Abstract
Viele Studien versuchen, die Hirnregionen in spezifischen physiologischen Vorschriften beteiligt zu identifizieren und abzubilden. Die Proto-Onkogens c-fos, eine immediate early - Gen wird in Neuronen in Reaktion auf verschiedene Stimuli exprimiert. Das Proteinprodukt kann leicht mit immunhistochemischen Techniken nachgewiesen werden, um die Verwendung von c-fos Detektions führenden Gruppen von Neuronen zu kartieren, die Änderungen in ihrer Aktivität. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Identifizierung von brainstem neuronalen in der ventilatory Anpassung an Hypoxie oder Hyperkapnie beteiligt Populationen. Zwei Ansätze wurden beschrieben beteiligt neuronale Populationen in vivo bei Tieren zu identifizieren und ex vivo in deafferentierten brainstem Zubereitungen. In vivo wurden die Tiere ausgesetzt hyperkapnischen oder hypoxischen Gasgemischen. Ex vivo wurden deafferentierten Präparate superfused mit hypoxischen oder hyperkapnischen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit. In beiden Fällen entweder in vivo Kontrolle Tieren oder ex - vivo - Präparate wurden unter normoxischen und normocapnic Bedingungen gehalten. Der Vergleich dieser beiden Ansätze ermöglicht die Bestimmung des Ursprungs des neuronalen Aktivierungs dh peripheren und / oder zentralen. In vivo und ex vivo, brainstems wurden gesammelt, fixiert und in Abschnitte geschnitten. Sobald Abschnitte hergestellt, immunhistochemischen Nachweis des c-fos-Protein wurde gemacht, um die brainstem Gruppen von Zellen durch Hypoxie oder hyperkapnischen Stimulationen aktiviert zu identifizieren. Markierten Zellen wurden in brainstem Atmungsstrukturen gezählt. Im Vergleich zu der Kontrollgruppe, Hypoxie oder Hyperkapnie erhöhte die Anzahl der c-Fos markierten Zellen in mehreren spezifischen brainstem Websites, die damit konstitutiv für den neuronalen Bahnen bei der Anpassung des zentralen Atemantrieb beteiligt sind.
Introduction
Das c - fos - Gen wurde zum ersten Mal am Anfang des Jahres 1980 1,2 und ihr Produkt wurde im Jahr 1984 als ein Kernprotein mit Gen-Aktivator Eigenschaften 3,4 charakterisiert identifiziert. Er beteiligt sich an Mechanismen langfristigen Zusammenhang mit Neuron Stimulation. Tatsächlich Veränderungen in der neuronalen Aktivität führen zu second messenger Signalkaskaden, die die Expression der immediate early - Gens c-fos induziert, die die Produktion des Transkriptionsfaktors c-fos induziert. Der letztere veranlasst die Expression der späten Gene und nimmt somit in adaptive Reaktionen des Nervensystems auf viele verschiedene Arten von Stimuli 4. Da somit Ende 1980 5,6, c-Fos Protein - Nachweis häufig verwendet wurde , in der Regel 4 und auf die Aktivität des zentralen Nervensystems (ZNS) zum Abbilden aus neuronalen Bahnen die Wirkungen von exogenen Faktoren auf die Gentranskription zu studieren in verschiedenen physiologischen beteiligtal Bedingungen.
Basal c-fos - Expression wurde 4 in verschiedenen Arten , darunter Mäuse, Ratten, Katze, Affe und Mensch untersucht. Dadurch wird die Kinetik seiner Expression relativ gut bekannt. Die Transkriptionsaktivierung ist schnell (5 bis 20 min) 7,8, und die mRNA Akkumulation erreicht ein Maximum zwischen 30 und 45 min nach dem Beginn der Stimulation 9 und nimmt mit einer kurzen Halbwertszeit von 12 min. Die c-fos - Protein - Synthese folgt Akkumulation mRNA und konnte durch Immunhistochemie bei 20 bis 90 Minuten nach der Stimulation 6 nachgewiesen werden.
Analyse der c-fos - Expression wird in in vivo Studien klassisch verwendet , um die zentrale respiratorische Netzwerk in den ventilatory Reaktionen auf Hypoxie oder Hyperkapnie 10-14 beteiligt zu identifizieren. Vor kurzem wurde dieses Tool auch in ex vivo brainstem Zubereitungen verwendet zentralen Atem Netzwerk Anpassungen an Hypoxie oder h zu erkundenypercapnia 15-18. Tatsächlich erzeugen diese Präparate eine rhythmische Aktivität klassisch 19 an den zentralen Atemantrieb assimiliert. Somit hat diese Art der Herstellung den Vorteil, dass vollständig deafferentierten und daher Ergebnisse hinsichtlich c-fos - Expression nur die Folgen einer zentralen Stimulation ohne Eingreifen von peripheren Strukturen reflektieren.
Die c-fos-Nachweis konnte durch immunhistochemische oder immunohistofluorescence Ansätze gemacht werden. Indirekte Immunnachweis erfordert die Verwendung eines primären Antikörpers gegen c-fos und einem sekundären Antikörper, der gegen die Spezies gerichtet ist, in welcher der primäre Antikörper produziert wurde. Für die immunhistochemische Verfahren wird der sekundäre Antikörper mit einem Enzym konjugiert (Peroxidase, zum Beispiel) , die auf einem Substrat (H 2 O 2 für die Peroxidase) wirkt. Das Produkt der Enzymreaktion wird durch ein Chromogen (3,3-Diaminobenzidin entwickelt tetrahydrochloride), die Flecken es und kann unter Lichtmikroskopie beobachtet werden. Die Reaktion konnte verstärkt werden Nickelammoniumsulfat. Diese Verfahren erlauben den Nachweis von aktiven Neuronen in verschiedenen physiologischen Herausforderungen und daher die Identifizierung und / oder die Zuordnung der peripheren und zentralen Leitungsbahnen in den aufeinanderfolgenden physiologischen Reaktionen beteiligt.
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Protocol
Hinweis: c-fos - Erkennung ein standardisiertes Verfahren mit mehreren Schritten ist (Abbildung 1). Alle Versuche wurden an Ratten oder Mäusen durchgeführt. Experimentelle Protokolle wurden von der Ethikkommission in Tierexperiment Charles Darwin (Ce5 / 2011/05) genehmigt, erfolgt in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 22. September 2010 (2010/63 / EU) für die Tierpflege und nach durchgeführt mit Französisch Gesetze zur Tierpflege.
1. Herstellung der Lösungen
- Bereiten 0,2 M Natriumphosphat - Puffer: add 6,24 g NaH 2 PO 4 · 2H 2 O und 22,56 g Na 2 HPO 4 * H 2 O auf 1 l destilliertes Wasser unter Rühren.
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA): in 20 g PFA zu 150 ml destilliertem Wasser. Die Lösung wird auf 80 ° C unter Rühren. Um die Lösung zu löschen, die Hitze reduzieren und fügen Sie 1 oder 2 Tropfen 1 N NaOH die Paraformaldehyd lösen zu helfen. Komplett auf 250 mlmit destilliertem Wasser und 250 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,4). Lagerung bei 4 ° C. Nehmen Sie entsprechende Sorgfalt, wenn diese Reagenzien verwenden. Mit Handschuhen, Kittel und Schutzbrille unter einer chemischen Abzugshaube.
Hinweis: Bereiten Sie 4% PFA am Tag vor den Infusionen. Bestimmen das Volumen von 4% PFA in Abhängigkeit von Alter, Anzahl und Arten von Tieren. - Bereiten kryoprotektive Lösung: In 250 ml 0,2 M phosphatgepufferter Salzlösung, Mischung von 5 g Polyvinyl-pyrrolidon, 150 g Saccharose und 2,5 g Natriumchlorid. Nach vollständiger Auflösung in den 500 ml mit destilliertem Wasser 150 ml Ethylenglykol und einzustellen. Bewahren Sie die Gefrierschutzlösung bei 4 ° C.
- Bereiten 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): in 18 g NaCl zu 1 L destilliertem Wasser unter Rühren. Nach vollständiger Auflösung 1 L 0,2 M Natriumphosphatpuffer.
- Prepare Phosphate Buffered Saline, ergänzt mit 0,3% Triton X100 (PBST): 3 ml Triton X100-997 ml PBS.
- Bereiten 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6): add 3,03 g Tris-Hydrochlorid und 0,70 g Tris-Base auf 500 ml destilliertem Wasser unter Rühren.
- Bereiten Sie 2% Ziegenserum in PBST: für eine Platte, Herstellung von 30 ml Lösung. In 600 ul Ziegenserum zu 30 ml PBST und gut mischen. In 2,5 ml pro Vertiefung.
Hinweis: Serum verwendet wird, muss kommen aus Spezies für Sekundärantikörperproduktion verwendet - Bereiten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das c-fos-Protein (1: 4000, sc-52) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%). Für eine Platte, 30 ml Lösung herzustellen. In 75 mg Rinderserumalbumin zu 30 ml PBST und gut mischen. Dann fügen 7,5 ul von polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen den c-fos-Protein.
- Bereiten biotinyliertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 500) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%). Für eine Platte, 30 ml Lösung herzustellen. In 75 mg Rinderserumalbumin zu 30 ml PBST und gut mischen. Dann füge hinzu60 ul biotinyliertes Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper.
- Bereiten Sie Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (1: 250) in PBST (ABC-Lösung). Für eine Platte, 30 ml Lösung herzustellen. In 120 ul Reagens A und 120 ul Reagens B zu 30 ml PBST und gut mischen.
Hinweis: ABC-Lösung muß mindestens 30 min vor der Verwendung hergestellt werden. - Bereiten Substratlösung. Unmittelbar vor der Anwendung vorzubereiten, die Lösung als (für eine Platte) folgt: 20 mg Nickelammoniumsulfat hinzu und 10 mg 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid zu 50 ml Tris-Puffer. Filter und vor Licht schützen. In 2,0 ml pro Vertiefung. In der verbleibenden Lösung (25 ml) in 17 & mgr; l H 2 O 2 (H 2 O 2 Lösung in 30% H 2 O). In 2,0 ml pro Vertiefung.
Hinweis: Eine entsprechende Sorgfalt getroffen werden sollten, wenn diese Reagenzien verwenden. Mit Handschuhen und Laborkittel.
2. c-fos Induction und Gewebeverarbeitung In Vivo
Anmerkung: Die Versuche wurden an Ratten (Sprague Dawley), oder Mäusen (C57BL / 6) durchgeführt.
- Platzieren Sie die Tiere in einem luftdichten Kasten belüftet mit einem hypoxischen (O 2 8% ausgeglichen N 2) oder hyperkapnischen (CO 2 4%, O 2 21% ausgeglichen N 2) Gasgemisch für 2 h (2A).
- Betäuben des Tieres mit intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (100 mg / kg). Perfuse das Tier transcardial mit 4% 20 PFA. Behandeln Sie mit Sorgfalt und Handschuhe unter einer chemischen Abzugshaube.
- Nach Perfusion sezieren das Gehirn 20 und es in 7 ml 4% PFA in einem 15 - ml - Röhrchen tauchen für 48 Stunden bei 4 ° C. das Gehirn aus PFA Dann entfernen und vollständig in der Gefrierschutzlösung einzutauchen. Aufbewahren bei -18 ° C (Abbildung 3). Entsorgen Sie den Rest des Körpers des Tieres durch den entsprechenden Abfallverarbeitung pathway.
Hinweis: Eiskristallbildung beim Tief ist ein Schritt zwischen PFA Fixierung und Einfrieren. Es reduziert die Bildung von Eiskristallen in Zellen mit einer Lösung, deren Gefrieren in amorpher Form ist. Die fixierten Proben sind in der Kryoschutz-Lösung imprägniert werden (hergestellt in Schritt 1.3) für mindestens 24 h bei 4 ° C. Behandeln Sie mit Sorgfalt und Handschuhe unter chemischen Haube.
3. c-fos - Induktion und Gewebeverarbeitung Ex Vivo
Hinweis: Die Versuche wurden nur bei neugeborenen Ratten oder Mäusen durchgeführt.
- Isolieren Sie das ZNS , wie durch Suzue 19 beschrieben. Legen Sie sie in einem Aufnahmeraum und superfuse es kontinuierlich mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit mit einer Rate von 7,5 ml / min bei 26 ° C 21 (aCSF: in mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 26,0 NaHCO 3, 30,0 D-glucose, gesättigt mit O 2 und auf pH 7,4 eingestellt , indem sie mit 95% O 2 und 5 Begasung% CO 2) (2B).
- Ersetzen Sie die aCSF mit einem deoxygenated aCSF (gleiche Zusammensetzung mit 95% N 2 und 5% CO 2, pH 7,4) für Hypoxie oder von einem angesäuerten aCSF (Standard aCSF mit NaHCO 3 reduziert auf 10,0 mM, mit 95% O 2 und 5% CO 2) für Hyperkapnie. Tragen Sie die Stimulation für 30 min (2B).
- Ex vivo nach der Induktionsperiode übertragen das ZNS von neugeborenen Mäusen oder Ratten in 2,5 ml 4% PFA in einem 2,5 - ml - Röhrchen für 48 Stunden und lagern bei -18 ° C in einer Gefrierschutzlösung für die spätere Verwendung (Abbildung 3).
Anmerkung: Ex vivo ist es nicht notwendig , Tiere zu perfundieren. Eine frühere Studie legt nahe , dass kleine Proben weniger als 10 mm Durchmesser kann durch einfache Diffusion 22 fixiert werden. Eine zitierte Penetrationsrate (Abstand, in mm, für die Fixierungs Diffusion in das Gewebe) für Aldehyd 2 oder 3 mm / h.4. Brainstem Sectioning
Anmerkung: Von diesem Schritt an dem Ende, das Protokoll für in vivo und ex vivo Induktionen streng gleich ist.
- Vor dem Schneiden, legen Sie eine Person in einer 12-Well-Platte einlegen gut und fügen Sie 2,5 ml PBS in jede Vertiefung geben.
- Eine serielle Koronalschnitte (40 & mgr; m) des Hirnstamms mit einem Kryostaten und sammeln sie in der 12-Well-Platte. Für die gesamte erwachsene brainstem, machen etwa 70 Scheiben (Abbildung 3).
Hinweis: Es ist möglich, Gewebeschnitt aus mehreren Tieren parallel in einer Platte.
5. Immunhistologische Verfahren (Tabelle 1)
Hinweis: Während des gesamten Verfahrens bleiben die Abschnitte in den gut Einsätzen.
- Tag 1 - Endogene Peroxidaseaktivität Zerstörung, nicht-spezifische Bindungsstelle blockieren und die Inkubation mit dem primären Antikörper (Figur 4)
- Waschendie Schnitte für 10 min mit 0,1 M PBS bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
- Unterdrücken die endogene Peroxidase - Aktivität durch die Kranzschnitte für 30 min bei RT inkubiert mit Wasserstoffperoxid H 2 O 2, 3% in 0,1 M PBS (2,5 ml pro Vertiefung).
- Waschen Sie die Abschnitte für 10 min mit 0,1 M PBS bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
- Blockieren die nicht-spezifische Bindungsstelle von der koronalen Abschnitte für 1 h bei RT inkubiert mit Ziegenserum (2%) in PBST.
- Inkubieren der Kranzschnitte für 48 Stunden bei 4 ° C mit einem Kaninchen-polyklonalen Antikörpers gegen das c-fos-Protein (1: 4000, sc-52) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%) (2,5 ml pro Vertiefung).
- Tag 3 - Inkubation mit sekundärem Antikörper und die Entwicklung einer Farbreaktion (Figur 4)
- Waschen Sie die Abschnitte für 10 min mit PBS 0,1 M bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
- inkubieren derKoronalschnitte für 1 Stunde bei RT mit biotinyliertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 500) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%) (2,5 ml pro Vertiefung).
Hinweis: Die Ermittler auch einen sekundären Antikörper gekoppelt an eine fluoreszierende Sonde in diesem Stadium können. In diesem Fall beenden Sie das Protokoll in diesem Stadium und untersuchen direkt ein Fluoreszenzmikroskop. - Waschen Sie die Sektionen für 10 min mit PBST bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
- Inkubieren der Koronalschnitte für 1 h mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (1: 250) in PBST (2,5 ml pro Vertiefung).
- Waschen Sie die Sektionen für 10 min mit PBST bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). Wiederholen 2 mal.
- Waschen Sie die Abschnitte für 10 min mit 0,05 M Tris-Puffer bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). Wiederholen 2 mal.
- Inkubieren der koronale Schnitte mit 0,02% 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid, 0,04% Nickelammoniumsulfat und 0,01% Wasserstoffperoxid in 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6) at RT (2,0 ml pro Vertiefung). In der verbleibenden Lösung (25 ml) in 17 & mgr; l H 2 O 2 (H 2 O 2 Lösung in 30% H 2 O) (2,0 ml pro Vertiefung).
Hinweis: Der Prüfer sollte die Entwicklungszeiten unter dem Lichtmikroskop bestimmen. Jedoch 5 bis 10 min sorgt für eine gute Färbungsintensität. - Wenn Intensität der Färbung optimal ist (unter dem Lichtmikroskop kontrolliert, siehe Abbildung 5 und 6), um die Reaktion zu stoppen , indem sie die Abschnitte 10 min mit 0,1 M PBS bei RT (2,5 ml pro Well) waschen. Wiederholen 4 mal. Dann waschen Sie die Abschnitte mit destilliertem Wasser.
- Probenahme Montage (mit Vorsicht handhaben und Handschuhe unter chemischen Haube)
- Berg Abschnitte seriell auf Dias und der Luft trocknen. Dazu verteilen Sie bitte die Abschnitte in rostro-Schwanz-, um mit dem Pinsel auf den Folien. Offensichtlich beschriften Sie die Folien nach den Proben.
- Entwässern mit absolutem alkohol: die Folien für 30 Sekunden bei RT in absolutem Alkohol Bad einzutauchen. Zweimal wiederholen.
- Klar mit Xylol: die Folien in Xylolbad 3 min bei RT tauchen. Zweimal wiederholen.
- Deckglas die Folien mit Eindeckmediums. Dabei gelten 5 Tropfen auf dem Schlitten Eindeckmediums und wenden dann das Deckglas durch die Luftblasen auszutreiben. Luft trocknen für 48 Stunden.
6. Daten und statistische Analyse
- Untersuchen Abschnitte unter einem Lichtmikroskop. Zählen Optisch FLI Neuronen bei hoher Vergrößerung (200x) unter Verwendung von Standard - Sehenswürdigkeiten 23,24. Die c-Fos punkt- Färbung wird in den Kernen von Neuronen lokalisiert.
- Für jeden analysierten Bereich, zählen die Anzahl der c-Fos-positiven Zellen pro Abschnitt und vergleichen Sie die mittlere Zahl zwischen Kontrolle und stimulierten Bedingungen. In Abhängigkeit von der Normalität der Daten verwenden t - Test ungepaarten Student oder Mann-Whitney - Test. Die Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P0; 0,05. Plotten die Verteilung von FLI Neuronen auf eine Zeichnung (Vergrößerung 100x) mit einem Zugrohr zum Mikroskop befestigt ist und mit einer Digitalkamera (5) fotografiert.
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Representative Results
Die c-fos - Erkennung ist ein nützliches Werkzeug , das Gruppen von aktivierten Zellen unter bestimmten Bedingungen, wie Hypoxie und Hyperkapnie in vivo (2A) oder in Situationen , ermöglicht die Identifizierung , die diese Bedingungen ex vivo (2B) zu imitieren. In vivo, neugeboren, junge oder Erwachsenen Nagetieren wurden in einem luftdichten Kasten , in dem die gasförmige Umgebung ständig erneuert durch ein Gasgemisch mit einer Zusammensetzung genau definiert für 30 bis 180 min 13,25,26 (2A) angeordnet ist . Da die Stimulation wirkt auf den ganzen Körper, könnte die damit verbundene Änderung in c-fos reflektieren sowohl zentrale als auch periphere aktivierten Wege. Ex vivo, in einer Kammer deafferentierten Zubereitungen die Medulla oblongata und das Rückenmark enthält , mit einem aCSF mit verschiedenen Ebenen superfused kontinuierlich platziert wurden von O 2 oder pH - Wert , um hypoxische oder hyperkapnischen Bedingungen zu modellieren (
Das CNS wurde mit PFA fixiert, entweder durch eine Perfusion über den systemischen Kreislauf in vivo oder durch ein Eintauchen ex vivo (Abbildung 3). Aufgrund dieses Unterschieds ist der Fixierungsdiffusions mehr ex vivo als in vivo. So könnte das c-fos-Signal beeinflusst werden, vor allem in tiefen Strukturen. Da jedoch die c-fos - Analyse immer in einem Vergleichsansatz zwischen Kontrolle und stimuliert in vivo oder ex vivo Tieren Präparationen durchgeführt wird, würde dieser Unterschied nicht mit den Ergebnissen aus einem strengen Vergleich der Kontrolle und der stimulierten Daten stören. Danach wurde der CNS kryogeschützt, geschnitten und in der im Eingriffmunohistochemical Verfahren (Bild 3, Bild 4). Auf diese Weise haben einige respiratorische brainstem Bereiche wurden in vivo als modifizierende ihre Aktivität unter hypoxischen oder hyperkapnischen Herausforderungen, einschließlich der retrotrapezoid Nukleus (RTN) identifiziert, die die Hauptzentralstelle CO 2 Chemorezeption 10,13,28,29, die ventrolateralen Medulla (VLM), die enthält den inspiratorischen Rhythmusgenerator 13, den commissural und medianen Teile des Nucleus tractus solitarius (c / mnts), der die Projektionsflächen der Carotis Körper Eingangs 13,25,26,30 (Figur 5 sind ), und die Mark Raphekerne 12,13.
Ex vivo, in deafferentierten Bedingungen, Neuronen der RTN und die VLM sind beschrieben worden , um ihre c-Fos - Immunreaktivität unter Bedingungen reduzierter O 16 bis 18 Februar ändern. Die c-fos-deSchutz kann auch mit anderen immunhistochemischen Detektionen kombiniert werden , um den Phänotyp von aktivierten Zellen 14,31 zu charakterisieren
Abbildung 1. Studiendesign für den Einsatz von c-fos - Erkennung die neuronaler Strukturen in den Atem Anpassungen an Hypoxie oder Hyperkapnie beteiligt Karte. Chronologische Schritte von c-fos - Nachweistechnik im ZNS. CNS: Zentralnervensystem; IHC. Immunhistochemie Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. C-fos - Induktion. (A) In - vivo - Induktion - Protokoll. Ein Tier wurde in einem hermetischen c platzierthamber und ausgesetzt entweder Luft (21% O 2, 79% N 2), hyperkapnischen (21% O 2, 4% CO 2, 75% N 2) oder hypoxischen (10% O 2, 90% N 2) -Gas Gemisch 2 Std. (B) Ex - vivo - Induktion - Protokoll. CNS wurde vom Neugeborenen Nagetier im Alter von 0 bis 4 Tagen seziert. Medulla oblongata und Rückenmark wurden unter Vergrößerung isoliert die Präparate zu erhalten. Sie wurden nach oben zeigt, mit aCSF (pH 7,4) bei 26 ± 1 ° C superfused in einer Kammer mit der ventralen Oberfläche platziert. Modellierung hypoxische Stimulation in vivo wurde durch die Verringerung der Bruchteil von O 2 in den aCSF durchgeführt , indem eine anoxische Gasgemisch , enthaltend 95% N 2 und 5% CO 2 sprudeln. Hyperkapnischen Stimulation in vivo Modellierung wurde eine Säure aCSF unter Verwendung , die von normalen aCSF in Bezug auf die NaHCO3 - Konzentration (Abnahme) unterschieden. Die Säure aCSF gesättigt mit O 2 und adjusted auf pH 7,23 durch 2 mit 95% O 2 und 5% CO sprudeln. Jeder Stimulationsbedingung wurde für 30 min aufgetragen. aCSF. künstliche Zerebrospinalflüssigkeit Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Zentralnervensystem - Sampling. In vivo das ZNS durch Dissektion nach Fixierungsverfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd wurde erhalten über das Gefäßsystem durchblutet. Ex vivo wurde das ZNS direkt in 4% Paraformaldehyd nach der Sektion eingetaucht. Anschließend wurde das ZNS durch Eintauchen in eine Gefrierschutzlösung und in Scheiben geschnitten in 40 & mgr; m dicke Koronalschnitte unter Verwendung eines Kryostaten kryogeschützt. Die rostro-Schwanzabschnitte Medulla wurden in einer 12-Well-Platte gegeben, die PBS vor deme immunhistochemischen Verfahren. CNS: Zentralnervensystem; PBS:. Phosphatgepufferter Saline Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Indirekte immunhistochemische Verfahren. Die Schnitte wurden zuerst mit einem polyclonalen Kaninchen primären Antikörpers gegen das c-fos - Protein inkubiert. Danach wurden sie mit einem biotinylierten Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers gegen den primären Antikörper behandelt. Nach dieser Inkubation wurden die Schnitte mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex behandelt werden, die dicht an den sekundären Antikörper bindet, um das Signal zu verstärken. Tatsächlich enthält der Komplex mehrere Peroxidase-Moleküle zu einer hohen Färbungsintensität führt. Schließlich wurden die Schnitte gefärbt eine Lösung von 3,3-diamin mitobenzidine Tetrahydrochlorid und Nickelammoniumsulfat, die einen dunkelgrauen Niederschlag in der Gegenwart des Peroxidase - Enzym produziert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5 c-Fos-positiven Neuronen auf Abschnitten der Medulla in Kontrollmäusen und Hypoxie vorgelegt Mäuse in vivo. (A) Zeichnung eines Abschnitts der oblongata Medulla angepasst von Paxinos und Franklin 24 (Bregma -7, 48 mm ). Die gepunkteten Bereich abgrenzt die commissural und mittlere Teile des Nucleus Tractus solitarius c / mnts. Der Kasten zeigt die Strukturen von Mikrophotographien veranschaulicht (B1 und B2). (B) Photomicrographs ausgeführt (x100) an der c / mnts Ebene in Normoxie (B1. Kontrolle, schwarzer Rahmen) oder unter Hypoxie (B2. blauer Rahmen). Die schwarzen Pfeile zeigen c-Fos-positiven Zellen. (C) Histogramm die mittlere Anzahl von c-Fos-positiven Zellen pro Abschnitt bei c / mnts Ebene in Normoxie (schwarzer Balken) oder unter Hypoxie (blauer Balken) zeigt. Die Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. * Zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie Werte - Student ungepaarten t - Test; *** P <0,001. CC: Zentralkanal des Rückenmarks; c / mnts. commissural und mittlere Teile des Nucleus Tractus solitarius Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1 : Immunhistologische Verfahren. Chronologische Schritte des cFOS Verfahren. Ab-I, primärer Antikörper; Ab-II, sekundären Antikörper; BSA, Rinderserumalbumin; DAB, 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid; Ni, Nickel Ammoniumsulfat; PBS 0,1 M, 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4); PBST, 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, supplementiert mit 0,3% Triton X-100; Serum, Serum von Spezies für Sekundärantikörperproduktion verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
C-fos ist ein immediate early - Gen, und die Detektion ihres Produkts, die c-fos - Protein, verwendet wird klassisch neuronaler Populationen in spezifischen Atemwegsantworten in vivo und ex vivo 11,13,25,28 16-18 beteiligt zu identifizieren, 27,32,33.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Seien Sie während des Perfusionsschritt vorsichtig. Die 4% PFA-Lösung muss gut vorbereitet sein und die Fixierung und Postfixierung Schritte lang genug sein müssen, optimal schneiden und Färbung zu erhalten. Ferner ist die Offenbarung der wichtigste Schritt des Verfahrens; die Intensität der Färbung sollte gesteuert werden, Hintergrundrauschen zu vermeiden.
Die Vorteile der Technik und Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden
Obwohl einige Neuronen scheinen nicht die c-fos - Gen 5, das mich zum Ausdruck bringenThOD wurde als nützlich erwiesen Nervenbahnen aktiviert, um zu bestimmen, beispielsweise in Atemrhythmus Anpassung während der chemischen Herausforderungen. Im Vergleich zu anderen immediate early - Gene, hat c-fos eine niedrige Expression in Abwesenheit der Stimulation, die einen leichteren Quantifizierung der neuronalen Aktivität unter einer Testsituation 6.
Die c-fos-Erkennung ist ein zelluläres Technik, die globalen Veränderungen in der Aktivität, um zeigt neuronale Populationen in Reaktion auf mehrere Reize beteiligt zu analysieren. Verglichen mit neuronaler Aktivität Analyse einer elektrophysiologischen Ansatz, der die meiste Zeit nur für eine kleine Anzahl von Zellen in einem definierten Bereich des Gehirns, c-FOS Detektions eine ermöglicht Änderungen der Aktivität in einer großen Anzahl von Zellen zu schätzen und daher aktiv zu definieren Bereiche in der gesamten ZNS. C-FOS-Erkennung ist leicht kompatibel mit ungebremst und wach Tiere, die während der neuronalen Aktivität Aufnahme von Strom nicht der Fall istophysiology. Dies ist ein Vorteil, weil es Stress und Interferenz von Anästhetika mit den erhaltenen Ergebnissen vermeidet.
Ex vivo, verwendeten wir einen Zeitraum von 30 Minuten der Stimulation. Es wurde bereits gezeigt , dass diese Stimulation ausreichend ist 34-36 auf neuronaler Ebene Änderungen in c-fos - Expression zu induzieren. Fünf min Stimulations sind ausreichend Änderungen in c-fos - Expression zu induzieren, die nach einer Latenzzeit von 15 bis 20 min 37 beobachtet werden. Die damit verbundenen Anstieg der c-fos - Expression sind auf Veränderungen in der Aktivität stattfindet , während der ersten 10 Minuten der Stimulation zusammen.
Einschränkungen der Technik
Nach Stimulation wird eine Verzögerung erforderlich ist, bevor die Ansammlung von c-fos in den Zellkern. Diese Verzögerung von etwa 30 min entspricht mRNA und Proteinsynthese. Dieser Artikel wird auf die Unmittelbarkeit der Ergebnisse gegenüber, die OBTA sein kannined durch die Aktivität von Neuronen, die mit der Elektrophysiologie der Aufnahme. Dies kann zu einem Verlust von Informationen zu raschen Veränderungen in der neuronalen Aktivität nach einer spezifischen und vorübergehenden Reiz verursachen.
Wie c-fos - Protein , das eine Halbwertszeit von 90 bis 100 min 4 könnte seine Expression mit der Manipulation des Tieres, dessen Einschränkung oder Änderungen in ihrer Umgebung verbunden durch die chirurgische Eingriffe oder Stress beeinflusst werden. Aufweisen kann Somit ist es erforderlich, Manipulationen zu minimieren, die Veränderungen in der neuronalen Aktivität nicht auf den untersuchten Zusammenhang Stimulus induzieren könnten und Gewebeentnahme unmittelbar nach dem Ende des physiologischen Stimulus auszuführen.
Technische Änderungen und Fehlerbehebung der Technik
In diesem Protokoll verwendet die Offenbarung Schritt eine Lösung, die 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid, Nickelammoniumsulfat enthielt, und Wasserstoffperoxid, aber die kommerzielle Kits für Peroxydase konnte also für diesen Schritt verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
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