Abstract
Muitos estudos buscam identificar e mapear as regiões cerebrais envolvidas na regulamentação fisiológicas específicas. As c-fos proto-oncogene, um gene precoce imediato, é expresso em neurónios em resposta a vários estímulos. O produto proteico pode ser facilmente detectada com técnicas de imuno-histoquímica que levam à utilização de detecção de c-fos para mapear grupos de neurónios que exibem alterações na sua actividade. Neste artigo, nós nos concentramos na identificação de populações de tronco cerebral neuronal envolvidos na adaptação ventilatória à hipoxia ou hipercapnia. Duas abordagens foram descritas para identificar populações neuronais envolvidos in vivo em animais e ex vivo em preparações do tronco cerebral desaferentada. In vivo, os animais foram expostos a misturas de gases hipercápnicos ou hipóxicos. Ex vivo, preparações desaferentada foram superfused com hipóxica ou fluido cerebrospinal artificial hipercápnica. Em ambos os casos, tanto em animais de controlo in vivo ou ex preparações in vivo foram mantidas sob condições de normóxia e normocápnicos. A comparação destas duas abordagens permite a determinação da origem da activação neuronal ou seja, periférica e / ou central. In vivo e ex vivo, tronco cerebral foram recolhidas, fixadas e cortado em secções. Uma vez que as secções foram preparados, a detecção imuno-histoquímica da proteína de c-fos foi feito a fim de identificar os grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos de hipoxia ou hipercapnia. As células marcadas foram contadas em estruturas respiratórios no tronco cerebral. Em comparação com a condição de controle, hipoxia ou hipercapnia aumentou o número de c-fos células marcadas em vários locais do tronco cerebral específicas que são, portanto, constitutiva dos percursos neuronais envolvidas na adaptação do impulso respiratório central.
Introduction
O gene c-fos foi identificado pela primeira vez no início de 1980 a 1,2 e o seu produto foi caracterizado em 1984 como uma proteína nuclear que tem propriedades do gene activador de 3,4. Participa em mecanismos de longo prazo associados com estimulação neuronal. Com efeito, as mudanças na actividade neuronal levar ao segundo mensageiro cascatas de sinalização que induzem a expressão do gene precoce imediato c-fos, que induz a produção do factor de transcrição de c-fos. O último inicia a expressão de genes tardios e assim participa em respostas adaptativas do sistema nervoso para muitos tipos diferentes de estímulos 4. Assim, desde o final de 1980 5,6, detecção de proteína c-Fos tem sido frequentemente utilizada para estudar os efeitos de factores externos sobre a transcrição de genes, em geral, e 4 sobre a actividade do sistema nervoso central (CNS) para o mapeamento de vias neuronais envolvido na fisiológico diferentecondições al.
A expressão de c-fos basal foi estudado em várias espécies, incluindo ratos, ratazana, gato, macaco, humano e 4. Assim, a cinética da sua expressão é relativamente bem conhecidos. A activação da transcrição é rápida (5 a 20 min) 7,8, e a acumulação de ARNm atinge um máximo entre 30 e 45 min após o início da estimulação 9 e diminui com um semi-vida curta de 12 minutos. A síntese de proteína c-Fos seguinte acumulação de ARNm e pode ser detectado por imuno-histoquímica em 20 a 90 min após a estimulação 6.
Análise da expressão de c-fos é classicamente usado em estudos in vivo para identificar a rede respiratório central envolvida nas respostas ventilatórios a hipoxia ou hipercapnia 10-14. Mais recentemente, esta ferramenta também foi usado em preparações do tronco cerebral ex vivo para explorar adaptações rede respiratórias centrais à hipoxia ou hypercapnia 15-18. Com efeito, estas preparações gerar uma atividade rítmica classicamente assimilado ao comando central da respiração 19. Assim, este tipo de preparação tem a vantagem de ser totalmente desaferentada, e, portanto, os resultados relativos a expressão de c-fos só refletem as consequências de uma estimulação central sem qualquer intervenção de estruturas periféricas.
A detecção de c-fos podem ser feitos por métodos de imuno-histoquímica ou immunohistofluorescence. imunodetecção indirecta que requer a utilização de um anticorpo primário contra o c-Fos e um anticorpo secundário dirigido contra as espécies em que foi produzido o anticorpo primário. Para o método de imuno-histoquímica, o anticorpo secundário é conjugado com uma enzima (peroxidase de, por exemplo) que actua sobre um substrato (H 2 O 2 para a peroxidase). O produto da reacção enzimática é desenvolvido por um cromogénio (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), que cora ele e pode ser observada através de microscopia óptica. A reacção pode ser reforçado usando sulfato de níquel de amónio. Estes métodos permitem a detecção de substâncias activas neurónios durante diferentes desafios fisiológicos e, por conseguinte, a identificação e / ou o mapeamento de vias periféricas e centrais envolvidos nas respostas fisiológicas consecutivos.
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Protocol
Nota: A detecção de c-fos é um procedimento normalizado que envolve vários passos (Figura 1). Todas as experiências foram realizadas em ratos ou ratinhos. protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal Charles Darwin (CE5 / 2011/05), feito de acordo com a directiva de 22 de setembro de 2010 (2010/63 / UE) para o cuidado animal, Conselho das Comunidades Europeias e conduzida de acordo com as leis francesas para o cuidado animal.
1. Preparação de Soluções
- Preparar tampão fosfato de sódio 0,2 M: adicionar 6,24 g de NaH 2 PO 4 * 2H 2 O e 22,56 g de Na 2 HPO 4 * H 2 O a 1 L de água destilada com agitação.
- Prepare a 4% de paraformaldeído (PFA): adiciona-se 20 g de PFA a 150 ml de água destilada. Aquece-se a solução para 80 ° C enquanto se agitava. Para clarificar a solução, reduzem o calor e adicionar 1 ou 2 gotas de NaOH 1 N para ajudar a dissolver o paraf ormaldeído. Completar a 250 mlcom água destilada e adicionar 250 mL de tampão fosfato 0,2 M (pH 7,4). Armazenar a 4 ° C. Tome cuidado apropriado ao usar esses reagentes. Manusear com luvas, jaleco e óculos de segurança sob um capuz químico.
Nota: Prepare 4% PFA no dia antes das perfusões. Determinar o volume de PFA a 4% como uma função da idade, do número e espécies de animais. - Preparar a solução de crioprotector: Em 250 ml de 0,2 M de solução salina tamponada com fosfato, mistura 5 g de polivinil-pirrolidona, 150 g de sacarose e 2,5 g de cloreto de sódio. Após dissolução completa, adicionar 150 ml de etileno glicol e ajustar a 500 ml com água destilada. Guardar a solução crioprotectora a 4 ° C.
- Prepare a 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS): adicionar 18 g de NaCl para 1 L de água destilada com agitação. Após dissolução completa, adicionar 1 L de 0,2 M de tampão de fosfato de sódio.
- Prepare salina tamponada com fosfato suplementada com 0,3% de Triton X100 (PBST): Adicionar 3 ml de Triton X100 a 997 mL de PBS.
- Prepare 0,05 M de tampão Tris (pH 7,6): adicionar 3,03 g de Tris-cloridrato e 0,70 g de base Tris em 500 ml de água destilada, enquanto se agitava.
- Prepare soro de cabra a 2% em PBST: para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 600 ul de soro de cabra a 30 mL de PBST e misturar bem. Adicionar 2,5 ml por poço.
Nota: Os soros utilizados devem ser provenientes de espécies utilizadas para a produção de anticorpo secundário - Prepare anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos (1: 4000, SC-52) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 75 mg de albumina de soro de bovino e 30 mL de PBST e misturar bem. Em seguida, adicionar 7,5 mL de anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos.
- Prepare anticorpo de cabra biotinilado anti-coelho (1: 500) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 75 mg de albumina de soro de bovino e 30 mL de PBST e misturar bem. Em seguida, adicione60 ul de anticorpo anti-coelho de cabra biotinilado.
- Prepara-avidina-biotina peroxidase de complexo (1: 250) em PBST (solução ABC). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 120 ul de reagente A e 120 ul de reagente B em 30 mL de PBST e misturar bem.
Nota: ABC solução deve ser preparada, pelo menos, 30 min antes da utilização. - Preparar a solução de substrato. Imediatamente antes da utilização, preparação da solução como se segue (para uma placa): adiciona-se 20 mg de sulfato de amónio de níquel e 10 mg de tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina a 50 ml de tampão Tris. Filtrar e proteger da luz. Adicionar 2,0 ml por poço. Na solução restante (25 ml) adicionar 17 ul de H 2 O 2 (H 2 O 2 solução a 30% em H 2 O). Adicionar 2,0 ml por poço.
Nota: Cuidados adequados devem ser tomados ao usar esses reagentes. Manusear com luvas e jalecos.
2. c-fos Induction e Processamento de tecido in vivo
Nota: As experiências foram realizadas em ratos (Sprague Dawley) ou ratinhos (C57BL / 6).
- Colocar os animais numa caixa estanque ao ar ventilado com uma mistura de gás hipóxico (O 2 8% N equilibrada 2) ou hipercápnico (CO 2 a 4%, O 2 21% N equilibrada 2) durante 2 h (figura 2A).
- Anestesiar os animais com injecção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg). Perfundir a transcardialmente animal com PFA a 4% 20. Manusear com cuidado e use luvas sob um capuz químico.
- Após a perfusão, dissecar o cérebro 20 e mergulhá-lo em 7 ml de 4% de PFA em um tubo de 15 ml durante 48 h a 4 ° C. Em seguida, retire o cérebro de PFA e mergulhar completamente na solução de crioprotector. Armazenar a -18 ° C (Figura 3). Elimine o resto do corpo do animal pelo pa-processamento adequado de lixothway.
Nota: crioproteção é um passo entre PFA fixação e congelamento. Isso reduz a formação de cristais de gelo nas células com uma solução cujo congelamento irá estar em forma amorfa. As amostras fixadas deve ser impregnado na solução de crioprotector (preparado no passo 1.3) durante pelo menos 24 horas a 4 ° C. Manusear com cuidado e luvas sob o capô química.
3. indução e Tissue c-fos Processamento Ex Vivo
Nota: Os experimentos foram realizados em apenas ratos ou camundongos recém-nascidos.
- Isolar o SNC, tal como descrito por Suzue 19. Colocá-lo numa câmara de registo e superfuse-lo continuamente com fluido cérebro-espinal artificial, a uma taxa de 7,5 ml / min a 26 ° C 21 (aCSF: em mM: 130.0 NaCl, 5,4 de KCl, 0,8 de CaCl2, 1,0 de MgCl2, 26,0 NaHCO3, 30,0 D-glucose, saturada com O2 e ajustada para pH 7,4 por gaseificação com 95% de O2 e 5% De CO 2) (Figura 2B).
- Substituir o aCSF com aCSF (mesma composição borbulhado com 95% de N2 e 5% de CO 2, pH 7,4) oxigenado por hipoxia, ou por um aCSF acidificada (padrão aCSF com NaHCO3 reduzida para 10,0 mM, borbulhado com 95% de O 2 e 5% de CO 2) para hipercapnia. Aplicar a estimulação durante 30 min (Figura 2B).
- Ex vivo, após o período de indução, a transferência do SNC de ratos recém-nascidos ou ratos em 2,5 ml de 4% de PFA em um tubo de 2,5 ml, durante 48 h e armazenar a -18 ° C numa solução de crioprotector a uma utilização posterior (Figura 3).
Nota: Ex vivo, não é necessário para perfundir animais. Um estudo anterior sugere que pequenas amostras medindo menos de 10 mm de diâmetro pode ser fixado por simples difusão 22. Uma taxa de penetração citado (distância, em mm, para a difusão fixador no tecido) para aldeído é 2 ou 3 mm / h.4. tronco cerebral Seccionamento
Nota: A partir deste passo para o fim, o protocolo é estritamente o mesmo para induções in vivo e ex vivo.
- Antes de cortar, colocar um poço individual inserir numa placa de 12 poços e adicionar 2,5 ml de PBS em cada poço.
- Faça cortes coronais em série (40 pm) do tronco cerebral com um criostato e recolhê-las na placa de 12 poços. Para todo o tronco cerebral adulto, fazer cerca de 70 fatias (Figura 3).
Nota: É possível tecido secção a partir de vários animais em paralelo em uma placa.
5. Procedimentos imuno-histológicos (Tabela 1)
Nota: Durante todo o procedimento, as secções permanecem nas inserções bem.
- Dia 1 - destruição endógena actividade de peroxidase, local do bloqueio da ligação não-específica, e a incubação com o anticorpo primário (Figura 4)
- lavaras secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
- Suprimir a actividade da peroxidase endógena por incubação das secções coronais de 30 min à temperatura ambiente com peróxido de hidrogénio H 2 O 2, 3% em PBS 0,1 M (2,5 ml por poço).
- Lavam-se as secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
- Bloquear o sítio de ligação não específica por incubação das secções coronais de 1 h à temperatura ambiente com soro de cabra (2%) em PBST.
- Incubar as secções coronais de 48 h a 4 ° C com um anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos (1: 4000, SC-52,) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%) (2,5 ml por poço).
- Dia 3 - Incubação com anticorpo e o desenvolvimento de uma reacção de cor secundária (Figura 4)
- Lavam-se as secções durante 10 min com PBS 0,1 M, à TA (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
- incubar asecções coronais de 1 h à RT com um anticorpo de cabra biotinilado anti-coelho (1: 500) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%) (2,5 ml por poço).
Nota: O investigador pode também utilizar um anticorpo secundário acoplado a uma sonda fluorescente, nesta fase. Neste caso, o protocolo de parar nesta fase e examinar directamente utilizando um microscópio de fluorescência. - Lavam-se as secções durante 10 minutos com PBST à TA (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
- Incubar as secções coronais de 1 h com uma biotina-avidina-peroxidase de complexo (1: 250) em PBST (2,5 ml por poço).
- Lavam-se as secções durante 10 minutos com PBST à TA (2,5 ml por poço). Repita 2 vezes.
- Lavam-se as secções durante 10 minutos com 0,05 M de tampão Tris à TA (2,5 ml por poço). Repita 2 vezes.
- Incubar as secções coronais com 0,02% de tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina, sulfato de níquel de amónio a 0,04% e 0,01% de peróxido de hidrogénio em Tris-tampão 0,05 (pH 7,6) umat RT (2,0 ml por poço). Na solução restante (25 ml) adicionar 17 ul de H 2 O 2 (H 2 O 2 solução a 30% em H2O) (2,0 ml por poço).
Nota: O investigador deve determinar o tempo de desenvolvimento em microscópio de luz. No entanto, de 5 a 10 min proporciona uma boa intensidade de coloração. - Quando intensidade de coloração é o ideal (controlada sob microscópio de luz, ver Figura 5 e Figura 6), parar a reacção por lavagem das secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 4 vezes. Em seguida, as secções lavar com água destilada.
- Amostragem de montagem (manusear com cuidado e luvas sob o capô química)
- seções de montagem em série de slides e ar seco. Para isso, espalhou cuidadosamente as seções, a fim rostro-caudal com escovas nos slides. Identificam as lâminas de acordo com as amostras.
- Desidratam com al absolutacohol: mergulhe as lâminas durante 30 segundos à temperatura ambiente no banho de álcool absoluto. Repita duas vezes.
- Limpar com xileno: mergulhe as lâminas em banho de xileno por 3 min a RT. Repita duas vezes.
- Lamela as lâminas com meio de montagem. Para isso, aplique 5 gotas de meio de montagem no slide e, em seguida, aplicar a tampa de vidro por expulsar as bolhas de ar. Ar seco por 48 horas.
6. Dados e Análise Estatística
- Examine seções sob um microscópio de luz. Visualmente contagem dos neurônios FLI em grande aumento (200x), utilizando pontos de referência padrão 23,24. A coloração pontual de c-fos é localizada nos núcleos de neurónios.
- Para cada zona analisada, contar o número de células de c-fos-positiva por secção e comparar o número médio entre as condições de controlo e estimuladas. Dependendo da normalidade dos dados, usar o teste t de Student desemparelhado ou o teste de Mann-Whitney. As diferenças foram consideradas significativas se P0; 0,05. Traça-se a distribuição de neurónios FLI num desenho (100x), utilizando um tubo de desenho anexado ao microscópio e fotografados com uma câmara digital (Figura 5).
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Representative Results
A detecção de c-fos é uma ferramenta útil que permite que os grupos de identificação de células activadas sob condições específicas, tais como a hipoxia e hipercapnia in vivo (Figura 2A) ou em situações que mimetizam estas condições ex vivo (Figura 2B). In vivo, o recém-nascido, jovem ou roedores adultos foram colocados numa caixa estanque ao ar, em que o meio gasoso é continuamente renovada por uma mistura gasosa com uma composição definida com precisão, durante 30 a 180 minutos 13,25,26 (Figura 2A). Como a estimulação actua sobre o corpo inteiro, a alteração relacionada em c-fos podem reflectir ambas as vias activadas centrais e periféricos. Ex vivo, preparações desaferentada contendo o bulbo e medula espinhal foram colocados numa câmara de forma contínua superfundidas com uma aCSF com diferentes níveis de O 2 ou pH, a fim de modelar hipóxicos ou hipercápnicos condições (
O SNC foi fixada com PFA, quer por perfusão através da circulação sistémica in vivo, ou por uma imersão ex vivo (Figura 3). Devido a esta diferença, a difusão é mais fixador ex vivo que in vivo. Assim, o sinal de c-fos podem ser afectados, particularmente em estruturas profundas. No entanto, porque a análise de c-fos é sempre realizada em uma abordagem comparativa entre o controlo e estimuladas in vivo em animais ou preparações ex vivo, esta diferença não iria interferir com os resultados de uma comparação rigorosa de controlo e estimuladas dados. Depois disso, o CNS foi crioprotegido, seccionados, e engajados na immunohistochemical procedimento (Figura 3, Figura 4). Desta forma, algumas áreas do tronco cerebral respiratórias foram identificadas in vivo como modificar a sua actividade sob hipóxia e hipercapnia ou desafios, incluindo o núcleo retrotrapezoid (RTN), que é o principal local central de CO 2 quimiorecepção 10,13,28,29, o medula ventrolateral (VLM), que contém o gerador de ritmo inspiratório 13, o comissural e suas partes medianas do tractus solitarius núcleo (C / MNTS), que são as áreas de projecção da entrada de corpos carótidas 13,25,26,30 (Figura 5 ), e os núcleos da rafe medulares 12,13.
Ex vivo, em condições desaferentada, neurónios do RTN e o VLM foram descritos para alterar a sua imunorreactividade de c-fos em condições de reduzida ó fevereiro 16-18. O c-FOS detecção podem também ser combinados com outras detecções de imuno-histoquímica para caracterizar o fenótipo das células activadas 14,31
Figura 1. Design Estudo para o uso de C-FOS Detecção para mapear a estruturas neurais envolvidas na Adaptações respiratórias à hipóxia ou hipercapnia. Etapas cronológicas da técnica de detecção de c-Fos no sistema nervoso central. CNS: Sistema Nervoso Central; IHC:. Imunohistoquímica Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. C-fos indução. (A) in vivo Protocolo de indução. Um animal foi colocado em um c herméticaHamber e expostas quer a ar (21% de O2; 79% N 2) de gás; (2 90% N 10% de O 2), hipercápnico (21% de O2;; 4% de CO 2 75% N 2), ou hipóxico mistura durante 2 horas. (B) Ex vivo protocolo de indução. CNS foi dissecada a partir de roedores recém-nascidos com idade entre 0 a 4 dias. Medulla oblongata e medula espinhal foram isolados sob ampliação para obter os preparativos. Eles foram colocados numa câmara com a superfície ventral para cima, de frente, superfundidas com aCSF (pH 7,4), a 26 ± 1 ° C. Modelando estimulação hipóxica in vivo foi realizada por meio da redução da fracção de O2 no aCSF fazendo borbulhar uma mistura gasosa contendo 95% anóxica N2 e 5% de CO 2. Modelando hipercápnico estimulação in vivo foi realizada utilizando um ácido aCSF que diferiam aCSF normal em termos de concentração de NaHCO 3 (redução). O aCSF de ácido é saturada com O2 e ajustÃsted para pH 7,23 por borbulhamento com 95% de O2 e 5% de CO 2. Cada condição de estimulação foi aplicada durante 30 minutos. aCSF:. líquido cefalorraquidiano artificial Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Sistema Nervoso Central amostragem. In vivo, o CNS foi obtido por meio de dissecção após o procedimento fixador usando 4% de paraformaldeído perfundido através do sistema vascular. Ex vivo, directamente no SNC foi imerso em paraformaldeído a 4% após a dissecação. Subsequentemente, o CNS foi crioprotegidos por imersão numa solução de crioprotector e cortados em secções coronais de 40 um de espessura, utilizando um criostato. As secções rostro-caudal da medula foram colocadas numa placa de 12 poços contendo PBS antes da suae procedimentos de imuno-histoquímica. CNS: Sistema Nervoso Central; PBS:. Phosphate-Buffered Saline Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os procedimentos imuno-histoquímicos indirectos. As secções foram primeiro incubadas com um anticorpo primário de coelho policlonal contra a proteína de c-fos. Depois disso, eles foram tratados com um anticorpo secundário anti-coelho de cabra biotinilado contra o anticorpo primário. Após esta incubação, as secções foram tratadas com um complexo de avidina-biotina-peroxidase, que se liga fortemente ao anticorpo secundário para amplificar o sinal. Com efeito, o complexo contém várias moléculas de peroxidase que conduzem a uma elevada intensidade de coloração. Finalmente, as secções foram coradas utilizando uma solução de 3,3-DIAMINtetracloridrato obenzidine e sulfato de níquel de amônio, que produz um precipitado cinzento escuro na presença da enzima peroxidase. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. neurônios c-Fos-positivos sobre secções do bulbo em ratos controle e ratos submetidos à hipoxia in vivo. (A) Desenho de uma seção da medula oblonga adaptado de Paxinos e Franklin 24 (bregma -7, 48 mm ). A área pontilhada delimita as partes comissurais e medianos dos núcleo do trato solitário c / mnts. A caixa ilustra as estruturas ilustradas por fotomicrografias (B1 e B2). (B) Photomicrographs realizada (x100) no c / mnts nível em normoxia (B1. controle, quadro preto) ou sob hipóxia (B2. blue frame). As setas pretas mostram as células de c-fos-positiva. (C) Histograma mostrando o número médio de células c-Fos-positivos por seção na c / nível mnts em normoxia (barra preta) ou sob hipóxia (barra azul). Os valores são expressos como média ± DP. * Indica uma diferença significativa entre normóxia e hipóxia valores - teste não pareado t de Student; *** P <0,001. CC: canal central da medula espinhal; c / mnts:. peças comissurais e medianos da núcleo do trato solitário Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Processo imuno. Etapas cronológicas da FCprocedimento OS. Ab-I, anticorpo primário; Ab-II, o anticorpo secundário; BSA, albumina de soro bovino; DAB, tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina; Ni, sulfato de amónio de níquel; PBS 0,1 M, 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4); PBST solução salina, 0,1 M de fosfato tamponado suplementado com 0,3% de Triton X-100; Soro, soro de espécies utilizadas para a produção de anticorpos secundária. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
C-fos é um gene precoce imediato, e a detecção do seu produto, a proteína c-Fos, é classicamente usado para identificar populações neuronais envolvidas em respostas respiratórias específicas in vivo e ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33.
Passos críticos dentro do protocolo
Tenha cuidado durante a etapa de perfusão. A solução PFA 4% deve ser bem preparado e os passos de fixação e de pós-fixação deve ser longa o suficiente para obter o corte e coloração ideal. Além disso, a revelação é a etapa mais importante do processo; a intensidade da coloração deve ser controlada para evitar o ruído de fundo.
Vantagens da técnica e significativas relativamente a métodos existentes
Embora alguns neurónios não parecem expressar o gene c-fos 5, este meTHOD tem provado ser útil para determinar as vias neurais ativadas, por exemplo, na adaptação do ritmo respiratório durante desafios químicos. Em comparação com outros genes precoces imediatos, c-fos tem uma expressão baixa na ausência de estimulação, permitindo uma fácil quantificação da actividade neuronal sob uma situação de teste 6.
A detecção de c-fos é uma técnica celular que indica as alterações globais na actividade, a fim de analisar as populações neuronais envolvidas em resposta a vários estímulos. Em comparação com a análise de actividade neuronal, utilizando uma abordagem electrofisiológico, que a maioria das preocupações vez apenas um pequeno número de células em uma área do cérebro definido, a detecção de c-fos permite que se apreciar as alterações de actividade de um grande número de células e, portanto, para definir activa áreas em todo o CNS. detecção de C-FOS é facilmente compatível com os animais sem restrições e desperto, que não é o caso durante a gravação de atividade neuronal por electrophysiology. Esta é uma vantagem porque evita o stress e a interferência de anestésico com os resultados obtidos.
Ex vivo, foi utilizado um período de 30 min de estimulação. Foi anteriormente demonstrado que esta estimulação é suficiente para induzir alterações na expressão de c-fos ao nível neuronal 34-36. Cinco minutos de estimulação são suficientes para induzir alterações na expressão de c-fos, que são observados depois de um período de latência de 15 a 20 min 37. Os aumentos relacionados com a expressão de c-fos estão relacionadas com alterações na actividade a ter lugar durante os primeiros 10 minutos de estimulação.
Limitações da técnica
Após a estimulação, um atraso é necessário antes da acumulação da proteína c-fos no núcleo. Este atraso de cerca de 30 min corresponde ao ARNm e a síntese de proteínas. Este artigo se opõe ao imediatismo dos resultados que podem ser obtainada gravando a atividade dos neurônios com eletrofisiologia. Isso pode causar uma perda de informações sobre as rápidas mudanças na atividade neuronal após um estímulo específico e transitório.
Como a proteína de c-fos podem ter uma meia-vida de 90 a 100 min 4, a sua expressão pode ser afectada pelos procedimentos cirúrgicos ou de stress associados com a manipulação do animal, a sua restrição, ou alterações no seu ambiente. Assim, é necessário minimizar as manipulações que podem induzir alterações na actividade neuronal não relacionados com o estímulo estudado e para executar amostragem de tecido imediatamente após o fim do estímulo fisiológico.
Modificações e resolução de problemas da Técnica
Neste protocolo, a etapa de revelação usada uma solução que continha tetracloridrato de 3,3 diaminobenzidina, sulfato de amónio níquel, e peróxido de hidrogênio, mas os kits comerciais para peroxidase poderia alpor isso ser utilizado para este passo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
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