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Biology

सी-FOS प्रोटीन Immunohistological जांच: एक उपयोगी उपकरण केंद्रीय रास्ते विशिष्ट शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल की एक मार्कर के रूप में Published: April 25, 2016 doi: 10.3791/53613
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3,4, 2, 1,3, 2, 1,3
1Sorbonne Paris Cité, Laboratory “Hypoxia & Lung” EA2363, University Paris 13, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM, UMR_S1158 Neurophysiologie Respiratoire Expérimentale et Clinique, Sorbonne Universités, 3Laboratory of Excellence GR-Ex, 4Laboratory MOVE (EA 6314), University of Poitiers

Abstract

कई अध्ययनों से पहचान करने और मस्तिष्क विशिष्ट शारीरिक नियमों में शामिल क्षेत्रों नक्शा करने के लिए करना चाहते हैं। आद्य ओंकोजीन सी FOS, एक तत्काल जल्दी जीन, विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है। प्रोटीन उत्पाद आसानी से प्रतिरक्षाऊतकरसायन सी FOS का पता लगाने का उपयोग न्यूरॉन्स कि उनकी गतिविधि में परिवर्तन प्रदर्शित के समूहों को मैप करने के लिए अग्रणी तकनीक के साथ पाया जा सकता है। इस अनुच्छेद में, हम हाइपोक्सिया या hypercapnia करने के लिए जीवन रक्षक प्रणाली अनुकूलन में शामिल brainstem neuronal आबादी की पहचान पर ध्यान केंद्रित किया। दो दृष्टिकोण पशुओं में विवो में शामिल neuronal आबादी की पहचान करने में वर्णित किया गया है और deafferented brainstem तैयारी में पूर्व vivo। में विवो, जानवरों hypercapnic या hypoxic गैस के मिश्रण से अवगत कराया गया। पूर्व vivo, deafferented तैयारियों hypoxic या hypercapnic कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ superfused थे। दोनों ही मामलों में, या तो विवो जानवरों या ई में नियंत्रणएक्स विवो तैयारियों normoxic और normocapnic की शर्तों के तहत बनाए रखा गया। इन दो दृष्टिकोणों की तुलना न्यूरोनल सक्रियण यानी की उत्पत्ति, के निर्धारण की अनुमति देता परिधीय और / या केंद्रीय। में vivo और पूर्व vivo, brainstems, एकत्र किए गए थे तय है, और वर्गों में कटा हुआ। एक बार जब वर्गों तैयार थे, सी-FOS प्रोटीन का पता लगाने के आदेश प्रतिरक्षाऊतकरसायन hypoxic या hypercapnic stimulations से सक्रिय कोशिकाओं के brainstem समूहों की पहचान करने के लिए बनाया गया था। लेबल की कोशिकाओं brainstem सांस की संरचनाओं में गिना रहे थे। नियंत्रण हालत, हाइपोक्सिया या hypercapnia की तुलना में कई विशिष्ट brainstem साइटों है कि इस प्रकार न्यूरोनल केंद्रीय सांस की ड्राइव के अनुकूलन में शामिल रास्ते के विधान में सी-FOS लेबल की कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई।

Introduction

सी FOS जीन 1980 1,2 की शुरुआत में पहली बार के लिए पहचान की थी और अपने उत्पाद को एक परमाणु प्रोटीन जीन-उत्प्रेरक गुण 3,4 होने के रूप में 1984 में विशेषता थी। यह लंबी अवधि के न्यूरॉन उत्तेजना के साथ जुड़े तंत्र में भाग लेता है। दरअसल, neuronal गतिविधि में परिवर्तन का दूसरा दूत cascades संकेत है कि तत्काल जल्दी जीन सी FOS की अभिव्यक्ति है, जो प्रतिलेखन कारक सी FOS के उत्पादन लाती प्रेरित करने के लिए नेतृत्व। उत्तरार्द्ध देर जीनों की अभिव्यक्ति शुरू की है और इस तरह उत्तेजनाओं 4 के कई अलग अलग प्रकार के तंत्रिका तंत्र के अनुकूली प्रतिक्रियाओं में भाग लेता है। इस प्रकार, 1980 5,6 के अंत के बाद से, सी-FOS प्रोटीन का पता लगाने अक्सर सामान्य 4 में और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की गतिविधि पर जीन प्रतिलेखन पर बहिर्जात कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए neuronal रास्ते बाहर मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया है विभिन्न शारीरिक में शामिलअल शर्तों।

बेसल सी FOS अभिव्यक्ति चूहे, चूहे, बिल्ली, बंदर, और मानव 4 सहित विभिन्न प्रजातियों में अध्ययन किया गया है। इस प्रकार, अपनी अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स अपेक्षाकृत अच्छी तरह से जाना जाता है। प्रतिलेखन सक्रियण तेजी से होता है (5 से 20 मिनट) 7,8, और mRNA संचय उत्तेजना 9 के शुरू होने के बाद 30 और 45 मिनट के बीच एक अधिकतम तक पहुँच जाता है और 12 मिनट की एक लघु आधा जीवन के साथ गिरावट आती है। सी-FOS प्रोटीन संश्लेषण mRNA संचय के बाद और 20 से 90 मिनट पद उत्तेजना 6 पर immunohistochemistry से पता लगाया जा सकता है।

सी-FOS अभिव्यक्ति का विश्लेषण प्रतिष्ठित हाइपोक्सिया या hypercapnia 10-14 के लिए जीवन रक्षक प्रणाली प्रतिक्रियाओं में शामिल केंद्रीय श्वसन नेटवर्क की पहचान करने में vivo अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। अभी हाल ही में इस उपकरण भी पूर्व vivo brainstem की तैयारी में इस्तेमाल किया गया था हाइपोक्सिया या एच के लिए केंद्रीय श्वसन नेटवर्क रूपांतरों का पता लगाने के लिएypercapnia 15-18। दरअसल, इन तैयारियों एक लयबद्ध गतिविधि प्रतिष्ठित केंद्रीय श्वसन ड्राइव 19 को आत्मसात उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार, तैयारी के इस प्रकार पूरी तरह से deafferented होने का फायदा है, और इसलिए, सी-FOS अभिव्यक्ति के बारे में परिणाम केवल परिधीय संरचनाओं के किसी भी हस्तक्षेप के बिना एक केंद्रीय उत्तेजना के परिणामों को प्रतिबिंबित।

सी-FOS पता लगाने प्रतिरक्षाऊतकरसायन या immunohistofluorescence दृष्टिकोण से बनाया जा सकता है। अप्रत्यक्ष immunodetection सी FOS के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी और एक माध्यमिक एंटीबॉडी प्रजातियों जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी का उत्पादन किया गया था के खिलाफ निर्देशित का उपयोग जरूरी है। प्रतिरक्षाऊतकरसायन विधि के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी एक एंजाइम (peroxidase, उदाहरण के लिए) है कि एक सब्सट्रेट (एच 2 ओ 2 peroxidase के लिए) पर काम करता है के साथ संयुग्मित है। enzymatic प्रतिक्रिया के उत्पाद एक वर्णकोत्पादक (3.3-diaminobenzidine tetrahydrochlorid द्वारा विकसित की हैई) है, जो यह दाग और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत देखा जा सकता है। प्रतिक्रिया निकल अमोनियम सल्फेट का उपयोग कर मजबूत बनाया जा सकता है। इन विधियों विभिन्न शारीरिक चुनौतियों के दौरान सक्रिय न्यूरॉन्स का पता लगाने और इसलिए पहचान और / या लगातार शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल परिधीय और केंद्रीय रास्ते में से मानचित्रण अनुमति देते हैं।

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Protocol

नोट: सी-FOS का पता लगाने के एक मानकीकृत कई कदम (चित्रा 1) को शामिल प्रक्रिया है। सभी प्रयोगों चूहों या चूहों पर प्रदर्शन किया गया। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, पशु प्रयोग चार्ल्स डार्विन (CE5 / 2011/05) में आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया पशु की देखभाल, के लिए 22 सितंबर, 2010 (2010/63 / ईयू) के यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक के अनुसार किया और अनुसार आयोजित जानवरों की देखभाल के लिए फ्रांस के कानूनों के साथ।

1. समाधान की तैयारी

  1. 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर तैयार: 6.24 छ नः 2 पीओ 4 * 2H 2 हे और 22.56 छ ना 2 HPO 4 * एच 2 ओ को 1 एल आसुत जल जोड़ने जबकि क्रियाशीलता।
  2. 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार: आसुत जल 150 मिलीलीटर के लिए पीएफए ​​के 20 ग्राम जोड़ें। 80 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान हीट जबकि क्रियाशीलता। समाधान स्पष्ट करने के लिए, गर्मी को कम करने और मदद करने के लिए paraformaldehyde भंग 1 एन NaOH के 1 या 2 बूँदें जोड़ें। 250 एमएल के लिए पूराआसुत जल से और 0.2 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) के 250 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। जब इन अभिकर्मकों का उपयोग उचित ख्याल रखना। दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और एक रासायनिक हुड के तहत सुरक्षा चश्मे के साथ संभाल।
    नोट: perfusions पहले दिन 4% पीएफए ​​तैयार करें। उम्र, संख्या और जानवरों की प्रजातियों में से एक समारोह के रूप में 4% पीएफए ​​की मात्रा निर्धारित करते हैं।
  3. cryoprotective समाधान तैयार: 0.2 एम फॉस्फेट बफर खारा के 250 एमएल में, मिश्रण Polyvinyl-pyrrolidone के 5 ग्राम, सूक्रोज की 150 ग्राम और सोडियम क्लोराइड का 2.5 जी। पूरा विघटन के बाद, इथाइलीन ग्लाइकॉल के 150 मिलीलीटर जोड़ने और आसुत जल के साथ 500 मिलीलीटर के लिए समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर cryoprotective समाधान स्टोर।
  4. तैयार 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस): 1 एल आसुत जल के लिए सोडियम क्लोराइड की 18 ग्राम जोड़ने जबकि क्रियाशीलता। पूरा विघटन के बाद, 1 एल 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर के जोड़ें।
  5. तैयार फॉस्फेट खारा बफर 0.3% के साथ पूरक ट्राइटन X100 (PBST): ट्राइटन X10 के 3 मिलीलीटर जोड़ेंपीबीएस के 0 997 मिलीलीटर।
  6. तैयार 0.05 एम Tris बफर (7.6 पीएच): आसुत जल जबकि सरगर्मी 500 मिलीलीटर के लिए Tris-हाइड्रोक्लोराइड के 3.03 जी और 0.70 छ Tris आधार जोड़ें।
  7. , एक थाली के लिए समाधान के 30 मिलीलीटर की तैयारी: PBST में 2% बकरी सीरम तैयार करें। 30 मिलीलीटर PBST को बकरी सीरम के 600 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। अच्छी तरह से प्रति 2.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: इस्तेमाल किया सीरम माध्यमिक एंटीबॉडी उत्पादन के लिए इस्तेमाल प्रजातियों से आना चाहिए
  8. (: 4000, अनुसूचित जाति -52 1) गोजातीय सीरम albumin (0.25%) के साथ PBST में सी-FOS प्रोटीन के खिलाफ खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी तैयार करें। एक थाली के लिए, समाधान के 30 मिलीलीटर की तैयारी। गोजातीय सीरम albumin के 75 मिलीग्राम 30 मिलीलीटर PBST में जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। फिर, सी-FOS प्रोटीन के खिलाफ खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के 7.5 μl जोड़ें।
  9. सीरम albumin गोजातीय (0.25%) के साथ PBST में: biotinylated बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी (500 1) तैयार करें। एक थाली के लिए, समाधान के 30 मिलीलीटर की तैयारी। गोजातीय सीरम albumin के 75 मिलीग्राम 30 मिलीलीटर PBST में जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। फिर जोड़िएbiotinylated बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के 60 μl।
  10. तैयार avidin बायोटिन-peroxidase जटिल (1: 250) PBST (एबीसी समाधान) में। एक थाली के लिए, समाधान के 30 मिलीलीटर की तैयारी। अभिकर्मक ए के 120 μl और 30 मिलीलीटर PBST के लिए अभिकर्मक बी के 120 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
    नोट: एबीसी समाधान तैयार रहना चाहिए उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट।
  11. सब्सट्रेट समाधान तैयार है। तुरंत उपयोग करने से पहले, समाधान (एक थाली के लिए) के रूप में तैयार: निकल अमोनियम सल्फेट के 20 मिलीग्राम और 50 मिलीग्राम Tris बफर करने के लिए 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride के 10 मिलीग्राम जोड़ें। फिल्टर और प्रकाश से बचाने के लिए। अच्छी तरह से प्रति 2.0 मिलीलीटर जोड़ें। शेष समाधान (25 मिलीलीटर) में एच के 17 μl 2 ओ 2 (एच 2 ओ 2 समाधान में एच 2 ओ 30%) जोड़ें। अच्छी तरह से प्रति 2.0 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: जब इन अभिकर्मकों का उपयोग उचित ध्यान रखा जाना चाहिए। दस्ताने और प्रयोगशाला कोट के साथ संभाल।

2. सी FOS इंदुction और ऊतक प्रसंस्करण विवो में

नोट: प्रयोगों चूहों (Sprague Dawley) या चूहों (C57BL / 6) में प्रदर्शन किया गया।

  1. एक hypoxic (ओ 2 से 8% संतुलित एन 2) या hypercapnic (सीओ 2 से 4%, हे 2 21% संतुलित एन 2) गैस मिश्रण 2 घंटा (2A चित्रा) के लिए के साथ हवादार एक airtight बॉक्स में जानवरों रखें।
  2. pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन (100 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पशु चतनाशून्य। 4% पीएफए ​​20 के साथ पशु transcardially छिड़कना। एक रासायनिक हुड के नीचे की देखभाल और उपयोग दस्ताने के साथ संभाल।
  3. छिड़काव के बाद, मस्तिष्क 20 काटना और 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 4% पीएफए ​​के 7 मिलीलीटर में विसर्जित। तब पीएफए ​​से मस्तिष्क को हटा दें और cryoprotective समाधान में पूरी तरह से इसे विसर्जित कर दिया। -18 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3) पर स्टोर। उचित अपशिष्ट प्रसंस्करण देहात से जानवर के शरीर के बाकी के निपटानthway।
    नोट: Cryoprotection पीएफए ​​निर्धारण और ठंड के बीच एक कदम है। यह एक समाधान जिसका ठंड अनाकार रूप में हो जाएगा के साथ कोशिकाओं में बर्फ के क्रिस्टल के गठन को कम करता है। तय नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए cryoprotective समाधान (1.3 चरण में तैयार) में गर्भवती किया जाना चाहिए। रासायनिक हुड के तहत देखभाल और दस्ताने के साथ संभाल।

3. सी-FOS प्रेरण और ऊतक प्रसंस्करण पूर्व विवो

नोट: प्रयोगों नवजात चूहों या चूहों ही में प्रदर्शन किया गया।

  1. सीएनएस पृथक रूप Suzue 19 से वर्णन किया। यह एक रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें और 26 डिग्री सेल्सियस 21 (aCSF में 7.5 मिलीग्राम / मिनट की दर से लगातार यह superfuse कृत्रिम Cerebro-रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ के साथ: mm में: 130.0 NaCl, 5.4 KCl, 0.8 2 CaCl, 1.0 MgCl 2, 26.0 3 NaHCO, 30.0 डी ग्लूकोज, हे 2 के साथ संतृप्त और 95% ओ 2 और 5 के साथ बक से 7.4 पीएच को समायोजित% सीओ 2) (चित्रा 2 बी)।
  2. एक ऑक्सीजन रहित ACSF (एक ही रचना 95% एन 2 और 5% सीओ 2, 7.4 पीएच के साथ bubbled) हाइपोक्सिया के लिए या एक अम्लीय ACSF (3 NaHCO के साथ मानक aCSF 10.0 मिमी से कम से, 95% 2 हे और साथ bubbled साथ aCSF बदलें hypercapnia के लिए 5% सीओ 2)। 30 मिनट (चित्रा 2 बी) के लिए उत्तेजना को लागू करें।
  3. पूर्व vivo, प्रेरण अवधि के बाद, सीएनएस नवजात चूहों या चूहों के 2.5 4% की मिलीलीटर पीएफए ​​में एक 2.5 मिलीलीटर ट्यूब में 48 घंटा और दुकान के लिए -18 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग (चित्रा 3) के लिए एक cryoprotective समाधान में हस्तांतरण।
    ध्यान दें: पूर्व vivo, यह जानवरों छिड़कना करने के लिए आवश्यक नहीं है। पिछले एक अध्ययन से पता चलता है कि छोटे नमूनों को मापने के व्यास में कम से कम 10 मिमी सरल प्रसार 22 से तय किया जा सकता है। प्रवेश की एक उद्धृत दर (दूरी, मिमी में, ऊतक में लगानेवाला प्रसार के लिए) एल्डिहाइड के लिए 2 या 3 मिमी / घंटा है।

    4. Brainstem सेक्शनिंग

    नोट: अंत करने के लिए इस कदम से, प्रोटोकॉल को कड़ाई से इन विवो और पूर्व vivo inductions के लिए ही है।

    1. टुकड़ा करने की क्रिया से पहले, जगह एक व्यक्ति को अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली में डालने और प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. एक cryostat के साथ मस्तिष्क के धारावाहिक राज्याभिषेक वर्गों (40 माइक्रोन) बनाने और उन्हें 12 अच्छी तरह से थाली में इकट्ठा। पूरे वयस्क मस्तिष्क के लिए, के बारे में 70 स्लाइस (चित्रा 3) बनाते हैं।
      नोट: यह एक थाली में समानांतर में कई जानवरों से खंड ऊतक के लिए संभव है।

    5. Immunohistological प्रक्रिया (1 टेबल)

    नोट: प्रक्रिया के दौरान, वर्गों में अच्छी तरह से सम्मिलित करता है में रहते हैं।

    1. दिन 1 - अंतर्जात peroxidase गतिविधि विनाश, गैर विशिष्ट बंधन साइट नाकाबंदी, और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन (चित्रा 4)
      1. धुलाईआरटी पर 0.1 एम पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए वर्गों (अच्छी तरह से प्रति 2.5 मिलीलीटर)। 3 बार दोहराएँ।
      2. हाइड्रोजन पेरोक्साइड एच के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए राज्याभिषेक वर्गों incubating द्वारा अंतर्जात peroxidase गतिविधि को दबाने 2 ओ 2, 0.1 एम पीबीएस (अच्छी तरह से प्रति 2.5 मिलीलीटर) में 3%।
      3. आरटी पर 0.1 एम पीबीएस के साथ 10 मिनट (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के लिए वर्गों को धो लें। 3 बार दोहराएँ।
      4. PBST में बकरी सीरम (2%) के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए राज्याभिषेक वर्गों incubating द्वारा गैर विशिष्ट बंधन साइट ब्लॉक।
      5. (: 4000, अनुसूचित जाति -52, 1) गोजातीय सीरम albumin (0.25%) (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के साथ PBST में सी-FOS प्रोटीन के खिलाफ एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए राज्याभिषेक वर्गों सेते हैं।
    2. दिन 3 - माध्यमिक एंटीबॉडी और एक रंग प्रतिक्रिया के विकास के साथ ऊष्मायन (चित्रा 4)
      1. आरटी पर पीबीएस 0.1 एम के साथ 10 मिनट (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के लिए वर्गों को धो लें। 3 बार दोहराएँ।
      2. सेतेगोजातीय सीरम albumin (0.25%) (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के साथ PBST में: एक biotinylated बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी (500 1) के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए राज्याभिषेक वर्गों।
        नोट: अन्वेषक भी इस स्तर पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी एक फ्लोरोसेंट जांच करने के लिए मिलकर उपयोग कर सकते हैं। इस मामले में, इस स्तर पर प्रोटोकॉल करो और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग सीधे जांच करते हैं।
      3. आरटी पर PBST के साथ 10 मिनट (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के लिए वर्गों को धो लें। 3 बार दोहराएँ।
      4. एक avidin बायोटिन-peroxidase जटिल (1: 250) के साथ 1 घंटे के लिए राज्याभिषेक वर्गों सेते PBST में (अच्छी तरह से प्रति 2.5 मिलीलीटर)।
      5. आरटी पर PBST के साथ 10 मिनट (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के लिए वर्गों को धो लें। 2 बार दोहराएँ।
      6. आरटी पर 0.05 एम Tris बफर के साथ 10 मिनट (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के लिए वर्गों को धो लें। 2 बार दोहराएँ।
      7. 0.05 एम Tris बफर में 0.02% 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 0.04% निकल अमोनियम सल्फेट और 0.01% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ राज्याभिषेक वर्गों सेते (7.6 पीएच) एकटी आर टी (अच्छी तरह से प्रति 2.0 मिलीलीटर)। शेष समाधान (25 एमएल) जोड़ने के 17 μl एच 2 ओ 2 (एच 2 ओ 2 समाधान में एच 2 ओ 30%) (अच्छी तरह से प्रति 2.0 मिलीलीटर) में।
        नोट: अन्वेषक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विकास के समय का निर्धारण करना चाहिए। हालांकि, 5 से 10 मिनट अच्छा धुंधला तीव्रता प्रदान करता है।
      8. जब धुंधला तीव्रता इष्टतम है (प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नियंत्रित, चित्रा 5 और 6 चित्र देखें), आरटी पर 0.1 एम पीबीएस के साथ 10 मिनट (अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल) के लिए वर्गों धोने से प्रतिक्रिया बंद करो। 4 बार दोहराएँ। फिर, आसुत जल के साथ वर्गों धो लें।
    3. नमूना बढ़ते (रासायनिक हुड के तहत देखभाल और दस्ताने के साथ संभाल)
      1. क्रमानुसार स्लाइड और हवा शुष्क पर माउंट वर्गों। इस के लिए, ध्यान से स्लाइड पर ब्रश के साथ rostro दुम क्रम में वर्गों में फैल गया। जाहिर नमूने के अनुसार स्लाइड लेबल।
      2. पूर्ण अल साथ निर्जलीकरणअल्कोहल: पूर्ण शराब स्नान में आरटी पर 30 सेकंड के लिए स्लाइड विसर्जित कर दिया। दो बार दोहराएँ।
      3. xylene साथ साफ़ करें: आरटी पर 3 मिनट के लिए xylene स्नान में विसर्जित स्लाइड। दो बार दोहराएँ।
      4. बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड्स coverslip। इस के लिए, स्लाइड पर बढ़ते मध्यम के 5 बूँदें लागू करते हैं और फिर हवा के बुलबुले बाहर ड्राइविंग द्वारा कवर कांच लागू होते हैं। हवा शुष्क 48 घंटे के लिए।

    6. डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण

    1. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत वर्गों की जांच करना। दिखने में उच्च वृद्धि (200x) मानक स्थलों 23,24 का उपयोग करने पर FLI न्यूरॉन्स गिनती। सी-Fos punctiform धुंधला न्यूरॉन्स के नाभिक में स्थानीय है।
    2. प्रत्येक विश्लेषण किया क्षेत्र के लिए, अनुभाग प्रति सी FOS पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या गिनने और नियंत्रण और उत्तेजित स्थितियों के बीच मतलब संख्या की तुलना करें। डेटा के सामान्य पर निर्भर करता है, अयुगल छात्र की टी परीक्षण या मान व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करें। मतभेद अगर पी महत्वपूर्ण माना जाता था0; 0.05। एक ड्राइंग (बढ़ाई 100x) पर FLI न्यूरॉन्स के वितरण के एक ड्राइंग ट्यूब माइक्रोस्कोप से जुड़ी है और एक डिजिटल कैमरा के साथ फोटो खिंचवाने (चित्रा 5) का उपयोग कर प्लॉट।

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Representative Results

सी-FOS का पता लगाने कि इस तरह के हाइपोक्सिया और इन विवो (2A चित्रा) में hypercapnia के रूप में या स्थितियों है कि इन शर्तों के पूर्व vivo (चित्रा 2 बी) की नकल में विशेष परिस्थितियों में ही सक्रिय कोशिकाओं की पहचान करने की अनुमति देता है समूहों के लिए एक उपयोगी उपकरण है। विवो में, नवजात शिशु, युवा या वयस्क मूषक एक airtight बॉक्स में जो गैसीय वातावरण लगातार एक संरचना ठीक 30 मिनट के लिए 180 13,25,26 (2A चित्रा) के लिए परिभाषित के साथ एक गैस मिश्रण द्वारा नए सिरे से है में रखा गया था। पूरे शरीर पर उत्तेजना में कार्य करता है के रूप में, सी-FOS में संबंधित परिवर्तन दोनों केंद्रीय और परिधीय सक्रिय रास्ते प्रतिबिंबित सकता है। पूर्व vivo, deafferented ओब्लोंगता और रीढ़ की हड्डी युक्त तैयारी एक कक्ष लगातार विभिन्न स्तरों के साथ एक ACSF के साथ superfused में रखा गया हे 2 या आदेश hypoxic या hypercapnic की स्थिति के लिए मॉडल में पीएच की ( 16-18,27। उत्तेजना केवल इन deafferented तैयारी में कार्य करता है के रूप में, यह निष्कर्ष है कि केवल केंद्रीय तंत्र सी FOS पहचान संरचनाओं में कोशिकाओं की सक्रियता में शामिल थे संभव है।

सीएनएस विवो में प्रणालीगत संचलन के माध्यम से पीएफए ​​के साथ तय हो गया था, या तो एक छिड़काव द्वारा, या एक विसर्जन पूर्व vivo (चित्रा 3) द्वारा। इस अंतर के कारण, लगानेवाला प्रसार अब पूर्व vivo विवो में से है। इस प्रकार, सी-FOS संकेत प्रभावित हो सकता है, विशेष रूप से गहरी संरचनाओं में। हालांकि, क्योंकि सी FOS विश्लेषण हमेशा नियंत्रण के बीच एक तुलनात्मक दृष्टिकोण में प्रदर्शन किया और इन विवो जानवरों या पूर्व vivo तैयारी में प्रेरित है, इस अंतर को परिणाम के साथ नियंत्रण का एक सख्त तुलना से हस्तक्षेप और डेटा उत्तेजित नहीं होता। उसके बाद, सीएनएस, cryoprotected था sectioned, और im में लगेmunohistochemical प्रक्रिया (चित्रा 3, चित्रा 4)। इस तरह, कुछ सांस brainstem क्षेत्रों hypoxic या hypercapnic चुनौतियों के तहत उनकी गतिविधियों को संशोधित करने, retrotrapezoid नाभिक (RTN), जो कंपनी की मुख्य केंद्रीय साइट 2 chemoreception 10,13,28,29 है सहित, के रूप में vivo में पहचान की गई है ventrolateral मज्जा (VLM), जो (सी / mnts) श्वसन लय जनरेटर 13, संबंधी और नाभिक Tractus solitarius की औसत भागों में शामिल है, जो मन्या निकायों इनपुट 13,25,26,30 (चित्रा 5 का प्रक्षेपण क्षेत्रों रहे हैं ), और दिमाग़ी raphe नाभिक 12,13।

पूर्व vivo, deafferented परिस्थितियों में, RTN और VLM के न्यूरॉन्स कम हो हे 2 16-18 की शर्तों के तहत अपने C-FOS immunoreactivity बदलने के लिए वर्णित किया गया है। सी-डी FOStection भी सक्रिय कोशिकाओं 14,31 के phenotype को चिह्नित करने के लिए अन्य प्रतिरक्षाऊतकरसायन पता लगाने के साथ जोड़ा जा सकता है

आकृति 1
चित्रा 1. hypoxia या hypercapnia को श्वसन रूपांतरों में शामिल Neuronal संरचनाएं मानचित्र सी FOS जांच के उपयोग के लिए अध्ययन के डिजाइन। सीएनएस में सी-FOS पहचान तकनीक की कालानुक्रमिक कदम। सीएनएस: केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र; आईएचसी:। Immunohistochemistry यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 सी-FOS प्रेरण। (ए) में विवो प्रेरण प्रोटोकॉल। एक जानवर एक भली भांति बंद सी में रखा गया थाhamber और या तो हवा (21% ओ 2; 79% एन 2) से अवगत कराया, hypercapnic (21% हे 2, 4% सीओ 2, 75% एन 2), या hypoxic (10% ओ 2; 90% एन 2) गैस 2 घंटे के लिए मिश्रण। (बी)   पूर्व vivo प्रेरण प्रोटोकॉल। सीएनएस 0 से 4 दिनों के आयु वर्ग के नवजात कृंतक से बाहर विच्छेदित किया गया था। ओब्लोंगता और रीढ़ की हड्डी बढ़ाई के तहत अलग थे तैयारियों प्राप्त करने के लिए। वे 26 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर उदर की सतह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ aCSF (7.4 पीएच) के साथ superfused के साथ एक कक्ष में रखा गया था। विवो में मॉडलिंग hypoxic उत्तेजना युक्त 95% एन 2 और 5% सीओ 2 के एक ऑक्सीजन में कमी गैस मिश्रण बुदबुदाती aCSF में ओ 2 के अंश को कम करने के द्वारा किया गया था। विवो में hypercapnic उत्तेजना मॉडलिंग एक एसिड aCSF कि 3 NaHCO एकाग्रता (कमी) के संदर्भ में सामान्य aCSF से मतभेद उपयोग किया गया था। एसिड aCSF हे 2 और adju के साथ संतृप्त है95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती पीएच 7.23 को sted। प्रत्येक उत्तेजना हालत 30 मिनट के लिए लागू किया गया था। aCSF:। कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र नमूना। में विवो, सीएनएस लगानेवाला प्रक्रिया 4% paraformaldehyde नाड़ी तंत्र के माध्यम से भरकर रखा उपयोग करने के बाद विच्छेदन द्वारा प्राप्त किया गया था। पूर्व vivo, सीएनएस सीधे विच्छेदन के बाद 4% paraformaldehyde में डूब गया था। बाद में, सीएनएस एक cryoprotective समाधान में विसर्जन के द्वारा cryoprotected और 40 माइक्रोन एक cryostat का उपयोग कर मोटी राज्याभिषेक वर्गों में कटा हुआ था। मज्जा की rostro दुम वर्गों एक 12 अच्छी तरह से थाली befor पीबीएस युक्त में रखा गयाई प्रतिरक्षाऊतकरसायन प्रक्रियाओं। सीएनएस: केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र; पीबीएस:। फॉस्फेट बफर खारा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. अप्रत्यक्ष Immunohistochemical प्रक्रिया। वर्गों पहली सी-FOS प्रोटीन के खिलाफ एक खरगोश पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे। बाद में, वे प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ एक biotinylated बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया। इस ऊष्मायन के बाद, वर्गों एक Avidin-बायोटिन peroxidase जटिल है, जो माध्यमिक एंटीबॉडी को कसकर बांध संकेत बढ़ाना साथ इलाज किया गया। दरअसल, जटिल कई peroxidase एक उच्च तीव्रता धुंधला करने के लिए अग्रणी अणुओं में शामिल है। अंत में, वर्गों 3.3-diamin का एक समाधान का उपयोग दाग थेobenzidine tetrahydrochloride और निकल अमोनियम सल्फेट, जो peroxidase एंजाइम की उपस्थिति में एक गहरे भूरे रंग के वेग पैदा करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. नियंत्रण चूहों और चूहों विवो में हाइपोक्सिया के लिए प्रस्तुत में ओब्लोंगता के वर्गों पर सी-Fos-सकारात्मक न्यूरॉन्स। (ए) ओब्लोंगता Paxinos और फ्रेंकलिन 24 (शीर्षस्थान -7, 48 मिमी से अनुकूलित के एक वर्ग की ड्राइंग )। बिंदीदार क्षेत्र नाभिक Tractus solitarius सी / mnts के संबंधी और मंझला भागों delimitates। बॉक्स संरचनाओं photomicrographs (बी 1 और बी 2) से यह साफ दिखाता है। (बी) Photomicrographs सी / mnts स्तर में normoxia (बी 1। नियंत्रण, काले फ्रेम) या हाइपोक्सिया के तहत (बी 2। नीले फ्रेम) पर (X100) का प्रदर्शन किया। काला तीर सी FOS पॉजिटिव कोशिकाओं दिखा। (सी) normoxia (काली पट्टी) में या हाइपोक्सिया (नीली पट्टी) के तहत ग / mnts स्तर पर खंड के अनुसार सी-FOS पॉजिटिव कोशिकाओं का मतलब संख्या दिखा हिस्टोग्राम। मान के रूप में मतलब ± एसडी व्यक्त कर रहे हैं। * Normoxia और हाइपोक्सिया मूल्यों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है - छात्र unpaired टी परीक्षण; *** पी <0.001। सीसी: रीढ़ की हड्डी के केंद्रीय नहर; सी / mnts:। नाभिक Tractus solitarius के संबंधी और मंझला भागों यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1 Immunohistological प्रक्रिया। CF के कालानुक्रमिक कदमओएस प्रक्रिया। अब-मैं, प्राथमिक एंटीबॉडी; अब-द्वितीय, माध्यमिक एंटीबॉडी; बीएसए, गोजातीय सीरम albumin; थपका, 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride; नी, निकल अमोनियम सल्फेट; पीबीएस 0.1 एम, 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (7.4 पीएच); PBST, 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा के साथ पूरक 0.3% ट्राइटन X-100; सीरम, माध्यमिक एंटीबॉडी उत्पादन के लिए इस्तेमाल प्रजातियों से सीरम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सी-FOS एक तत्काल जल्दी जीन है, और अपने उत्पाद का पता लगाने, सी-FOS प्रोटीन, प्रतिष्ठित न्यूरोनल विवो 11,13,25,28 में विशिष्ट सांस की प्रतिक्रियाओं में शामिल आबादी की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है और पूर्व vivo 16-18, 27,32,33।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

छिड़काव चरण के दौरान सावधान रहें। 4% पीएफए ​​समाधान अच्छी तरह से तैयार रहना चाहिए और निर्धारण और बाद के निर्धारण कदम काफी लंबे समय इष्टतम टुकड़ा करने की क्रिया और धुंधला प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए। इसके अलावा, रहस्योद्घाटन प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम है; धुंधला की तीव्रता पृष्ठभूमि शोर से बचने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए।

मौजूदा तरीकों के लिए सम्मान के साथ तकनीक और महत्व के लाभ

हालांकि कुछ न्यूरॉन्स, मुझे सी-FOS जीन 5 व्यक्त करने के लिए यह नहीं लगतीThod निर्धारित करने के लिए तंत्रिका रास्ते रासायनिक चुनौतियों के दौरान सक्रिय, सांस की लय रूपांतर में उदाहरण के लिए उपयोगी साबित हुई किया गया है। अन्य तत्काल जल्दी जीन की तुलना में, सी-FOS एक परीक्षण स्थिति 6 के तहत neuronal गतिविधि के आसान मात्रा का ठहराव की अनुमति है, उत्तेजना के अभाव में एक कम अभिव्यक्ति है।

सी-FOS का पता लगाने के एक सेलुलर तकनीक है कि आदेश में neuronal कई उत्तेजनाओं के जवाब में शामिल आबादी का विश्लेषण करने में गतिविधि में वैश्विक परिवर्तन को इंगित करता है। एक electrophysiological दृष्टिकोण है, जो समय की चिंताओं केवल एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र में कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के अधिकांश, सी-FOS का पता लगाने के एक परमिट का उपयोग कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में गतिविधि के परिवर्तन की सराहना करते हैं और इसलिए करने के लिए सक्रिय परिभाषित करने के लिए neuronal गतिविधि विश्लेषण के साथ तुलना में पूरे सीएनएस में क्षेत्रों। सी-FOS का पता लगाने के अनर्गल और जाग जानवरों के साथ आसानी से संगत है, जो electr द्वारा neuronal गतिविधि रिकॉर्डिंग के दौरान मामला नहीं हैophysiology। यह एक फायदा है क्योंकि यह तनाव और प्राप्त परिणामों के साथ anesthetics के हस्तक्षेप से बचा जाता है।

पूर्व vivo, हम उत्तेजना के एक 30 मिनट की अवधि का इस्तेमाल किया। यह पहले से दिखाया गया था कि इस उत्तेजना न्यूरोनल स्तर 34-36 में सी-FOS अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। उत्तेजना के पांच मिनट सी FOS अभिव्यक्ति में परिवर्तन है, जो 15 से 20 मिनट 37 की एक अव्यक्त अवधि के बाद मनाया जाता प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं। सी-FOS अभिव्यक्ति में संबंधित बढ़ जाती है उत्तेजना के पहले 10 मिनट के दौरान गतिविधि लेने के स्थान में परिवर्तन से संबंधित हैं।

तकनीक की सीमाएं

उत्तेजना के बाद, एक देरी नाभिक में सी-FOS के संचय से पहले आवश्यक है। लगभग 30 मिनट की इस देरी mRNA और प्रोटीन संश्लेषण से मेल खाती है। इस मद के परिणामों के तुरंत्ता कि obta हो सकता है का विरोध किया हैइलेक्ट्रोफिजियोलॉजी साथ न्यूरॉन्स की गतिविधियों को रिकॉर्ड करके ined। यह एक विशिष्ट और क्षणिक उत्तेजना के बाद neuronal गतिविधि में तेजी से बदलाव के बारे में जानकारी का एक नुकसान हो सकता है।

के रूप में सी-FOS प्रोटीन 100 मिनट 4 करने के लिए 90 वर्ष की एक आधा जीवन हो सकता है, इसकी अभिव्यक्ति शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं या अपने वातावरण में पशु के हेरफेर, इसकी बाधा, या परिवर्तन के साथ जुड़े तनाव से प्रभावित किया जा सकता है। इस प्रकार, यह जोड़तोड़ कि neuronal गतिविधि में परिवर्तन का अध्ययन प्रोत्साहन से संबंधित नहीं उत्पन्न कर सकता है और शारीरिक प्रोत्साहन के अंत के बाद तुरंत ऊतक के नमूने प्रदर्शन करने के लिए कम से कम करने के लिए आवश्यक है।

संशोधन और तकनीक की समस्या निवारण

इस प्रोटोकॉल में, रहस्योद्घाटन कदम के लिए एक समाधान है कि निहित 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride, निकल अमोनियम सल्फेट, और हाइड्रोजन पेरोक्साइड का इस्तेमाल किया है, लेकिन peroxydase के लिए वाणिज्यिक किट अल सकता हैइसलिए इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture plate 12-well Costa 35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane Corning 3477 The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) Santa Cruz Biotechnology sc-52
Vectastain Elite ABC KIT  Vector laboratories PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O Sigma 71505
Na2HPO4 Sigma S7907
Paraformaldehyde Sigma P6148
NaOH 0.1N Sigma 43617
Polyvinyl-Pyrrolidone Sigma PVP-360
Sucrose Sigma S7903
NaCl Sigma S7653
Ethylene-glycol Sigma 33068
Triton X100 Sigma T8787
Trisma HCl Sigma T5941
Trisma Base Sigma T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride  Rockland DAB50
Nickel ammonium sulphate Alfa Aesar 12519
H2O2 Sigma H1009
Xylene Sigma 33817
Entellan Neo Merck Millipore 107961
Slide  Thermo-scientific 1014356190 Superfrost ultraplus
Cover glass Thermo-scientific Q10143263NR1 24 x 60mm
BSA Sigma A2153

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 110 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सी-FOS प्रोटीन तत्काल जल्दी जीन immunohistochemistry neuronal मार्कर प्रतिलेखन कारक
सी-FOS प्रोटीन Immunohistological जांच: एक उपयोगी उपकरण केंद्रीय रास्ते विशिष्ट शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल की एक मार्कर के रूप में<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; पूर्व विवो</em
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Perrin-Terrin, A. S., Jeton, F.,… More

Perrin-Terrin, A. S., Jeton, F., Pichon, A., Frugière, A., Richalet, J. P., Bodineau, L., Voituron, N. The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo. J. Vis. Exp. (110), e53613, doi:10.3791/53613 (2016).

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