Abstract
Многие исследования пытаются определить и сопоставить участки мозга, связанные с конкретными физиологическими нормами. Протоонкоген с-ФОС, немедленно раннего гена, выражается в нейронах в ответ на различные стимулы. Белковый продукт можно легко обнаружить с иммуногистохимических методов, приводящих к использованию обнаружения C-FOS к карте группы нейронов, которые отображают изменения в их активности. В этой статье мы сосредоточились на выявлении популяций нейронов ствола головного мозга, участвующих в респираторной адаптации к гипоксии или гиперкапнии. Два подхода были описаны для идентификации вовлеченных популяции нейронов в естественных условиях у животных и ех в естественных условиях деафферентированной препаратов ствола головного мозга. В естественных условиях, животных подвергали гиперкапнических или гипоксических газовых смесей. Ex естественных условиях, деафферентированной препараты были орошали гипоксических или гиперкапнической искусственной спинномозговой жидкости. В обоих случаях, либо контроль в естественных условиях животных или ех естественных условиях препараты содержали в нормоксических и normocapnic условиях. Сравнение этих двух подходов позволяет определить происхождение нейронов , т.е. активации, периферической и / или центральной. В естественных условиях и бывших естественных условиях, brainstems были собраны, фиксированные, и нарезанные на отрезки. После того, как участки были подготовлены, иммуногистохимическое определение белка C-FOS было сделано для того, чтобы идентифицировать стволе мозга группы клеток, активированных гипоксических или гиперкапнических раздражений. Меченые клетки подсчитывали в стволовых дыхательных структур. По сравнению с контрольной группы, гипоксии или гиперкапнии увеличилось количество с-FOS меченых клеток в нескольких конкретных участков ствола головного мозга, которые, таким образом, конститутивный нейрональных путей, участвующих в процессе адаптации центрального дыхательного привода.
Introduction
C- ФОС ген был идентифицирован впервые в начале 1980 - 1,2 и его продукт был охарактеризован в 1984 году как ядерный белок , имеющий ген-активатор свойства 3,4. Она участвует в долгосрочных механизмов, связанных с нейрон стимуляции. Действительно, изменения в активности нейронов приводит к вторичным мессенджером сигнальных каскадов , которые индуцируют экспрессию непосредственных ранних генов с-FOS, который индуцирует выработку фактора транскрипции с-FOS. Последнее инициирует экспрессию поздних генов и , таким образом , участвует в адаптивных реакций нервной системы ко многим различным типам раздражителей 4. Таким образом, с конца 1980 г. 5,6, обнаружение белка с-ФОС был часто используется для изучения влияния экзогенных факторов на транскрипции генов в общем 4 и на деятельности центральной нервной системы (ЦНС) для картирования из нейронных путей участвует в различных физиологическихAl условия.
Базальный C-FOS выражение было изучено у различных видов , включая мышей, крыс, кошки, обезьяны и человека 4. Таким образом, кинетика его экспрессии относительно хорошо известны. Активация транскрипции происходит быстро ( от 5 до 20 мин) 7,8, а накопление мРНК достигает максимума от 30 до 45 мин после начала стимуляции 9 и уменьшается с коротким периодом полураспада 12 мин. Синтез белка с-ФОС следующим образом накопление мРНК и может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии при 20 до 90 мин после стимуляции 6.
Анализ с-FOS выражение классически используется в исследованиях в естественных условиях для определения центральной дыхательной сети , участвующих в вентиляторной реакции на гипоксии или гиперкапнии 10-14. Совсем недавно, этот инструмент был также использован в естественных условиях ех препаратов для изучения стволовых центральных органов дыхания сети адаптации к гипоксии или чypercapnia 15-18. В самом деле, эти препараты генерировать ритмическую активность классически приравнено к центральной респираторной привода 19. Таким образом, этот тип препарата имеет преимущество , так как полностью деафферентированной, и , следовательно, результаты в отношении с-FOS выражение лишь отражают последствия центральной стимуляции без какого - либо вмешательства периферических структур.
Обнаружение с-ФОС могут быть сделаны иммуногистохимических или immunohistofluorescence подходов. Косвенное иммунологического делает необходимым использование первичного антитела против с-FOS и вторичным антителом, направленным против этого вида, в котором производилось первичное антитело. Для иммуногистохимического метода, вторичное антитело , конъюгированное с ферментом (пероксидазой, например) , который действует на подложке (H 2 O 2 для пероксидазы). Продукт ферментативной реакции разработан хромоген (3,3-диаминобензидина tetrahydrochloridд), которая окрашивает его и можно наблюдать при световой микроскопии. Реакция может быть усилена с помощью сульфата никеля аммония. Эти методы позволяют обнаруживать активных веществ нейронов при различных физиологических проблем, и, следовательно, идентификации и / или отображение периферических и центральных путей, участвующих в последовательных физиологических реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: обнаружение C-FOS представляет собой стандартизированную процедуру с участием нескольких этапов (рисунок 1). Все эксперименты проводились на крысах или мышах. Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по этике в животных Эксперимент Чарльза Дарвина (CE5 / 2011/05), осуществляется в соответствии с директивой Европейского сообщества Совета от 22 сентября 2010 года (2010/63 / ЕС) для ухода за животными, и проводится в соответствии с французским законодательством для ухода за животными.
1. Приготовление растворов
- Приготовьте 0,2 М натрий фосфатный буфер: добавить 6,24 г NaH 2 PO 4 * 2H 2 O и 22,56 г Na 2 HPO 4 * H 2 O до 1 л дистиллированной воды при перемешивании.
- Готовят 4% параформальдегида (PFA): добавить 20 г PFA 150 мл дистиллированной воды. Раствор нагревают до 80 ° С при перемешивании. Для очистки раствора, уменьшить огонь и добавить 1 или 2 капли 1 N NaOH, чтобы помочь параформальдегид растворения. Полный до 250 млдистиллированной воды и добавляют 250 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,4). Хранить при температуре 4 ° С. Возьмите необходимую осторожность при использовании этих реагентов. Ручка с перчатки, лабораторный халат и защитные очки под химическим капотом.
Примечание: Подготовить 4% PFA в день до перфузии. Определить объем 4% PFA в зависимости от возраста, количества и видов животных. - Готовят раствор криозащитный: в 250 мл 0,2 М фосфатно-солевом буферном растворе, смешивают 5 г поливинилпирролидона, 150 г сахарозы и 2,5 г хлорида натрия. После полного растворения, добавляют 150 мл этиленгликоля и регулировать до 500 мл дистиллированной водой. Хранить криозащитный раствор при температуре 4 ° С.
- Готовят 0,1 М фосфатно-солевого буфера (PBS): добавить 18 г NaCl в 1 л дистиллированной воды при перемешивании. После полного растворения, добавляют 1 л 0,2 М буферного раствора фосфата натри.
- Готовят фосфатно-солевом буферном, дополненной 0,3% Тритон Х100 (PBST): Добавить 3 мл Тритона Х10От 0 до 997 мл PBS.
- Приготовьте 0,05 М Трис-буфера (рН 7,6): добавить 3,03 г трис-гидрохлорида и 0,70 г Трис-основание до 500 мл дистиллированной воды при перемешивании.
- Приготовьте 2% сыворотки козьего в PBST: для одной пластины, готовят 30 мл раствора. Добавьте 600 мкл козьего сыворотки до 30 мл PBST и хорошо перемешать. Добавить 2,5 мл на лунку.
Примечание: сыворотка используется должна исходить из видов, используемых для производства вторичного антитела - Подготовьте кроличьи поликлональные антитела против белка C-FOS (1: 4000, SC-52) в PBST с бычьим сывороточным альбумином (0,25%). Для одной пластины, приготовить 30 мл раствора. Добавить 75 мг бычьего сывороточного альбумина в 30 мл PBST и хорошо перемешать. Затем добавляют 7,5 мкл кроличьих поликлональных антител против белка С-FOS.
- Подготовка биотинилированным козьим антителом против кроличьего антитела (1: 500) в PBST с сывороточным бычьего альбумина (0,25%). Для одной пластины, приготовить 30 мл раствора. Добавить 75 мг бычьего сывороточного альбумина в 30 мл PBST и хорошо перемешать. Затем добавьте60 мкл биотинилированного козьего антитела против кролика.
- Готовят авидинбиотиновом-пероксидаза комплекс (1: 250) в PBST (раствор ABC). Для одной пластины, приготовить 30 мл раствора. Добавьте 120 мкл реагента А и 120 мкл реагента В до 30 мл PBST и хорошо перемешать.
Примечание: ABC раствор должен быть подготовлен по меньшей мере за 30 мин до использования. - Приготовьте раствор субстрата. Непосредственно перед использованием готовят раствор следующим образом (на одной пластине): добавить 20 мг сульфата аммония никеля и 10 мг 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорид до 50 мл Трис-буфера. Фильтр и защиты от света. Добавить 2,0 мл на лунку. В оставшемся растворе (25 мл) добавляют 17 мкл H 2 O 2 (H 2 O 2 раствор 30% H 2 O). Добавить 2,0 мл на лунку.
Примечание: Соответствующий следует соблюдать осторожность при использовании этих реагентов. Ручка с перчатками и халатах.
2. C-FOS Induфикция и обработка ткани In Vivo
Примечание: Опыты проводились на крысах (Sprague Dawley) или мышей (C57BL / 6).
- Поместите животных в герметичном ящике вентилируемого с гипоксическим (O 2 8% сбалансированный N 2) или гиперкапнический (CO 2 4%, O 2 21% сбалансированный N 2) газовой смеси в течение 2 ч (рис 2А).
- Анестезировать животное с внутрибрюшинного введения фенобарбитала (100 мг / кг). Заливать животное транскардиальную с 4% PFA 20. Обращаться с осторожностью и используйте перчатки под химическим капотом.
- После перфузии, рассекать мозг 20 и погружать его в 7 мл 4% PFA в 15 мл пробирку в течение 48 ч при температуре 4 ° С. Затем удалите мозг из PFA и погрузить его полностью в криозащитной растворе. Хранить при температуре -18 ° С (рисунок 3). Избавьтесь от остальной части тела животного с помощью соответствующего мусороперерабатывающий раthway.
Примечание: криозащиты является шагом между PFA фиксации и замораживания. Это уменьшает образование кристаллов льда в клетках раствором которого замораживание будет в аморфной форме. Фиксированные образцы должны быть пропитаны в криозащитной растворе (полученного на стадии 1.3) в течение не менее 24 ч при температуре 4 ° С. Обращаться с осторожностью и перчатки под химическим капотом.
3. C-FOS индукция и обработка ткани Ex Vivo
Примечание: Эксперименты проводились у новорожденных крыс или мышей только.
- Изолировать ЦНС , как описано Suzue 19. Поместите его в записи камеры и переливать его непрерывно с искусственной спинномозговой жидкости со скоростью 7,5 мл / мин при 26 ° C 21 (ACSF: в мм: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 26.0 NaHCO 3 30,0 D-глюкоза; насыщается O 2 и рН доводили до 7,4 путем газовыделения с 95% O 2 и 5% СО 2) (Фигура 2В).
- Заменить ACSF с обескислороженному ACSF ( тот же состав продувают 95% N 2 и 5% СО 2, рН 7,4) для гипоксии , или подкисленным ACSF (стандарт ACSF с NaHCO 3 снижается до 10,0 мМ, продувают 95% O 2 и 5% CO 2) для гиперкапнии. Применить стимуляцию в течение 30 мин (рис 2В).
- Ex естественных условиях, после индукционного периода передачи ЦНС новорожденных мышей или крыс в 2,5 мл 4% PFA в 2,5 мл пробирку в течение 48 ч и хранить при температуре -18 ° С в растворе криозащитной для последующего использования (рисунок 3).
Примечание: Ex естественных условиях, нет необходимости заливать животных. Предыдущее исследование предполагает , что мелкие особи размером менее 10 мм в диаметре может быть исправлена путем простой диффузии 22. Кавычках скорость проходки (расстояние в мм, для закрепляющего диффузии в ткани) альдегида составляет 2 или 3 мм / ч.4. Секционирование ствола мозга
Примечание: От этого шага до конца, протокол строго одинакова для в естественных условиях и бывших естественных индукций.
- Перед нарезка, поместите один человек хорошо вставить в 12-луночного планшета и добавляют 2,5 мл PBS в каждую лунку.
- Сделать серийные Коронарные срезы (40 мкм) с ствола мозга криостата и собирать их в 12-луночный планшет. Для всего взрослого мозга, составляют около 70 срезов (рисунок 3).
Примечание: Можно срез ткани от нескольких животных параллельно в одной пластине.
5. иммуногистохимического процедуры (таблица 1)
Примечание: На протяжении всей процедуры, секции остаются в колодце вставок.
- День 1 - Эндогенное разрушение активность пероксидазы, неспецифического связывания блокады сайта, и инкубацию с первичными антителами (рис 4)
- мытьсрезы в течение 10 мин 0,1 М PBS при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
- Подавить эндогенной активности пероксидазы путем инкубирования Коронарные срезы в течение 30 мин при комнатной температуре с помощью перекиси водорода H 2 O 2, 3% в 0,1 М PBS (2,5 мл на лунку).
- Промыть секции в течение 10 мин с 0,1 М PBS при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
- Блокировать неспецифическую сайт связывания путем инкубирования Коронарные срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с козьей сывороткой (2%) в PBST.
- Инкубируйте Коронарные срезы в течение 48 ч при 4 ° С с кроликом поликлональных антител против белка С-FOS (1: 4000, SC-52,) в PBST с бычьим сывороточным альбумином (0,25%) (2,5 мл на лунку).
- День 3 - инкубация с вторичным антителом и развитием цветной реакции (рис 4)
- Вымойте секций в течение 10 мин с PBS 0,1 М при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
- ВыдержитеКоронарные срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с биотинилированным козьим анти-кроличьим антителом (1: 500) в PBST с бычьим сывороточным альбумином (0,25%) (2,5 мл на лунку).
Примечание: Исследователь может также использовать вторичное антитело, соединенный с флуоресцентной пробы на данном этапе. В этом случае остановите протокол на данном этапе и исследовать непосредственно с помощью флуоресцентного микроскопа. - Промыть секции в течение 10 мин с помощью PBST при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
- Инкубируйте Коронарные срезы в течение 1 ч с авидин-биотин-пероксидаза комплекс (1: 250) в PBST (2,5 мл на лунку).
- Промыть секции в течение 10 мин с помощью PBST при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 2 раза.
- Промыть секции в течение 10 мин с 0,05 М Трис-буфере при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 2 раза.
- Инкубируйте Коронарные срезы с 0,02% 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорид, 0,04% сульфата никеля аммония и 0,01% перекиси водорода в 0,05 М Трис-буфера (рН 7,6) ат RT (2,0 мл на лунку). В оставшемся растворе (25 мл) добавляют 17 мкл H 2 O 2 (H 2 O 2 раствор 30% H 2 O) (2,0 мл на лунку).
Примечание: Исследователь должен определить время разработки под световым микроскопом. Тем не менее, от 5 до 10 мин обеспечивает хорошую интенсивность окрашивания. - При интенсивности окрашивания является оптимальным (контролируется под световым микроскопом, рисунок 5 и рисунок 6), остановить реакцию путем промывки секций в течение 10 мин с 0,1 М PBS при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторить 4 раза. Затем промойте разделы дистиллированной водой.
- Отбор проб монтажа (обращаться с осторожностью и перчатки под химическим капотом)
- секции для монтажа серийно на слайдах и воздушно-сухой. Для этого, осторожно раскрывайте секции в ростро-каудальном порядке с кисточками на слайдах. Очевидно маркировать слайды в соответствии с образцами.
- Дегидрировать с абсолютной Альcohol: погрузить слайды в течение 30 секунд при комнатной температуре в бане абсолютного спирта. Повторите дважды.
- Ясно ксилолом: погружают слайды в ксилоле бане в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите дважды.
- Покровное слайды с монтажной средой. Для этого нанесите 5 капель монтажа среды на слайде, а затем применить покровного стекла прогнанием пузырьки воздуха. Сушка воздухом в течение 48 часов.
6. Данные и статистический анализ
- Изучите разделы под световым микроскопом. Визуально рассчитывать FLI нейронов при большом увеличении (200x) , используя стандартные ориентиры 23,24. Точечное окрашивание с-Fos локализован в ядрах нейронов.
- Для каждой анализируемой области, подсчитать количество с-ФОС-позитивных клеток в группе и сравнить среднее число между контрольными и стимулированных условиях. В зависимости от нормальности данных, используйте т тест непарный студента или тест Манна-Уитни. Различия считались значимыми, если Р0; 0,05. Участок распределение FLI нейронов на чертежом (увеличение 100х) с помощью рисунка трубкой , прикрепленной к микроскопу и фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата (рисунок 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обнаружение с-ФОС является полезным инструментом , который позволяет идентифицировать группы активированных клеток при определенных условиях , таких как гипоксия и гиперкапния в естественных условиях (рис 2А) или в ситуациях , которые имитируют эти условия ех естественных условиях (рис 2б). В естественных условиях, новорожденный, молодой или взрослых грызунов были размещены в герметичном ящике , в котором газообразная среда постоянно обновляется с помощью газовой смеси с композицией , точно определенной для 30 до 180 мин 13,25,26 (фиг.2А). Как стимуляция воздействует на весь организм, связанный с ним изменения в с-ФОС может отражать как центральные , так и периферические активированные пути. Ex естественных условиях, деафферентированной препараты , содержащие продолговатый мозг и спинной мозг были помещены в камеру непрерывно орошали с ACSF с различными уровнями о 2 или рН для того , чтобы смоделировать гипоксические или гиперкапнические условий (
ЦНС фиксировали PFA, либо путем перфузии через системное кровообращение в естественных условиях, или путем погружения экс естественных условиях (рисунок 3). Из - за этой разницы, закрепляющий диффузии больше , чем экс виво в естественных условиях. Таким образом, сигнал с-ФОС может пострадать, особенно в глубоких структурах. Тем не менее, так как анализ с-ФОС всегда выполняется в сравнительном подходе между контролем и стимулировали в естественных условиях животных или препаратов , исключая виво, эта разница будет не мешать результатов от строгого сравнения контроля и стимулировала данных. После этого центральная нервная система была криопротекции, разрезали, и занимается имmunohistochemical процедура (Рисунок 3, Рисунок 4). Таким образом, некоторые дыхательные участки ствола мозга были выявлены в естественных условиях , как изменение их активности при гипоксических или гиперкапнических проблем, в том числе retrotrapezoid ядро (RTN), который является основным центральным узлом СО 2 хеморецепция 10,13,28,29, то вентролатеральный мозговое (VLM), который содержит генератор вдохе ритм 13, спаечный и срединные части ядра солитарного тракта (с / mNTS), которые являются проекционные зоны сонных тел ввода 13,25,26,30 (рисунок 5 ), и сердцевинные ядер шве 12,13.
Ex естественных условиях, в условиях деафферентированной, нейроны RTN и VLM были описаны , чтобы изменить их с-FOS иммунореактивности в условиях пониженного O 2 16-18. C-FOS-деСРЕДЫ также могут быть объединены с другими иммуногистохимических обнаружений , чтобы охарактеризовать фенотип активированных клеток 14,31
Рисунок 1. Схема исследования для использования с-FOS обнаружения к карте нейронного структур , участвующих в дыхательном Адаптации гипоксией или гиперкапнии. Хронологические этапы метода обнаружения C-FOS в ЦНС. Со стороны ЦНС: центральной нервной системы; IHC:. Immunohistochemistry Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. C-FOS индукция. (А) В естественных условиях индукции протокола. Животное помещали в герметичную CHamber и подвергают воздействию либо воздуха (21% O 2, 79% N 2), гиперкапническая (21% O 2, 4% СО 2, 75% N 2), или гипоксические (10% O 2, 90% N 2) газа смесь в течение 2 часов. (В) Ex естественных условиях индукции протокола. ЦНС препарировали от новорожденных грызунов в возрасте от 0 до 4 дней. Продолговатого мозга и спинного мозга были выделены при увеличении для получения препаратов. Их помещают в камеру с вентральной поверхностью, обращенной вверх, орошали ACSF (рН 7,4) при 26 ± 1 ° С. Моделирование гипоксическая стимуляция в естественных условиях осуществляли путем уменьшения доли O 2 в ACSF барботированием бескислородной газовую смесь , содержащую 95% N 2 и 5% CO 2. Моделирование гиперкапнической стимуляции в естественных условиях проводили с использованием кислотного ACSF , который отличался от нормального ACSF с точки зрения концентрации NaHCO 3 (уменьшение). Кислотный ACSF насыщается O 2 и Adjuвыверенное до рН 7,23 путем барботирования с 95% O 2 и 5% CO 2. Каждое условие стимуляция была применена в течение 30 мин. ACSF:. искусственной спинномозговой жидкости Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Центральная нервная система отбора проб. В естественных условиях, ЦНС был получен путем рассечения после закрепителя процедуры с использованием 4% параформальдегида перфузии через сосудистую систему. Ex естественных условиях, ЦНС непосредственно погружен в 4% параформальдегида после рассечения. Впоследствии ЦНС криопротекции путем погружения в раствор криозащитной и разрезают на 40 мкм Коронарные срезы с помощью криостата. Ростро-каудальном участки мозговом были помещены в 12-луночный планшет, содержащий PBS Beforе иммуногистохимические процедуры. Со стороны ЦНС: центральной нервной системы; PBS:. Забуференном фосфатом физиологическом растворе Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Косвенные иммуногистохимические процедуры. Срезы сначала инкубировали с кроличьими поликлональными первичными антителами против белка C-FOS. Затем их обрабатывают биотинилированным козьим антителом против кроличьего вторичным антителом против первичного антитела. После этой инкубации срезы обрабатывали авидин-биотин-пероксидаза комплекс, который прочно связывается с вторичным антителом, для усиления сигнала. В самом деле, комплекс содержит несколько молекул пероксидазы, приводящих к высокой интенсивности окрашивания. И, наконец, срезы окрашивали с использованием раствора 3,3-diaminobenzidine тетрагидрохлорид и сульфат никеля аммония, который производит темно - серый осадок в присутствии фермента пероксидазы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. C-FOS-позитивных нейронов на участках мозга у контрольных мышей и мышей , представленных к гипоксии в естественных условиях. (A) Нанесение секции продолговатый адаптировано из Paxinos и Франклина 24 (брегмы -7, 48 мм ). Рифленые области delimitates спаечный и срединные части ядра солитарного тракта ц / mNTS. Окно иллюстрирует структуры, проиллюстрированные микрофотографии (В1 и В2). (Б) Photomicrographs выполняется (X100) на C / mNTS уровень в нормоксии (B1. управления, черная рамка) или в условиях гипоксии (B2. синяя рамка). Черные стрелки показывают с-ФОС-позитивных клеток. (C) Гистограмма показывает среднее число C-FOS-позитивных клеток в сечении на уровне с / mNTS в нормоксии (черная полоса) или под гипоксией (синий бар). Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. * Указывает на существенную разницу между нормоксии и гипоксией значениями - непарный тест т Стьюдента; *** Р <0,001. CC: центральный канал спинного мозга; с / mNTS:. спаечные и срединные части ядра солитарного тракта Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. Процедура иммуногистохимического. Хронологические этапы КФПроцедура ОС. Ab-I, первичное антитело; Ab-II, вторичное антитело; БСА, бычий сывороточный альбумин; DAB, 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид; Ni, никель сульфат аммония; PBS, 0,1 М, 0,1 М фосфатно-солевого буферного раствора (рН 7,4); PBST, 0,1 М фосфатно-солевого буфера с добавлением 0,3% Тритон Х-100; Сыворотка, сыворотка из видов , используемых для производства вторичного антитела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-FOS является непосредственным раннего гена, и обнаружение его продукта, белок C-FOS, классически используется для идентификации популяции нейронов , участвующих в конкретных дыхательных реакций в естественных условиях 11,13,25,28 и исключая виво 16-18, 27,32,33.
Критические шаги в рамках Протокола
Будьте осторожны во время стадии перфузии. 4% -ного раствора PFA должны быть хорошо подготовлены и фиксации и после фиксации шаги должны быть достаточно длинными, чтобы получить оптимальную нарезку и окрашивания. Кроме того, откровение является наиболее важным шагом процедуры; интенсивность окрашивания следует контролировать, чтобы избежать фонового шума.
Достоинства техники и значимости в отношении существующих методов
Хотя некоторые нейроны, кажется , не выражают с-ФОС ген 5, это меняThOD было доказано, чтобы быть полезным для определения активированного нервные пути, например, в адаптации дыхательного ритма во время химических проблем. По сравнению с другими ближайшими ранних генов, C-FOS имеет низкую экспрессию в отсутствии стимуляции, что позволяет легче количественно оценить нейрональной активности при тестовой ситуации 6.
C-FOS обнаружение является клеточным метод, который указывает на глобальные изменения в активности с целью анализа нейрональных популяций, участвующих в ответ на несколько раздражителей. По сравнению с нейронного анализа активности с использованием электрофизиологического подхода, который большую часть времени касается лишь небольшое число клеток в определенной области мозга, обнаружение C-FOS позволяет одному оценить изменения активности в большом количестве клеток и, следовательно, для определения активного области в целом ЦНС. Обнаружение C-FOS легко совместим с необузданным и бодрствующих животных, что это не так во время записи активности нейронов по Электрophysiology. Это является преимуществом, поскольку это позволяет избежать стресса и интерференции анестетиков с полученными результатами.
Ex естественных условиях, мы использовали 30 мин период раздражения. Ранее было показано , что эта стимуляция является достаточным , чтобы вызвать изменения в с-FOS выражение на нейронном уровне 34-36. Через пять минут стимуляции достаточно , чтобы вызвать изменения в с-ФОС выражения, которые наблюдаются после латентного периода от 15 до 20 мин 37. Связанные с этим увеличение с-ФОС выражения связаны с изменениями в деятельности , которая происходит в течение первых 10 мин стимуляции.
Ограничения техники
После стимуляции, задержка требуется перед накоплением с-ФОС в ядре. Эта задержка около 30 мин, соответствует мРНК, так и синтеза белка. Этот пункт противостоит непосредственность результатов, которые могут быть obtaINed путем регистрации активности нейронов с электрофизиологии. Это может привести к потере информации о быстрых изменений в активности нейронов после определенного переходного и стимула.
Как с-FOS белка может иметь период полураспада от 90 до 100 мин 4, его экспрессия может быть затронута хирургических процедур или стресса , связанных с манипулированием животного, его ограничения или изменения в окружающей среде. Таким образом, необходимо, чтобы свести к минимуму манипуляции, которые могут вызвать изменения в нейрональной активности, не связанные с анализируемой стимула и немедленно выполнить отбор проб ткани после окончания физиологического стимула.
Модификации и устранение неисправностей техники
В этом протоколе, стадия откровения использовали раствор, содержащий 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорид, никель сульфат аммония, и перекись водорода, но коммерческие наборы для пероксидазы мог Alпоэтому можно использовать для этого шага.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
