نهجين لتحديد السكان العصبية تشارك في الجسم الحي في الحيوانات والمجراة سابقا في الأعمال التحضيرية الدماغ deafferented. في الجسم الحي، تعرضت الحيوانات لخليط الغاز بفرط ثنائي أكسيد الكربون أو ميتة. خارج الحي، وsuperfused الاستعدادات deafferented مع نقص الأوكسجين أو بفرط ثنائي أكسيد الكربون السائل النخاعي الاصطناعي. في كلتا الحالتين، إما السيطرة في الحيوانات الحية أو البريدكان مسك س الجسم الحي الاستعدادات في ظل ظروف normoxic وnormocapnic. المقارنة بين هذين النهجين تسمح بتحديد أصل تفعيل أي الخلايا العصبية، الطرفية و / أو وسط. في الجسم الحي وخارج الحي، وقد تم جمع brainstems، ثابتة، وشرائح إلى أقسام. مرة واحدة وقد تم إعداد أقسام، وجاء كشف المناعى من البروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي من أجل تحديد الفئات الدماغ من خلايا تفعيلها من خلال التحفيز ميتة أو بفرط ثنائي أكسيد الكربون. احصي الخلايا المسمى في هياكل الجهاز التنفسي الدماغ. بالمقارنة مع حالة السيطرة، نقص الأكسجة أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم زيادة عدد ج-FOS الخلايا المسمى في عدة مواقع الدماغ المحددة التي التأسيسي للمسارات العصبية المعنية في التكيف من محرك الأقراص التنفسي المركزي الآن.
Introduction
تم التعرف على الجين مكتب الإحصاء الاتحادي ج- للمرة الأولى في بداية عام 1980 1،2 و تميزت منتجاتها في عام 1984 كما بروتين النووي لديه خصائص الجينات المنشط 3،4. وتشارك في آليات طويلة الأجل المرتبطة تحفيز الخلايا العصبية. في الواقع، والتغيرات في نشاط الخلايا العصبية تؤدي إلى رسول يشير الثانية الشلالات التي تحفز على التعبير عن الجينات في وقت مبكر ج-مكتب الإحصاء الاتحادي الفورية، وهو الحث على إنتاج عامل النسخ ج-مكتب الإحصاء الاتحادي. هذا الأخير يبدأ التعبير عن الجينات في وقت متأخر وبالتالي يشارك في الاستجابات التكيفية للجهاز العصبي إلى العديد من أنواع مختلفة من المحفزات 4. وهكذا، منذ نهاية عام 1980 5،6، وقد استخدمت ج-FOS كشف عن البروتين في كثير من الأحيان لدراسة تأثير العوامل الخارجية على النسخ الجيني في عام (4) وعلى نشاط الجهاز العصبي المركزي (CNS) لرسم خرائط من الممرات العصبية تشارك في فيزيولوجي مختلفةالظروف الله.
وقد تمت دراسة القاعدية التعبير ج منظمات المزارعين في مختلف الأنواع بما في ذلك الفئران، الفئران والقطط والقرود، والإنسان (4). وبالتالي، حركية التعبير عنها هو معروف جيدا نسبيا. تفعيل النسخ السريع (من 5 إلى 20 دقيقة) 7،8، وتراكم مرنا يصل كحد أقصى بين 30 و 45 دقيقة بعد بداية التحفيز 9 وينخفض مع نصف عمر قصير من 12 دقيقة. تخليق البروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي في أعقاب تراكم مرنا، ويمكن أن يتم الكشف من قبل المناعية من 20 إلى 90 دقيقة بعد التحفيز 6.
ويستخدم تحليل التعبير ج منظمات المزارعين كلاسيكيا في الدراسات المجراة لتحديد شبكة الجهاز التنفسي المركزية تشارك في الردود التهوية لنقص الأكسجة أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم 10-14. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام هذه الأداة أيضا في خارج الحي الاستعدادات الدماغ لاستكشاف التعديلات شبكة الجهاز التنفسي المركزية لنقص الأكسجين أو حypercapnia 15-18. في الواقع، هذه الاستعدادات تولد النشاط الإيقاعي استيعابهم الكلاسيكي إلى محرك الأقراص التنفسي المركزي 19. وبالتالي، فإن هذا النوع من التحضير لديه ميزة كونها deafferented تماما، وبالتالي، النتائج المتعلقة التعبير ج منظمات المزارعين تعكس سوى النتائج المترتبة على التحفيز المركزي دون أي تدخل من الهياكل الطرفية.
يمكن إجراء الكشف ج-FOS بنهج المناعى أو تألق نسيجي مناعي. مناعي غير المباشرة يتطلب استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد ج-FOS والأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد الأنواع التي كانت تنتج الأجسام المضادة الأولية. للتعرف على طريقة المناعى، ومترافق الأجسام المضادة الثانوية مع انزيم (البيروكسيديز، على سبيل المثال) التي تعمل على ركيزة (H 2 O 2 لالبيروكسيديز). تم تطوير هذا المنتج من رد الفعل الأنزيمية قبل مولد اللون (3.3 diaminobenzidine tetrahydrochloridه)، التي بقع عليها ويمكن ملاحظتها تحت المجهر الضوئي. يمكن تعزيز التفاعل باستخدام كبريتات النيكل الأمونيوم. هذه الأساليب تسمح للكشف الأصول الخلايا العصبية خلال التحديات الفسيولوجية المختلفة، وبالتالي تحديد و / أو رسم خرائط لمسارات الطرفية والمركزية تشارك في الاستجابات الفسيولوجية متتالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: كشف ج-FOS هو إجراء موحد يشمل عدة خطوات (الشكل 1). تم إجراء جميع التجارب على الفئران أو الفئران. تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة الأخلاقيات في تجربة الحيوان تشارلز داروين (CE5 / 2011/05)، يتم وفقا للمجتمعات الأوروبية توجيه المجلس من 22 سبتمبر 2010 (2010/63 / الاتحاد الأوروبي) لرعاية الحيوانات، والتي تتم وفقا مع القوانين الفرنسية لرعاية الحيوانات.
1. إعداد حلول
- إعداد العازلة الفوسفات 0.2 M الصوديوم: إضافة 6.24 غ ناه 2 ص 4 * 2H 2 O و22.56 ز نا 2 هبو 4 * H 2 O إلى 1 لتر من الماء المقطر مع التحريك.
- إعداد 4٪ لامتصاص العرق (منهاج العمل): إضافة 20 غراما من PFA إلى 150 مل من الماء المقطر. الحرارة الحل إلى 80 درجة مئوية مع التحريك. لمسح حل، وخفض الحرارة وإضافة 1 أو 2 قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم لمساعدة امتصاص العرق حل. كاملة إلى 250 ملمع الماء المقطر وإضافة 250 مل من 0.2 M الفوسفات العازلة (7.4 درجة الحموضة). تخزينها في 4 درجات مئوية. تأخذ الرعاية المناسبة عند استخدام هذه الكواشف. التعامل مع القفازات، معطف المختبر، ونظارات السلامة تحت غطاء الكيميائية.
ملاحظة: إعداد PFA 4٪ في اليوم قبل تروية دموية. تحديد حجم 4٪ PFA بوصفها وظيفة من العمر، وعدد وأنواع من الحيوانات. - يعد حل واق من البرد: في 250 مل من 0.2 M الفوسفات مخزنة المالحة، مزيج 5 غرام من البولي فينيل-pyrrolidone، 150 غرام من السكروز و 2.5 غرام من كلوريد الصوديوم. بعد حل كامل، إضافة 150 مل من جلايكول الإثيلين والتكيف مع 500 مل بالماء المقطر. تخزين حل واق من البرد في 4 درجات مئوية.
- تحضير 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS): إضافة 18 غرام من كلوريد الصوديوم إلى 1 لتر من الماء المقطر مع التحريك. بعد حل كامل، إضافة 1 L 0.2 M العازلة فوسفات الصوديوم.
- استعد الفوسفات مخزنة المالحة تستكمل مع 0.3٪ تريتون X100 (PBST): إضافة 3 مل من تريتون X100-997 مل من برنامج تلفزيوني.
- إعداد 0.05 M تريس العازلة (درجة الحموضة 7.6): إضافة 3.03 غرام من تريس، هيدروكلوريد و 0.70 غرام تريس قاعدة إلى 500 مل من الماء المقطر مع التحريك.
- إعداد 2٪ مصل الماعز في PBST: لوحة واحدة، وإعداد 30 مل من محلول. إضافة 600 ميكرولتر من مصل الماعز إلى 30 مل PBST وتخلط جيدا. إضافة 2.5 مل لكل بئر.
ملاحظة: مصل المستخدمة يجب أن تأتي من الأنواع المستخدمة لإنتاج الأجسام المضادة الثانوية - إعداد الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد بروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي (1: 4000، SC-52) في PBST مع ألبومين المصل البقري (0.25٪). لوحة واحدة، وإعداد 30 مل من محلول. إضافة 75 ملغ من ألبومين المصل البقري إلى 30 مل PBST وتخلط جيدا. ثم، إضافة 7.5 ميكرولتر من أرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد بروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي.
- إعداد الماعز المعقدة البيروكسيديز المضادة للأرنب الأجسام المضادة (1: 500) في PBST مع البقري ألبومين المصل (0.25٪). لوحة واحدة، وإعداد 30 مل من محلول. إضافة 75 ملغ من ألبومين المصل البقري إلى 30 مل PBST وتخلط جيدا. ثم، تضاف60 ميكرولتر من الماعز البيروكسيديز المضادة للأرنب الأجسام المضادة.
- إعداد أفيدين-البيوتين البيروكسيديز المعقدة (1: 250) في PBST (حل ABC). لوحة واحدة، وإعداد 30 مل من محلول. إضافة 120 ميكرولتر من كاشف A و 120 ميكرولتر من كاشف B إلى 30 مل PBST وتخلط جيدا.
ملاحظة: ABC الحل يجب أن يكون مستعدا على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام. - يعد حل الركيزة. مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد الحل على النحو التالي (لوحة واحدة): إضافة 20 ملغ من كبريتات الأمونيوم النيكل و 10 ملغ من tetrahydrochloride 3.3 diaminobenzidine إلى 50 مل تريس العازلة. تصفية وحماية من ضوء. إضافة 2.0 مل لكل بئر. في حل المتبقية (25 مل) إضافة 17 ميكرولتر من H 2 O 2 (H 2 O 2 حل 30٪ في H 2 O). إضافة 2.0 مل لكل بئر.
ملاحظة: يجب توخي الحذر عند استخدام هذه المناسبة الكواشف. التعامل مع قفازات ومعاطف المختبر.
2. ج-مكتب الإحصاء الاتحادي ايندوction ومعالجة الأنسجة في فيفو
ملاحظة: أجريت التجارب على الفئران (سبراغ داولي) أو الفئران (C57BL / 6).
- وضع الحيوانات في مربع محكم التهوية مع نقص الأوكسجين (O 2 8٪ متوازن N 2) أو بفرط ثنائي أكسيد الكربون (CO 2 4٪، O 2 21٪ متوازن N 2) خليط الغاز لمدة 2 ساعة (الشكل 2A).
- تخدير الحيوان مع حقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال (100 ملغ / كلغ). يروي transcardially الحيوان مع PFA 4٪ 20. امسكها بعناية واستخدام قفازات تحت غطاء الكيميائية.
- بعد نضح، تشريح الدماغ 20 وتزج به في 7 مل من 4٪ PFA في أنبوب 15 مل لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية. ثم إزالة الدماغ من منهاج العمل وتزج به تماما في حل واق من البرد. مخزن في -18 درجة مئوية (الشكل 3). التخلص من بقية جسم الحيوان من قبل السلطة الفلسطينية، تدوير النفايات المناسبةthway.
ملاحظة: Cryoprotection هو خطوة بين PFA تثبيت وتجميد. أنه يقلل من تكوين بلورات الثلج في الخلايا مع الحل الذي سيكون في شكل غير متبلور التجمد. يجب أن تكون مشربة العينات الثابتة في الحل واق من البرد (المعد في الخطوة 1.3) لا يقل عن 24 ساعة في 4 درجات مئوية. التعامل مع الرعاية وقفازات تحت غطاء الكيميائية.
3. ج فو تحريض والأنسجة المعالجة فيفو السابقين
وأجريت التجارب على الفئران حديثي الولادة أو الفئران فقط: مذكرة.
- عزل الجهاز العصبي المركزي كما وصفها Suzue 19. وضعه في غرفة تسجيل وsuperfuse بشكل مستمر مع الاصطناعي السائل الدماغي الشوكي بمعدل 7.5 مل / دقيقة عند 26 درجة مئوية 21 (ACSF: مم: 130.0 كلوريد الصوديوم، 5.4 بوكل، 0.8 CaCl 2، 1.0 MgCl 2، 26.0 NaHCO 3، 30.0 مد الجلوكوز، مشبعة O 2 ويتم تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 بالغاز مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2) (الشكل 2B).
- استبدال ACSF مع ACSF (نفس التركيب فقاعات مع 95٪ N 2 و 5٪ CO 2، ودرجة الحموضة 7.4) غير المؤكسج لنقص الأكسجة أو عن طريق ACSF المحمضة (معيار ACSF مع NaHCO 3 خفضت إلى 10.0 ملم، فقاعات مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2) لفرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم. تطبيق التحفيز لمدة 30 دقيقة (الشكل 2B).
- خارج الحي، وبعد فترة التدريب، ونقل الجهاز العصبي المركزي من الفئران حديثي الولادة أو الفئران في 2.5 مل من 4٪ PFA في أنبوب 2.5 مل لمدة 48 ساعة ومخزن في -18 درجة مئوية في حل واق من البرد لاستخدامها لاحقا (الشكل 3).
ملاحظة: خارج الحي، فإنه ليس من الضروري أن يروي الحيوانات. وتشير دراسة سابقة أن عينات صغيرة مقاسها أقل من 10 ملم في القطر يمكن ان تكون ثابتة عن طريق الانتشار البسيط 22. معدل نقلت الاختراق (المسافة، في ملم، لنشر تثبيتي في الأنسجة) لألدهيد هو 2 أو 3 مم / ساعة.4. جذع باجتزاء
ملاحظة: من هذه الخطوة إلى نهاية المطاف، فإن البروتوكول هو بدقة الشيء نفسه بالنسبة لفي الجسم الحي والحث خارج الحي.
- قبل التقطيع، ووضع شخص واحد إدراج بئر في لوحة 12-جيدا وإضافة 2.5 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر.
- جعل أقسام الاكليلية التسلسلية (40 ميكرون) من جذع الدماغ مع ناظم البرد وجمعها في لوحة ال 12 أيضا. لجذع الدماغ الكبار بأكمله، وجعل نحو 70 شرائح (الشكل 3).
ملاحظة: من الممكن لقسم الأنسجة من العديد من الحيوانات في نفس الوقت في لوحة واحدة.
5. إجراءات Immunohistological (الجدول 1)
ملاحظة: في جميع أنحاء الداخلي، تبقى المقاطع في إدراج جيدا.
- يوم 1 - الذاتية تدمير النشاط البيروكسيديز والحصار موقع ملزم غير محددة، والحضانة مع الأجسام المضادة الأولية (الشكل 4)
- غسلالأقسام لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M برنامج تلفزيوني في RT (2.5 مل لكل بئر). كرر 3 مرات.
- قمع النشاط البيروكسيداز الذاتية التي يحتضنها أقسام الاكليلية لمدة 30 دقيقة في RT مع بيروكسيد الهيدروجين H 2 O 2 و 3٪ في 0.1 م برنامج تلفزيوني (2.5 مل لكل بئر).
- غسل أقسام لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M برنامج تلفزيوني في RT (2.5 مل لكل بئر). كرر 3 مرات.
- منع موقع ملزم غير محدد من احتضان أقسام الاكليلية لمدة 1 ساعة على RT مع مصل الماعز (2٪) في PBST.
- احتضان أقسام الاكليلية لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع الضد الأرنب بولكلونل ضد بروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي (1: 4000، SC-52،) في PBST مع زلال المصل البقري (0.25٪) (2.5 مل لكل بئر).
- اليوم 3 - الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية وتطوير رد فعل اللون (الشكل 4)
- غسل أقسام لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 0.1 M في RT (2.5 مل لكل بئر). كرر 3 مرات.
- احتضانأقسام الاكليلية لمدة 1 ساعة على RT مع الماعز المعقدة البيروكسيديز المضادة للأرنب الأجسام المضادة (1: 500) في PBST مع زلال المصل البقري (0.25٪) (2.5 مل لكل بئر).
ملاحظة: محقق ويمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى التحقيق الفلورسنت في هذه المرحلة. في هذه الحالة، ووقف على البروتوكول في هذه المرحلة، ودراسة مباشرة باستخدام المجهر مضان. - غسل أقسام لمدة 10 دقيقة مع PBST في RT (2.5 مل لكل بئر). كرر 3 مرات.
- احتضان أقسام الاكليلية لمدة 1 ساعة مع أفيدين-البيوتين البيروكسيديز المعقدة (1: 250) في PBST (2.5 مل لكل بئر).
- غسل أقسام لمدة 10 دقيقة مع PBST في RT (2.5 مل لكل بئر). كرر 2 مرات.
- غسل أقسام لمدة 10 دقيقة مع 0.05 M تريس العازلة في RT (2.5 مل لكل بئر). كرر 2 مرات.
- احتضان أقسام الاكليلية مع 0.02٪ tetrahydrochloride 3.3 diaminobenzidine، 0.04٪ كبريتات النيكل الأمونيوم و 0.01٪ بيروكسيد الهيدروجين في 0.05 M تريس العازلة (درجة الحموضة 7.6) لتي RT (2.0 مل لكل بئر). في حل المتبقية (25 مل) إضافة 17 ميكرولتر H 2 O 2 (H 2 O 2 حل 30٪ في H 2 O) (2.0 مل لكل بئر).
ملاحظة: المحقق يجب تحديد الأوقات تنمية تحت المجهر الضوئي. ومع ذلك، من 5 إلى 10 دقيقة وتقدم كثافة تلطيخ جيدة. - عندما تلطيخ كثافة هو الأمثل (للرقابة بموجب المجهر الضوئي، انظر الشكل 5) والشكل (6)، والتوقف عن رد الفعل من قبل غسل أقسام لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M برنامج تلفزيوني في RT (2.5 مل لكل بئر). تكرار 4 مرات. ثم، وغسل المقاطع مع الماء المقطر.
- أخذ العينات تركيب (امسكها بعناية وقفازات تحت غطاء الكيميائية)
- أقسام جبل متسلسل على الشرائح والهواء الجاف. لهذا، موزعة بعناية المقاطع في ترتيب rostro-الذيلية مع فرش على الشرائح. تسمية بوضوح الشرائح وفقا للعينات.
- يذوى مع الله المطلقcohol: تزج الشرائح لمدة 30 ثانية في RT في حمام الكحول المطلق. كرر مرتين.
- واضح مع زيلين: تزج الشرائح في حمام الزيلين لمدة 3 دقائق على RT. كرر مرتين.
- ساترة الشرائح مع تصاعد المتوسطة. لهذا، تطبيق 5 قطرات من تصاعد المتوسطة على الشريحة ثم قم بتطبيق الغطاء الزجاجي من خلال طرد فقاعات الهواء. الهواء الجاف لمدة 48 ساعة.
6. البيانات والتحليل الإحصائي
- دراسة أقسام تحت المجهر الضوئي. بصريا عد الخلايا العصبية FLI في تضخم عالية (200X) باستخدام المعالم القياسية 23،24. يتم ترجمة نقطي الشكل تلطيخ ج-فو في نوى الخلايا العصبية.
- لكل مجال من مجالات تحليلها، إحصاء عدد الخلايا ج FOS إيجابية في قسم ومقارنة عدد متوسط بين السيطرة وحفز الظروف. اعتمادا على الحياة الطبيعية من البيانات، استخدام اختبار ر الطالب أونبايريد أو اختبار مان ويتني. واعتبرت الاختلافات كبيرة إذا P0؛ 0.05. رسم توزيع الخلايا العصبية FLI على نمط (التكبير 100X) باستخدام أنبوب الرسم تعلق على المجهر وتصويرها بواسطة كاميرا رقمية (الشكل 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كشف ج-FOS هو أداة مفيدة تسمح جماعات تحديد الخلايا تفعيلها في ظل ظروف معينة مثل نقص الأكسجين وفرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم في الجسم الحي (الشكل 2A) أو في الحالات التي تحاكي هذه الظروف خارج الجسم الحي (الشكل 2B). في الجسم الحي، الأطفال حديثي الولادة، والشباب وضعت، أو القوارض الكبار في مربع محكم الذي يتجدد البيئة الغازية باستمرار من خلال مزيج الغاز مع تركيبة محددة بدقة ل30-180 دقيقة 13،25،26 (الشكل 2A). كما أن أعمال التحفيز على الجسم كله، يمكن أن تغير ذات الصلة في ج-FOS تعكس كلا السبيلين المركزية والطرفية تفعيلها. خارج الحي، وضعت الاستعدادات deafferented التي تحتوي على النخاع المستطيل والحبل الشوكي في غرفة superfused مستمر مع ACSF مع مستويات مختلفة من O 2 أو الرقم الهيدروجيني من أجل نموذج ميتة أو بفرط ثنائي أكسيد الكربون الشروط (
تم إصلاح الجهاز العصبي المركزي مع PFA، إما عن طريق نضح عن طريق الدورة الدموية في الجسم الحي، أو عن طريق الغمر خارج الجسم الحي (الشكل 3). ونتيجة لهذا الاختلاف، ونشر تثبيتي أطول خارج الجسم الحي من في الجسم الحي. وهكذا، فإن إشارة ج-مكتب الإحصاء الاتحادي قد تتأثر، ولا سيما في البنى العميقة. ومع ذلك، لأنه يتم تنفيذ تحليل ج-FOS دائما في المنهج المقارن بين السيطرة وحفز في الحيوانات الحية أو خارج الجسم الحي الاستعدادات، هذا الاختلاف لن تتداخل مع نتائج من مقارنة صارمة لمراقبة وتحفيز البيانات. بعد ذلك، تم cryoprotected الجهاز العصبي المركزي، مقطوع، وتعمل في مجال الدردشةالإجراء munohistochemical (الشكل 3، الشكل 4). في هذه الطريقة، وقد تم تحديد بعض المناطق الدماغ الجهاز التنفسي في الجسم الحي كما تعديل أنشطتها تحت ميتة أو بفرط ثنائي أكسيد الكربون التحديات، بما في ذلك نواة retrotrapezoid (RTN)، وهو موقع مركزي الرئيسي للCO 2 استقبال كيميائي 10،13،28،29، و النخاع بطناني (VLM)، الذي يحتوي على الشهيق إيقاع مولد 13، وصواري وأجزاء المتوسطة لالمفردة نواة السبيل (ج / mNTS)، والتي هي مناطق الإسقاط من الهيئات السباتي إدخال 13،25،26،30 (الشكل 5 )، ونواة الرفاء النخاعية 12،13.
خارج الحي، في ظروف deafferented، وقد وصفت الخلايا العصبية في RTN وVLM لتغيير بهم ج-FOS مناعية في ظل ظروف انخفاض يا 16-18 فبراير. ج-FOS دياحلماية يمكن أيضا جنبا إلى جنب مع المكتشفة المناعى أخرى لتوصيف النمط الظاهري للخلايا تنشيط 14،31
الشكل 1. تصميم دراسة لاستخدام ج-FOS الكشف لخريطة الهياكل العصبية تشارك في التكيف الجهاز التنفسي إلى نقص الأكسجة أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم. الخطوات بالتسلسل الزمني لتقنية الكشف ج-مكتب الإحصاء الاتحادي في الجهاز العصبي المركزي. الجهاز العصبي المركزي: الجهاز العصبي المركزي. IHC: المناعية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. C-FOS الاستقراء. (أ) في الجسم الحي بروتوكول الاستقراء. وضعت حيوان في ج المحكمهامبر ويتعرض إما الهواء (21٪ O 2 و 79٪ N 2)، بفرط ثنائي أكسيد الكربون (21٪ O 2. 4٪ CO 2، 75٪ N 2)، أو نقص الأوكسجين (10٪ O 2 و 90٪ N 2) الغاز الخليط لمدة 2 ساعة. (B) فيفو السابقين بروتوكول الاستقراء. وكان تشريح الجهاز العصبي المركزي الخروج من القوارض حديثي الولادة الذين تتراوح أعمارهم بين 0-4 أيام. تم عزل النخاع المستطيل والحبل الشوكي تحت التكبير للحصول على الاستعدادات. تم وضعها في غرفة مع السطح البطني التي تواجه التصاعدي، superfused مع ACSF (7.4 درجة الحموضة) في 26 ± 1 درجة مئوية. تم إجراء نمذجة التحفيز ميتة في الجسم الحي عن طريق خفض جزء من O 2 في ACSF التي ظهرت على السطح خليط الغاز عوز الأكسجين التي تحتوي على 95٪ N 2 و 5٪ CO 2. نماذج التحفيز بفرط ثنائي أكسيد الكربون في الجسم الحي أجريت باستخدام ACSF الحمضية التي تختلف من ACSF العادي من حيث NaHCO 3 تركيز (النقص). يتشبع ACSF الحمضية مع O 2 وadjuSTED لدرجة الحموضة 7.23 كتبها محتدما مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. تم تطبيق كل حالة التحفيز لمدة 30 دقيقة. ACSF: الاصطناعي السائل النخاعي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. العصبي المركزي أخذ العينات النظام. في الجسم الحي، والجهاز العصبي المركزي والتي تم الحصول عليها عن طريق تشريح بعد عملية تثبيتي باستخدام 4٪ امتصاص العرق perfused عبر الأوعية الدموية. خارج الحي، والجهاز العصبي المركزي مغمورة مباشرة في 4٪ امتصاص العرق بعد تشريح. وفي وقت لاحق، تم cryoprotected الجهاز العصبي المركزي عن طريق الغمر في محلول واق من البرد وشرائح إلى 40 ميكرون أقسام الاكليلية سميكة باستخدام ناظم البرد. وضعت المقاطع rostro الذيلية من النخاع في لوحة ال 12 أيضا تحتوي على برنامج تلفزيوني قبل احتسابه إجراءات المناعى. الجهاز العصبي المركزي: الجهاز العصبي المركزي. برنامج تلفزيوني: الفوسفات مخزنة المالحة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. إجراءات المناعية غير المباشرة. حضنت المقاطع الأولى مع أرنب الأجسام المضادة الأولية بولكلونل ضد بروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي. بعد ذلك، انهم عوملوا مع الماعز المعقدة البيروكسيديز المضادة للأرنب الضد الثانوية ضد الأجسام المضادة الأولية. وبعد هذه الحضانة، تم علاج المقاطع مع مجمع أفيدين-البيوتين-البيروكسيد، الذي يربط بإحكام إلى الضد الثانوية لتضخيم إشارة. والواقع أن مجمع يحتوي على العديد من الجزيئات البيروكسيديز مما يؤدي إلى كثافة تلطيخ عالية. وأخيرا، كانت ملطخة المقاطع باستخدام محلول 3.3 diamintetrahydrochloride obenzidine وكبريتات النيكل الأمونيوم، التي تنتج راسب الرمادي الداكن في وجود الإنزيم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الخلايا العصبية ج-FOS إيجابية على أجزاء من النخاع المستطيل في السيطرة على الفئران والجرذان التي قدمت إلى نقص الأكسجين في الجسم الحي. (A) رسم لجزء من النخاع المستطيل مقتبس من باكينوس وفرانكلين 24 (Bregma -7، 48 ملم ). المنطقة المنقطة delimitates الأجزاء صواري والمتوسطة لالمفردة نواة السبيل ج / mNTS. ويوضح المربع الهياكل يتضح من photomicrographs (B1 و B2). (ب) Photomiأداء crographs (X100) في ج / mNTS مستوى في normoxia (B1. السيطرة، والإطار الأسود) أو تحت نقص الأكسجة (B2. إطار أزرق). السهام السوداء تظهر الخلايا ج FOS إيجابية. (ج) رسم بياني يبين متوسط عدد الخلايا ج-FOS إيجابية في القسم في ج / مستوى mNTS في normoxia (شريط أسود) أو تحت نقص الأكسجة (الشريط الأزرق). يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SD. * يشير إلى وجود فرق كبير بين normoxia ونقص الأكسجة القيم - اختبار ر مزاوج الطالب. *** ع <0.001. CC: القناة المركزية للحبل الشوكي. ج / mNTS: أجزاء صواري والمتوسطة لالمفردة نواة السبيل الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. إجراء Immunohistological. الخطوات بالتسلسل الزمني للCFالإجراء نظام التشغيل. أب-I، الأجسام المضادة الأولية. أب-II، الأجسام المضادة الثانوية؛ BSA، الأبقار مصل الزلال. DAB، tetrahydrochloride 3.3 diaminobenzidine. ني، كبريتات الأمونيوم النيكل. برنامج تلفزيوني 0.1 M و 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (7.4 درجة الحموضة)؛ مخزنة المالحة الفوسفات PBST، 0.1 M تستكمل مع 0.3٪ تريتون X-100. مصل، مصل من الأنواع المستخدمة لإنتاج الأجسام المضادة الثانوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-مكتب الإحصاء الاتحادي هو جين الفورية المبكرة، والكشف عن منتجاتها، وبروتين ج-FOS، يستخدم تقليديا لتحديد السكان العصبية المعنية في ردود الجهاز التنفسي محددة في الجسم الحي 11،13،25،28 وخارج الجسم الحي 16-18، 27،32،33.
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
كن حذرا خلال خطوة نضح. الحل PFA 4٪ يجب أن يكون مستعدا بشكل جيد ويجب أن تكون الخطوات التثبيت وبعد التثبيت طويلة بما فيه الكفاية للحصول على تشريح الأمثل وتلطيخ. وعلاوة على ذلك، فإن الوحي هو أهم خطوة من هذا الإجراء؛ يجب السيطرة على شدة تلطيخ لتجنب الضوضاء في الخلفية.
مزايا تقنية وأهمية فيما يتعلق بأساليب الحالية
على الرغم من أن بعض الخلايا العصبية لا يبدو للتعبير ج فو جين 5، وهذا ليوقد ثبت ثود أن تكون مفيدة لتحديد المسارات العصبية تفعيلها، على سبيل المثال في التكيف مع إيقاع التنفس أثناء التحديات الكيميائية. مقارنة الجينات في وقت مبكر المباشرة الأخرى، ج-مكتب الإحصاء الاتحادي لديها التعبير منخفضة في ظل غياب التحفيز، مما يسهل تحديد مقدار نشاط الخلايا العصبية في ظل الوضع اختبار 6.
كشف-ج منظمات المزارعين هي تقنية الخلوية التي تشير إلى التغيرات العالمية في النشاط من أجل تحليل السكان العصبية العاملة في مجال الاستجابة للعديد من المحفزات. مقارنة مع تحليل نشاط الخلايا العصبية باستخدام نهج الكهربية، والتي معظم المخاوف الوقت سوى عدد قليل من الخلايا في منطقة الدماغ محددة، يسمح الكشف ج-FOS واحد على تقدير التغيرات في النشاط في عدد كبير من الخلايا وبالتالي إلى تحديد نشطة مناطق في الجهاز العصبي المركزي ككل. كشف C-FOS متوافق بسهولة مع الحيوانات غير المقيد ومستيقظا، وليس هذا هو الحال خلال تسجيل نشاط الخلايا العصبية التي كتبها إلكترونياتophysiology. هذه هي ميزة لأنها تتجنب التوتر وتدخل التخدير مع النتائج التي تم الحصول عليها.
فيفو السابقين، استخدمنا فترة 30 دقيقة من التحفيز. سبق ان عرضه أن هذا التحفيز هو كافية لإحداث تغييرات في التعبير عن ج منظمات المزارعين على مستوى الخلايا العصبية 34-36. خمس دقائق من التحفيز كافية لإحداث تغييرات في التعبير عن ج منظمات المزارعين، والتي لوحظ بعد فترة كامنة من 15 إلى 20 دقيقة 37. ترتبط الزيادات ذات الصلة في التعبير عن ج منظمات المزارعين للتغيرات في مكان آخر مع الأخذ خلال 10 دقيقة الأولى من التحفيز.
القيود المفروضة على تقنية
بعد التحفيز، لا بد من تأخير قبل تراكم ج-مكتب الإحصاء الاتحادي في النواة. هذا التأخير حوالي 30 دقيقة يتوافق مع مرنا وتخليق البروتين. تعارض الفورية للنتائج التي قد تكون obta هذا البندINED عن طريق تسجيل نشاط الخلايا العصبية مع الكهربية. هذا يمكن أن يسبب فقدان المعلومات حول التغيرات السريعة في نشاط الخلايا العصبية بعد حافزا محددة ومؤقتة.
كما بروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي قد يكون له نصف عمر 90 و 100 دقيقة 4، التعبير عنها يمكن أن تتأثر العمليات الجراحية أو الإجهاد المرتبطة التلاعب في الحيوانات، عائقا لها، أو تغيرات في بيئتها. وبالتالي، فمن الضروري للحد من التلاعب التي يمكن أن تحدث تغييرات في نشاط الخلايا العصبية لا علاقة لحافز دراستها ولأداء عينات الأنسجة مباشرة بعد نهاية التحفيز الفسيولوجية.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتقنية
في هذا البروتوكول، استخدمت خطوة الوحي حل الواردة tetrahydrochloride 3.3 diaminobenzidine، كبريتات الأمونيوم النيكل، وبيروكسيد الهيدروجين، ولكن مجموعات تجارية لبيروكسيداز يمكن آلحتى أن تستخدم لهذه الخطوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
