Abstract
Muchos estudios tratan de identificar y mapear las regiones del cerebro implicadas en las regulaciones fisiológicas específicas. Los c-fos proto-oncogén, un gen temprano inmediato, se expresa en neuronas en respuesta a diversos estímulos. El producto de proteína se puede detectar fácilmente con técnicas inmunohistoquímicas que conducen a la utilización de la detección de c-FOS para mapear grupos de neuronas que muestran cambios en su actividad. En este artículo, nos hemos centrado en la identificación de poblaciones neuronales del tronco cerebral implicados en la adaptación ventilatoria a la hipoxia o hipercapnia. Se describieron dos enfoques para identificar poblaciones neuronales implicadas en vivo en animales y ex vivo en las preparaciones del tronco cerebral deafferented. En vivo, los animales fueron expuestos a mezclas de gases con hipercapnia o hipoxia. Ex vivo, preparaciones deafferented fueron perfundidas con hipoxia o hipercapnia líquido cefalorraquídeo artificial. En ambos casos, ya sea de control o en los animales in vivo ex preparaciones in vivo se mantuvieron en condiciones de normoxia y normocápnicos. La comparación de estos dos enfoques permite la determinación del origen de la activación es decir, neuronal, periférico y / o central. In vivo y ex vivo, se recogieron brainstems, se fijaron, y cortados en secciones. Una vez que se prepararon secciones, la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS se hizo con el fin de identificar los grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos hipóxicos o hipercapnia. Las células marcadas se contaron en estructuras respiratorias del tronco cerebral. En comparación con la condición de control, la hipoxia o hipercapnia aumentado el número de células marcadas c-fos en varios sitios del tronco cerebral específicas que son, pues, constitutiva de las vías neuronales implicados en la adaptación de la unidad central de la respiración.
Introduction
El gen c-fos se identificó por primera vez a principios de 1980 1,2 y su producto se caracterizó en 1984 como una proteína nuclear que tiene propiedades de gen activador de 3,4. Participa en los mecanismos a largo plazo asociados con la estimulación de las neuronas. De hecho, los cambios en la actividad neuronal conducen a segundo mensajero de señalización cascadas que inducen la expresión del gen temprano inmediato c-fos, que induce la producción del factor de transcripción c-FOS. Este último inicia la expresión de los genes tardíos y por lo tanto participa en las respuestas de adaptación del sistema nervioso a muchos tipos diferentes de estímulos 4. Por lo tanto, desde el final de 1980 5,6, detección de la proteína c-FOS se ha utilizado con frecuencia para estudiar los efectos de factores exógenos sobre la transcripción de genes en general 4 y sobre la actividad del sistema nervioso central (CNS) para trazar las vías neuronales involucrados en diferentes fisiológicacondiciones al.
La expresión basal c-fos se ha estudiado en diversas especies, incluyendo ratones, rata, gato, mono, y humano 4. De este modo, la cinética de su expresión es relativamente bien conocidos. La activación de la transcripción es rápida (5-20 min) 7,8, y la acumulación de ARNm alcanza un máximo entre 30 y 45 min después del comienzo de la estimulación 9 y disminuye con una corta vida media de 12 min. La síntesis de la proteína c-FOS sigue la acumulación de ARNm y se pudo detectar mediante inmunohistoquímica en 20 a 90 minutos después de la estimulación 6.
Análisis de la expresión de c-fos se utiliza clásicamente en estudios in vivo para identificar la red central de la respiración que participan en las respuestas ventilatorias a la hipoxia o hipercapnia 10-14. Más recientemente, esta herramienta también se utilizó en las preparaciones del tronco cerebral ex vivo para explorar adaptaciones de red respiratorias centrales a la hipoxia o hypercapnia 15-18. De hecho, estas preparaciones generan una actividad rítmica clásica asimilada a la unidad central de la respiración 19. Por lo tanto, este tipo de preparación tiene la ventaja de ser completamente deafferented, y por lo tanto, los resultados con respecto a la expresión de c-fos sólo reflejan las consecuencias de una estimulación central sin ninguna intervención de las estructuras periféricas.
La detección c-FOS podría hacerse por métodos inmunohistoquímicos o immunohistofluorescence. inmunodetección indirecta requiere el uso de un anticuerpo primario contra c-FOS y un anticuerpo secundario dirigido contra la especie en la que se produjo el anticuerpo primario. Para el método de inmunohistoquímica, el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima (peroxidasa, por ejemplo) que actúa sobre un sustrato (H 2 O 2 para la peroxidasa). El producto de la reacción enzimática se desarrolla por un cromógeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobencidinae), que tiñe y se puede observar en el microscopio de luz. La reacción podría ser reforzado con sulfato de amonio níquel. Estos métodos permiten la detección de sustancias activas neuronas durante diferentes retos fisiológicos y, por tanto, la identificación y / o la cartografía de las vías periféricas y centrales que participan en las respuestas fisiológicas consecutivos.
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Protocol
Nota: La detección de c-fos es un procedimiento normalizado que implica varios pasos (Figura 1). Todos los experimentos se realizaron en ratas o ratones. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en el experimento con animales Charles Darwin (ce5 / 2011/05), realizado de conformidad con la Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 22 de septiembre, 2010 (2010/63 / UE) para el cuidado de los animales, y realizarse de conformidad con las leyes francesas para el cuidado de animales.
1. Preparación de soluciones
- Preparar tampón de fosfato de sodio 0,2 M: añadir 6,24 g de NaH 2 PO 4 * 2 H 2 O y 22,56 g de Na 2 HPO 4 * H2O a 1 l de agua destilada mientras se agita.
- Preparar 4% de paraformaldehído (PFA): se añaden 20 g de PFA a 150 ml de agua destilada. Calentar la solución a 80 ° C mientras se agitaba. Para borrar la solución, reduzca el fuego y añadir 1 ó 2 gotas de NaOH 1 N para ayudar al paraformaldehído se disuelve. Completa a 250 mlcon agua destilada y añadir 250 ml de tampón fosfato 0,2 M (pH 7,4). Almacenar a 4 ° C. Tome el cuidado apropiado cuando se usan estos reactivos. Manipular con guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad a una campana química.
Nota: Preparar PFA al 4% en el día antes de que las perfusiones. Determinar el volumen de 4% PFA como una función de la edad, el número y especies de animales. - Preparar la solución de crioprotector: En 250 ml de solución salina tamponada con fosfato 0,2 M, mezclar 5 g de polivinilpirrolidona, 150 g de sacarosa y 2,5 g de cloruro de sodio. Después de la disolución completa, añadir 150 ml de etilenglicol y ajustar a 500 ml con agua destilada. Almacenar la solución crioprotectora a 4 ° C.
- Preparar solución salina 0,1 M tamponada con fosfato (PBS): añadir 18 g de NaCl a agua destilada 1 L mientras se agita. Después de la disolución completa, añadir 1 L 0,2 M de tampón de fosfato de sodio.
- Preparar Phosphate Buffered Saline suplementado con 0,3% de Triton X100 (PBST): Añadir 3 ml de Triton X100 a 997 ml de PBS.
- Preparar 0,05 M tampón Tris (pH 7,6): añadir 3,03 g de Tris-hidrocloruro y 0,70 g de Tris-base a 500 ml de agua destilada mientras se agitaba.
- Preparar un 2% de suero de cabra en PBST: para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 600 l de suero de cabra al 30 ml de PBST y mezclar bien. Añadir 2,5 ml por pocillo.
Nota: El suero utilizado debe provenir de especies utilizadas para la producción de anticuerpo secundario - Preparar anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-FOS (1: 4000, SC-52) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%). Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 75 mg de albúmina de suero bovino a 30 ml PBST y mezclar bien. A continuación, añadir 7,5 l de anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-Fos.
- Preparar anticuerpo de cabra biotinilado anti-conejo (1: 500) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%). Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 75 mg de albúmina de suero bovino a 30 ml PBST y mezclar bien. Luego añade60 l de anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado.
- Preparar avidina-biotina-peroxidasa (1: 250) en (solución ABC) PBST. Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 120 l de reactivo A y 120 l de reactivo B y 30 ml de PBST y mezclar bien.
Nota: La solución de ABC se debe preparar al menos 30 minutos antes de su uso. - Prepare la solución de sustrato. Inmediatamente antes de su uso, preparar la solución de la siguiente manera (para una placa): añadir 20 mg de sulfato de amonio níquel y 10 mg de tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina a 50 ml de tampón Tris. Filtrar y protegerlo de la luz. Añadir 2,0 ml por pocillo. En la solución restante (25 ml) añadir 17 l de H 2 O 2 (H 2 O 2 solución al 30% en H2O). Añadir 2,0 ml por pocillo.
Nota: El cuidado apropiado debe tener cuidado al utilizar estos reactivos. Manipular con guantes y batas de laboratorio.
2. c-fos Inducción y procesamiento de tejidos in vivo
Nota: Los experimentos se realizaron en ratas (Sprague Dawley) o ratones (C57BL / 6).
- Colocar los animales en una caja hermética ventilado con un hipóxica (O 2 8% N equilibrado 2) o hipercápnica (CO 2 4%, O 2 21% N equilibrado 2) mezcla de gas durante 2 horas (Figura 2A).
- Anestesiar al animal con inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg). Perfundir el transcardially animal con PFA al 4% 20. Manipular con guantes de uso y cuidado a una campana química.
- Después de la perfusión, diseccionar el cerebro 20 y sumergirlo en 7 ml de PFA al 4% en un tubo de 15 ml durante 48 horas a 4 ° C. A continuación, retire el cerebro de la PFA y sumergirse por completo en la solución de crioprotector. Almacenar a -18 ° C (Figura 3). Desechar el resto del cuerpo del animal por el PA de residuos de procesamiento apropiadoThway.
Nota: crioprotección es un paso entre la fijación de PFA y la congelación. Se reduce la formación de cristales de hielo en las células con una solución cuya congelación será en forma amorfa. Las muestras fijas deben ser impregnadas en la solución crioprotectora (preparado en la etapa 1.3) durante al menos 24 horas a 4 ° C. Manipular con cuidado y guantes bajo el capó química.
3. inducción de c-fos y Tejidos de procesamiento Ex Vivo
Nota: Los experimentos se realizaron en ratas recién nacidas o ratones solamente.
- Aislar el SNC como se describe por Suzue 19. Colocar en una cámara de registro y superfuse continuamente con fluido cerebroespinal artificial a una velocidad de 7,5 ml / min a 26 ° C 21 (LCRa: en mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 26,0 NaHCO 3, 30,0 D-glucosa; saturada con O 2 y se ajustó a pH 7,4 por gaseamiento con 95% O 2 y 5% De CO 2) (Figura 2B).
- Sustituir el LCRa con un LCRa (misma composición burbujeado con 95% N 2 y 5% de CO 2, pH 7,4) desoxigenada por hipoxia o por un LCRa acidificada (estándar LCRa con NaHCO3 reducido a 10,0 mM, burbujeado con 95% de O 2 y 5% de CO 2) para la hipercapnia. Aplicar la estimulación de 30 min (Figura 2B).
- Ex vivo, después de que el período de inducción, transfiera el SNC de ratones o ratas recién nacidas en 2,5 ml de PFA al 4% en un tubo de 2,5 ml durante 48 horas y se almacena a -18 ° C en una solución crioprotectora para su uso posterior (Figura 3).
Nota: Ex vivo, no es necesario para perfundir los animales. Un estudio anterior sugiere que las pequeñas muestras que miden menos de 10 mm de diámetro puede ser fijado por simple difusión 22. Una tasa de cotización de penetración (distancia, en mm, para la difusión fijador en el tejido) para aldehído es 2 o 3 mm / hr.4. Tallo Cerebral Seccionamiento
Nota: A partir de este paso a la final, el protocolo es estrictamente el mismo para in vivo y ex vivo inducciones.
- Antes de cortar, coloque un individuo bien insertar en una placa de 12 pocillos y añadir 2,5 ml de PBS en cada pocillo.
- Hacer secciones coronales seriadas (40 micras) del tronco cerebral con un criostato y recogerlas en la placa de 12 pocillos. Para todo el tronco cerebral de adultos, que cerca de 70 rebanadas (Figura 3).
Nota: Es posible sección de tejido de varios animales en paralelo en un plato.
5. Procedimientos inmunohistológicos (Tabla 1)
Nota: Durante todo el procedimiento, las secciones se mantienen en los insertos así.
- Día 1 - destrucción endógena actividad de la peroxidasa, no específica bloqueo sitio de unión, y la incubación con el anticuerpo primario (Figura 4)
- lavarlas secciones durante 10 minutos con 0,1 M PBS a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
- Suprimir la actividad peroxidasa endógena por incubación de las secciones coronales de 30 min a TA con peróxido de hidrógeno H 2 O 2, 3% en PBS 0,1 M (2,5 ml por pocillo).
- Lavar las secciones durante 10 minutos con 0,1 M PBS a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
- Bloquear el sitio de unión no específica mediante la incubación de las secciones coronales de 1 hr a RT con suero de cabra (2%) en PBST.
- Incubar las secciones coronales de 48 horas a 4 ° C con un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-FOS (1: 4000, sc-52,) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%) (2,5 ml por pocillo).
- Día 3 - incubación con el anticuerpo y el desarrollo de una reacción de color secundaria (Figura 4)
- Lavar las secciones durante 10 minutos con PBS 0,1 M a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
- incubar lasecciones coronales de 1 hora a TA con un anticuerpo biotinilado de cabra anti-conejo (1: 500) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%) (2,5 ml por pocillo).
Nota: El investigador también puede utilizar un anticuerpo secundario acoplado a una sonda fluorescente en esta etapa. En este caso, detenga el protocolo en esta etapa y examinar directamente usando un microscopio de fluorescencia. - Lavar las secciones durante 10 min con PBST a TA (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
- Incubar las secciones coronales de 1 hr con una avidina-biotina-peroxidasa (1: 250) en PBST (2,5 ml por pocillo).
- Lavar las secciones durante 10 min con PBST a TA (2,5 ml por pocillo). Repetir 2 veces.
- Lavar las secciones durante 10 min con 0,05 M Tris-tampón a RT (2,5 ml por pocillo). Repetir 2 veces.
- Incubar las secciones coronales con 0,02% tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina, sulfato de amonio níquel 0,04% y peróxido de hidrógeno 0,01% en M tampón Tris 0,05 (pH 7,6) unat RT (2,0 ml por pocillo). En la solución restante (25 ml) añadir 17 l de H 2 O 2 (H 2 O 2 solución al 30% en H2O) (2,0 ml por pocillo).
Nota: El investigador debe determinar los tiempos de desarrollo bajo microscopio de luz. Sin embargo, de 5 a 10 minutos proporciona una buena intensidad de la tinción. - Cuando la intensidad de la tinción es óptima (controlada bajo microscopio de luz, véase la Figura 5 y la Figura 6), se detiene la reacción por lavado de las secciones durante 10 minutos con PBS 0,1 M a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 4 veces. A continuación, lavar las secciones con agua destilada.
- Muestreo de montaje (manejar con cuidado y guantes bajo el capó química)
- secciones de montaje en serie de diapositivas y secar al aire. Para ello, se extendió cuidadosamente las secciones con el fin rostro-caudal con los cepillos en las diapositivas. etiquetar claramente las diapositivas de acuerdo a las muestras.
- Deshidratar con Al absolutahol: sumergir los portaobjetos durante 30 segundos a temperatura ambiente en un baño de alcohol absoluto. Repetir dos veces.
- Claro con xileno: sumergir los portaobjetos en baño de xileno durante 3 minutos a temperatura ambiente. Repetir dos veces.
- Cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje. Para ello, aplicar 5 gotas de medio de montaje de la diapositiva y luego aplicar el cristal de la cubierta por la expulsión de las burbujas de aire. Deje secar al aire durante 48 horas.
6. datos y análisis estadístico
- Examinar secciones bajo un microscopio de luz. Contar visualmente neuronas FLI a gran aumento (200x) utilizando puntos de referencia estándar de 23,24. La tinción puntiforme c-Fos se localiza en los núcleos de neuronas.
- Para cada área analizada, contar el número de células c-fos-positivo por sección y comparar el número promedio entre las condiciones de control y estimulados. Dependiendo de la normalidad de los datos, usar la prueba t de Student para datos independientes o la prueba de Mann-Whitney. Las diferencias se consideraron significativas si P0; 0,05. Trazar la distribución de las neuronas FLI en un dibujo (100 aumentos) utilizando un tubo dibujo adjunto al microscopio y se fotografiaron con una cámara digital (Figura 5).
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Representative Results
La detección de c-fos es una herramienta útil que permite la identificación de grupos de células activadas en condiciones específicas, tales como la hipoxia e hipercapnia vivo (Figura 2A) en o en situaciones que imitan estas condiciones ex vivo (Figura 2 B). En vivo, recién nacido, joven , o roedores adultos se colocaron en una caja hermética en que el medio gaseoso es continuamente renovada por una mezcla de gases con una composición definida precisamente por 30-180 min 13,25,26 (Figura 2A). Como los actos de estimulación en todo el cuerpo, el cambio relacionado en c-FOS podría reflejar ambas vías centrales y periféricas activadas. Ex vivo, las preparaciones deafferented que contienen el bulbo raquídeo y la médula espinal se colocaron en una cámara de superfused continuamente con un LCRa con diferentes niveles de o 2 o pH con el fin de modelar de hipoxia o hipercapnia condiciones (
El CNS se fijó con PFA, ya sea por una perfusión a través de la circulación sistémica in vivo, o mediante una inmersión ex vivo (Figura 3). Debido a esta diferencia, la difusión fijador es más largo ex vivo que in vivo. Por lo tanto, la señal de c-FOS podría verse afectada, sobre todo en las estructuras profundas. Sin embargo, debido a que el análisis de c-FOS siempre se realiza en un enfoque comparativo entre el control y estimulada en animales in vivo o preparados ex vivo, esta diferencia no interferir con los resultados de una comparación estricta de control y estimulado datos. Después de eso, el SNC se cryoprotected, seccionado, y participó en la improcedimiento munohistochemical (Figura 3, Figura 4). De esta manera, algunas áreas del tronco cerebral respiratorias se han identificado in vivo como la modificación de su actividad bajo hipoxia o hipercapnia desafíos, incluyendo el núcleo retrotrapezoid (RTN), que es el sitio central principal de CO 2 chemoreception 10,13,28,29, la médula ventrolateral (VLM), que contiene el generador de ritmo inspiratorio 13, la comisura y las partes medias de la núcleo del tracto solitario (c / Mnts), que son las áreas de proyección de la entrada de cuerpos carotídeos 13,25,26,30 (Figura 5 ), y los núcleos del rafe medular 12,13.
Ex vivo, en condiciones deafferented, las neuronas de la RTN y el VLM se han descrito para cambiar su inmunorreactividad de c-fos en las condiciones de la reducción de O 16 a 18 febrero. El c-fos deprotección también se puede combinar con otras detecciones de inmunohistoquímica para caracterizar el fenotipo de las células activadas 14,31
Figura 1. Diseño del estudio para el uso de c-fos detección a Mapa de las estructuras neuronales implicados en las adaptaciones respiratorias a la hipoxia o hipercapnia. Cronológico pasos de la técnica de detección de c-fos en el SNC. SNC: sistema nervioso central; IHC:. La inmunohistoquímica Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. inducción (A) En el protocolo C-FOS. Vivo de inducción. Un animal fue colocado en un hermético cHamber y se expone a cualquiera de los dos de aire (21% O 2; 79% N 2), hipercapnia (21% O 2; 4% de CO 2; 75% N 2), o hipoxia (10% O 2; 90% N 2) gas mezcla durante 2 hr. (B) Protocolo de inducción Ex vivo. SNC fue diseccionado hacia fuera de roedores recién nacido y niñas de 0 a 4 días. El bulbo raquídeo y la médula espinal se aislaron con una lupa para obtener las preparaciones. Se colocaron en una cámara con la superficie ventral hacia arriba, superfused con LCRa (pH 7,4) a 26 ± 1 ° C. Modelado de estimulación hipóxica in vivo se llevó a cabo mediante la reducción de la fracción de O 2 en la LCRa por burbujeo una mezcla de gas anóxico que contiene 95% N 2 y 5% de CO 2. Modelado de estimulación hipercápnica in vivo se realizó utilizando un LCRa ácido que difería de LCRa normales en términos de NaHCO 3 concentración (disminución). El LCRa ácido está saturada con O 2 y Adjusted a pH 7,23 por burbujeo con un 95% de O2 y 5% de CO2. Cada condición de la estimulación se aplicó durante 30 min. ACSF:. líquido cefalorraquídeo artificial Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Muestreo del sistema nervioso central. In vivo, el SNC se obtuvo mediante disección después de procedimiento de fijación con 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular. Ex vivo, el SNC se sumergió directamente en 4% de paraformaldehído después de la disección. Posteriormente, el SNC se cryoprotected por inmersión en una solución crioprotectora y cortado en 40 micras secciones coronales gruesas usando un criostato. Las secciones rostro-caudal de la médula se colocaron en una placa de 12 pocillos que contenía PBS se acabene procedimientos inmunohistoquímicos. SNC: sistema nervioso central; PBS:. Phosphate-Buffered Saline Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Procedimientos inmunohistoquímicos indirectos. Las secciones se incubaron primero con un anticuerpo de conejo policlonal primario contra la proteína c-FOS. Después, se trataron con un anti-anticuerpo secundario de conejo de cabra biotinilado contra el anticuerpo primario. Después de esta incubación, las secciones se trataron con un complejo de avidina-biotina-peroxidasa, que se une fuertemente al anticuerpo secundario para amplificar la señal. De hecho, el complejo contiene varias moléculas de peroxidasa que conducen a una alta intensidad de la tinción. Por último, las secciones se tiñeron con una solución de 3,3-diamintetrahidrocloruro obenzidine y sulfato de amonio de níquel, lo que produce un precipitado de color gris oscuro en presencia de la enzima peroxidasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. neuronas c-FOS-positivos en secciones de la médula oblonga en ratones de control y ratones sometidos a hipoxia in vivo. (A) Dibujo de una sección de la médula oblonga adaptada de Paxinos y Franklin 24 (Bregma -7, 48 mm ). El área punteada delimita las partes comisurales y medianos de las núcleo del tracto solitario c / Mnts. El cuadro ilustra las estructuras ilustradas por fotomicrografías (B1 y B2). (B) fotomiccrographs realizaron (x100) en la c / Mnts nivel en normoxia (B1. de control, marco negro) o en condiciones de hipoxia (B2. marco azul). Las flechas negras muestran las células c-Fos-positivo. (C) Histograma que muestra el número medio de células c-FOS-positivos por sección en la c / nivel Mnts en normoxia (barra de color negro) o en condiciones de hipoxia (barra azul). Los valores se expresan como media ± desviación estándar. * Indica una diferencia significativa entre normoxia e hipoxia valores - prueba de la t de Student no pareada; *** P <0,001. CC: canal central de la médula espinal; c / Mnts:. comisurales piezas y medianas del núcleo del tracto solitario Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Procedimiento inmunohistoquímico. Pasos cronológicos del cFprocedimiento OS. Ab-I, anticuerpo primario; Ab-II, anticuerpo secundario; BSA, albúmina de suero bovino; DAB, tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina; Ni, sulfato amónico de níquel; PBS 0,1 M, solución salina 0,1 M tamponada con fosfato (pH 7,4); solución salina tamponada con fosfato PBST, 0,1 M suplementado con 0,3% de Triton X-100; Suero, suero de especies utilizadas para la producción de anticuerpo secundario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
C-fos es un gen temprano inmediato, y la detección de su producto, la proteína c-FOS, se utiliza clásicamente para identificar poblaciones neuronales implicados en las respuestas respiratorias específicas in vivo y ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33.
Los pasos críticos dentro del protocolo
Tenga cuidado durante la etapa de perfusión. La solución PFA 4% debe estar bien preparado y los pasos de fijación y posteriores a la fijación debe ser lo suficientemente largo para obtener el corte y tinción óptima. Por otra parte, la revelación es el paso más importante del procedimiento; la intensidad de la tinción debe ser controlada para evitar el ruido de fondo.
Ventajas de la técnica y significativas en relación con los métodos existentes
Aunque no parecen algunas neuronas para expresar el gen c-fos 5, esto method ha demostrado ser útil para determinar las vías neurales activados, por ejemplo, en la adaptación del ritmo respiratorio durante retos químicos. En comparación con otros genes tempranos inmediatos, c-fos tiene una expresión baja en ausencia de estimulación, lo que facilita la cuantificación de la actividad neuronal en una situación de prueba de 6.
La detección de c-fos es una técnica celular que indica los cambios globales en la actividad con el fin de analizar poblaciones neuronales implicados en la respuesta a varios estímulos. En comparación con el análisis de la actividad neuronal utilizando un enfoque electrofisiológico, que la mayoría de las preocupaciones de tiempo sólo un pequeño número de células en un área del cerebro definido, la detección de c-FOS permite a uno apreciar los cambios de actividad en un gran número de células y por lo tanto para definir activo áreas en todo el SNC. la detección de c-fos es fácilmente compatible con los animales sin restricciones y despierto, que no es el caso durante la grabación de la actividad neuronal mediante electrophysiology. Esto es una ventaja ya que evita el estrés y la interferencia de los anestésicos con los resultados obtenidos.
Ex vivo, se utilizó un periodo de 30 minutos de estimulación. Se ha demostrado previamente que esta estimulación es suficiente para inducir cambios en la expresión de c-fos en el nivel neuronal 34-36. Cinco min de estimulación son suficientes para inducir cambios en la expresión de c-fos, que se observan después de un período latente de 15 a 20 min 37. Los aumentos relacionados en la expresión de c-fos están relacionados con cambios en la actividad que tiene lugar durante los primeros 10 minutos de estimulación.
Limitaciones de la Técnica
Después de la estimulación, se requiere un retraso antes de que la acumulación de c-FOS en el núcleo. Este retraso de alrededor de 30 min corresponde al ARNm y la síntesis de proteínas. Este artículo se opone a la inmediatez de los resultados que puedan ser obtained mediante el registro de la actividad de las neuronas con la electrofisiología. Esto puede causar una pérdida de información acerca de los cambios rápidos en la actividad neuronal después de un estímulo específico y transitorios.
Como la proteína c-FOS puede tener una vida media de 90 a 100 min 4, su expresión podría verse afectada por los procedimientos quirúrgicos o el estrés asociados con la manipulación del animal, su principal limitación, o los cambios en su entorno. Por lo tanto, es necesario para reducir al mínimo las manipulaciones que pueden inducir cambios en la actividad neuronal no relacionadas con el estímulo estudiado y para llevar a cabo el muestreo de tejido inmediatamente después del final del estímulo fisiológico.
Modificaciones y solución de problemas de la Técnica
En este protocolo, la etapa de revelación se utiliza una solución que contenía tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina, sulfato de amonio níquel, y peróxido de hidrógeno, pero los kits comerciales para peroxidasa pudo alasí ser utilizado para este paso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
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