Abstract
Mange undersøgelser søge at identificere og kortlægge områder af hjernen, der er involveret i specifikke fysiologiske regler. Proto-onkogen c-fos, en umiddelbart tidlig gen, udtrykkes i neuroner som reaktion på forskellige stimuli. Proteinproduktet kan let detekteres med immunhistokemiske teknikker fører til anvendelsen af c-fos detektion til kort grupper af neuroner, der viser ændringer i deres aktivitet. I denne artikel, vi fokuseret på identifikation af hjernestamme neuronal befolkninger er involveret i ventilatorisk tilpasning til hypoxi eller hyperkapni. To tilgange blev beskrevet at identificere involverede neuronale populationer in vivo i dyr og ex vivo i deafferented hjernestamme præparater. In vivo blev dyr udsat for Hyperkapni eller hypoxiske gasblandinger. Ex vivo blev deafferented præparater overhældt med hypoxiske eller Hyperkapni kunstig cerebrospinalvæske. I begge tilfælde, enten kontrol in vivo dyr eller ex vivo præparater blev holdt under normoxiske og normocapnic betingelser. Sammenligningen af disse to tilgange muliggør bestemmelse af oprindelsen af den neuronale aktivering dvs, perifer og / eller central. In vivo og ex vivo blev brainstems indsamlet, fast, og skåret i sektioner. Når sektioner blev fremstillet, blev immunhistokemisk detektion af c-fos-proteinet foretaget for at identificere hjernestammen grupper af celler aktiveret af hypoxiske eller Hyperkapni stimuleringer. Mærkede celler blev talt i hjernestamme respiratoriske strukturer. I sammenligning med kontrolgruppen tilstand, hypoxi eller hyperkapni øget antallet af c-FOS mærkede celler i flere specifikke hjernestamme websteder, der er således konstituerende for de nervebaner, der er involveret i tilpasningen af den centrale respiratoriske drev.
Introduction
Den c-fos-genet blev identificeret for første gang i begyndelsen af 1980 1,2 og dets produkt blev karakteriseret i 1984 som en nuklear protein, der har gen-aktivator egenskaber 3,4. Den deltager i langsigtede mekanismer forbundet med neuron stimulering. Faktisk ændringer i neuronal aktivitet føre til andre messenger signaleringskaskader, der inducerer ekspressionen af de umiddelbare tidlige gen c-fos, der inducerer produktionen af transkriptionsfaktoren c-fos. Sidstnævnte initierer ekspressionen af sene gener og dermed deltager i adaptive responser i nervesystemet til mange forskellige typer af stimuli 4. Således eftersom udgangen af 1980 5,6, c-fos-proteinet afsløring er ofte blevet anvendt til at undersøge virkningerne af eksogene faktorer på gentranskription generelt 4 og på aktiviteten af det centrale nervesystem (CNS) til kortlægning ud nervebaner involveret i forskellige fysiologiskeal forhold.
Basal c-fos udtryk er blevet undersøgt i forskellige arter, herunder mus, rotte, kat, abe og menneske 4. Derved kinetik sit udtryk forholdsvis velkendt. Transkriptionsaktiveringsdomæne er hurtig (5 til 20 min) 7,8, og mRNA akkumulering når et maksimum mellem 30 og 45 min efter indtræden af stimulering 9 og falder med en kort halveringstid på 12 min. C-FOS-proteinsyntese følger mRNA akkumulering og kunne påvises ved immunhistokemi på 20 til 90 minutter efter stimulering 6.
Analyse af c-fos-ekspression er klassisk anvendes i in vivo-undersøgelser for at identificere den centrale respiratorisk netværk involveret i ventilatoriske reaktioner på hypoksi eller hyperkapni 10-14. For nylig blev dette værktøj også brugt i ex vivo hjernestamme forberedelser til at udforske centrale respiratoriske netværk tilpasninger til hypoxi eller hypercapnia 15-18. Faktisk er disse præparater generere en rytmisk aktivitet klassisk sidestilles med den centrale respiratoriske drev 19. Denne type præparat har således den fordel, at helt deafferented, og derfor resultater med hensyn c-fos udtryk kun afspejle konsekvenserne af en central stimulation uden indgriben af perifere strukturer.
C-FOS detektering kan foretages ved immunohistokemiske eller immunohistofluorescence tilgange. Indirekte immunpåvisning nødvendiggør anvendelsen af et primært antistof mod c-fos og et sekundært antistof rettet mod arter, hos hvilke det primære antistof blev produceret. For den immunhistokemiske metode er det sekundære antistof konjugeret med et enzym (peroxidase, for eksempel), der virker på et substrat (H 2 O 2 til peroxidase). Produktet fra den enzymatiske reaktion er udviklet af et chromogen (3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloride), der farver det og kan iagttages under lysmikroskopi. Reaktionen kan styrkes ved hjælp af nikkel ammoniumsulfat. Disse metoder muliggør påvisning af Actives neuroner under forskellige fysiologiske udfordringer, og derfor identifikation og / eller kortlægning af perifere og centrale involverede veje i de efterfølgende fysiologiske reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: c-fos påvisning er en standardiseret procedure, der omfatter flere trin (figur 1). Alle eksperimenter blev udført på rotter eller mus. Eksperimentelle protokoller blev godkendt af den etiske komité i dyreforsøg Charles Darwin (CE5 / 2011/05), sker i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af September 22, 2010 (2010/63 / EU) for dyr pleje, og udføres i overensstemmelse med franske love for dyr pleje.
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered 0,2 M natriumphosphat buffer: tilføj 6,24 g NaH 2 PO4 * 2H 2 O og 22,56 g Na 2 HPO 4 * H2O til 1 l destilleret vand under omrøring.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA): tilsættes 20 g PFA til 150 ml destilleret vand. Opvarm opløsningen til 80 ° C under omrøring. For at slette løsningen, reducere varmen og tilsæt 1 eller 2 dråber 1 N NaOH til at hjælpe paraformaldehyd opløses. Komplet til 250 mlmed destilleret vand, og der tilsættes 250 ml 0,2 M phosphatpuffer (pH 7,4). Opbevares ved 4 ° C. Træf passende forsigtig, når du bruger disse reagenser. Håndtag med handsker, kittel og beskyttelsesbriller under en kemisk hætte.
Bemærk: Forbered 4% PFA dagen før perfusioner. Bestem mængden af 4% PFA som funktion af alder, antal og arter af dyr. - Forbered kryobeskyttende opløsning: I 250 ml 0,2 M phosphat-pufret saltvand, blandes 5 g polyvinylpyrrolidon, 150 g saccharose og 2,5 g natriumchlorid. Efter fuldstændig opløsning tilsættes 150 ml ethylenglycol og juster til 500 ml med destilleret vand. den kryobeskyttende løsning ved 4 ° C opbevares.
- Forbered 0,1 M phosphatbufret saltvand (PBS): tilføj 18 g NaCl til 1 l destilleret vand under omrøring. Efter fuldstændig opløsning tilsættes 1 L 0,2 M natriumphosphatpuffer.
- Forbered phosphatpufret saltvand suppleret med 0,3% Triton X100 (PBST): Tilsæt 3 ml Triton X100 til 997 ml PBS.
- Forbered 0,05 M Tris-buffer (pH 7,6): tilføj 3,03 g Tris-hydrochlorid og 0,70 g Tris-base, til 500 ml destilleret vand under omrøring.
- Forbered 2% gedeserum i PBST: for én plade, forberede 30 ml opløsning. Tilsættes 600 pi gede-serum til 30 ml PBST og bland godt. Tilføj 2,5 ml per brønd.
Bemærk: Serum anvendes, skal stamme fra arter, der anvendes til sekundært antistof produktion - Forbered kanin polyklonalt antistof mod c-fos-proteinet (1: 4000, SC-52) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%). For én plade, forberede 30 ml opløsning. Tilføj 75 mg bovint serumalbumin til 30 ml PBST og bland godt. Derefter tilsættes 7,5 pi kanin polyklonalt antistof mod c-fos-proteinet.
- Forbered biotinyleret gede-anti-kanin-antistof (1: 500) i PBST med serumalbumin bovint (0,25%). For én plade, forberede 30 ml opløsning. Tilføj 75 mg bovint serumalbumin til 30 ml PBST og bland godt. Derefter skal du føje60 pi biotinyleret gede-anti-kanin-antistof.
- Forbered avidin-biotin-peroxidase-kompleks (1: 250) i PBST (ABC opløsning). For én plade, forberede 30 ml opløsning. Tilføj 120 pi reagens A og 120 pi reagens B til 30 ml PBST og bland godt.
Bemærk: ABC opløsning skal fremstilles mindst 30 minutter før brug. - Forbered substratopløsning. Umiddelbart før brug opløsningen tilberedes som følger (for én plade): tilsættes 20 mg af nikkel ammoniumsulfat og 10 mg 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid til 50 ml Tris-buffer. Filter og beskytte mod lys. Tilsæt 2,0 ml per brønd. I den resterende opløsning (25 ml) tilsættes 17 pi H 2 O 2 (H2O 2-opløsning 30% i H2O). Tilsæt 2,0 ml per brønd.
Bemærk: Passende pleje bør udvises forsigtighed ved brug af disse reagenser. Håndtag med handsker og kitler.
2. c-fos Induktion og Tissue Processing in vivo
Bemærk: Eksperimenter blev udført i rotter (Sprague Dawley) eller mus (C57BL / 6).
- Placer dyrene i en lufttæt boks ventileret med en hypoxisk (O 2 8% balanceret N2) eller Hyperkapni (CO 2 4%, O 2 21% balanceret N2) gasblanding i 2 timer (figur 2A).
- Bedøve dyret med intraperitoneal injektion af pentobarbital (100 mg / kg). Perfundere dyret transcardialt med 4% PFA 20. Håndtag med pleje og brug handsker under en kemisk hætte.
- Efter perfusion, dissekere hjernen 20 og nedsænkes i 7 ml 4% PFA i et 15 ml rør i 48 timer ved 4 ° C. Fjern derefter hjernen fra PFA og fordybe det helt i kryobeskyttende løsning. Opbevares ved -18 ° C (figur 3). Bortskaf resten af dyrets krop med den relevante affald-behandling pathway.
Bemærk: kryobeskyttelse er et skridt mellem PFA fiksering og frysning. Det reducerer dannelsen af iskrystaller i celler med en opløsning, hvis frysning vil være i amorf form. De faste prøver skal imprægneres i kryobeskyttende opløsning (fremstillet i trin 1.3) i mindst 24 timer ved 4 ° C. Håndtag med omhu og handsker under kemisk hætte.
3. c-fos induktion og Tissue Processing Ex Vivo
Bemærk: Eksperimenter blev udført i nyfødte rotter eller mus kun.
- Isoler CNS som beskrevet af Suzue 19. Placer den i en optagelse kammer og superfuse det kontinuerligt med kunstig cerebrospinalvæske med en hastighed på 7,5 ml / min ved 26 ° C 21 (aCSF: i mM: 130.0 NaCl, 5,4 KCI, 0,8 CaCl2, 1,0 MgCl2, 26,0 NaHCO3, 30,0 D-glucose; mættet med O2 og indstillet til pH 7,4 ved gasning med 95% O2 og 5% CO2) (figur 2B).
- Erstatte aCSF med en deoxygeneret aCSF (samme sammensætning boblet med 95% N2 og 5% CO2, pH 7,4) i hypoxi eller af et syrnet aCSF (standard aCSF med NaHCO3 reduceret til 10,0 mM, gennemboblet med 95% O2 og 5% CO2) for hyperkapni. Påfør stimulering i 30 minutter (Figur 2B).
- Ex vivo, efter induktionsperioden, overføre CNS hos nyfødte mus eller rotter i 2,5 ml 4% PFA i et 2,5 ml rør i 48 timer og opbevares ved -18 ° C i en kryobeskyttende opløsning til senere brug (figur 3).
Bemærk: Ex vivo, er det ikke nødvendigt at perfundere dyr. En tidligere undersøgelse viser, at små prøver måler mindre end 10 mm i diameter kan fastsættes ved simpel diffusion 22. En citerede sats for penetration (afstanden i mm, for fiksativ diffusion ind i vævet) for aldehyd er 2 eller 3 mm / t.4. Brainstem Sektionsinddeling
Bemærk: Fra dette trin til enden, protokollen er strengt den samme for in vivo og ex vivo induktioner.
- Før udskæring, placeres en individuel brønd indsætte i en plade med 12 brønde, og der tilsættes 2,5 ml PBS i hver brønd.
- Gør serielle kranssektioner (40 um) af hjernestammen med en kryostat og samle dem i 12-brønds plade. For hele voksen hjernestammen, gør omkring 70 skiver (figur 3).
Bemærk: Det er muligt at vævssnittet fra flere dyr i parallel i én plade.
5. Immunohistologiske procedurer (tabel 1)
Bemærk: Under hele proceduren, afsnittene forblive i godt skær.
- Dag 1 - Endogen peroxidaseaktivitet destruktion, ikke-specifikt bindingssted blokade, og inkubation med det primære antistof (figur 4)
- Vasksektionerne i 10 minutter med 0,1 M PBS ved stuetemperatur (2,5 ml per brønd). Gentages 3 gange.
- Undertryk den endogene peroxidase aktivitet ved inkubering af koronale sektioner for 30 minutter ved stuetemperatur med hydrogenperoxid H 2 O 2, 3% i 0,1 M PBS (2,5 ml per brønd).
- Vask sektionerne i 10 minutter med 0,1 M PBS ved stuetemperatur (2,5 ml per brønd). Gentages 3 gange.
- Blokering af den ikke specifikt bindingssted ved inkubering af koronale sektioner i 1 time ved stuetemperatur med gede-serum (2%) i PBST.
- Inkubér kranssektioner i 48 timer ved 4 ° C med et kanin polyklonalt antistof mod c-fos-proteinet (1: 4000, SC-52,) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%) (2,5 ml per brønd).
- Dag 3 - Inkubation med sekundært antistof og udvikling af en farvereaktion (figur 4)
- Vask sektionerne i 10 minutter med PBS 0,1 M ved stuetemperatur (2,5 ml per brønd). Gentages 3 gange.
- Inkubérkranssektioner i 1 time ved stuetemperatur med et biotinyleret gede-anti-kanin-antistof (1: 500) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%) (2,5 ml per brønd).
Bemærk: Investigator kan også anvende et sekundært antistof koblet til en fluorescerende probe i denne fase. I dette tilfælde stoppe protokollen på nuværende tidspunkt og undersøge direkte under anvendelse af et fluorescensmikroskop. - Vask sektionerne i 10 minutter med PBST ved stuetemperatur (2,5 ml per brønd). Gentages 3 gange.
- Inkubér kranssektioner i 1 time med et avidin-biotin-peroxidase-kompleks (1: 250) i PBST (2,5 ml per brønd).
- Vask sektionerne i 10 minutter med PBST ved stuetemperatur (2,5 ml per brønd). Gentag 2 gange.
- Vask sektionerne i 10 minutter med 0,05 M Tris-buffer ved stuetemperatur (2,5 ml per brønd). Gentag 2 gange.
- Inkubér koronale sektioner med 0,02% 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid, 0,04% nikkel ammoniumsulfat og 0,01% hydrogenperoxid i 0,05 M Tris-puffer (pH 7,6) at RT (2,0 ml per brønd). I den resterende opløsning (25 ml) tilsættes 17 pi H 2 O 2 (H 2 O 2-opløsning 30% i H2O) (2,0 ml per brønd).
Bemærk: Forskeren bør afgøre udvikling gange under lysmikroskop. Men 5 til 10 min giver god farvningsintensitet. - Hvornår er optimal farvningsintensitet (kontrolleret under lysmikroskop, se figur 5 og figur 6), stoppe reaktionen ved vask sektionerne i 10 minutter med 0,1 M PBS ved stuetemperatur (2,5 ml per brønd). Gentag 4 gange. Derefter vaskes sektionerne med destilleret vand.
- Prøveudtagning montering (håndtag med omhu og handsker under kemisk hætte)
- Mount afsnittene serielt på dias og lufttørre. For dette, forsigtigt at afsnittene i Rostro-caudale ordre med børster på dias. Klart mærke dias efter prøverne.
- Dehydrere med absolut almed sprit: fordybe dias i 30 sek ved RT i absolut alkohol bad. Gentag to gange.
- Klart med xylen: fordybe dias i xylen bad i 3 minutter ved stuetemperatur. Gentag to gange.
- Dækglasset dias med montering medium. For dette, gælder 5 dråber montering medium på dias og derefter anvende dækglasset ved at køre ud luftboblerne. Lufttørre i 48 timer.
6. Data og statistisk analyse
- Undersøg sektioner under et lysmikroskop. Visuelt tæller FLI neuroner ved stor forstørrelse (200x) ved anvendelse af standard landmærker 23,24. C-Fos punktformet farvning er lokaliseret i kerner af neuroner.
- For hvert analyserede område, tælle antallet af c-FOS-positive celler pr sektion og sammenligne det gennemsnitlige antal mellem kontrol- og stimulerede betingelser. Afhængigt af normalitet af dataene bruge uparret Students t-test eller Mann-Whitney-test. Forskelle blev betragtet som signifikante, hvis P0 0,05. Plot fordelingen af FLI neuroner på en tegning (forstørrelse 100x) under anvendelse af en tegning rør fastgjort til mikroskopet og fotograferet med et digitalt kamera (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C-FOS påvisning er et nyttigt værktøj, der tillader identifikation grupper af aktiverede celler under specifikke betingelser, såsom hypoksi og hyperkapni in vivo (figur 2A) eller i situationer, der efterligner disse betingelser ex vivo (figur 2B). In vivo, nyfødt, ung eller voksne gnavere blev anbragt i en lufttæt kasse, som det gasformige miljø kontinuerligt fornyet ved en gasblanding med et præparat præcist defineret i 30 til 180 min 13,25,26 (figur 2A). Da stimulering virker på hele kroppen, kunne den tilhørende ændring i c-FOS afspejler både centrale og perifere aktiverede veje. Ex vivo blev deafferented præparater indeholdende medulla oblongata og rygmarven er placeret i et kammer kontinuerligt overhældt med en aCSF med forskellige niveauer af O 2 eller pH for at modellere hypoxiske eller Hyperkapni betingelser (
CNS blev fikseret med PFA, enten ved en perfusion via den systemiske cirkulation in vivo, eller ved en nedsænkning ex vivo (figur 3). På grund af denne forskel, den fiksativ diffusion er længere ex vivo end in vivo. Således kan det c-fos-signal blive påvirket, især i dybe strukturer. Men fordi c-fos-analyse altid udføres i en komparativ tilgang mellem kontrol og stimuleret in vivo dyr eller ex vivo-præparater, denne forskel ville ikke påvirke resultaterne fra en streng sammenligning af kontrol- og stimulerede data. Efter dette blev CNS kryobeskyttet, sektioneret, og beskæftiger sig immunohistochemical procedure (figur 3, figur 4). På denne måde har nogle respiratoriske hjernestamme områder blevet identificeret in vivo som en ændring af deres aktivitet under hypoxiske eller Hyperkapni udfordringer, herunder retrotrapezoid kerne (RTN), som er den vigtigste centrale lokalitet af CO 2 chemoreception 10,13,28,29, den ventrolaterale marv (VLM), som indeholder den inspiratoriske rytme generatoren 13, den kommissurale og median dele af nucleus tractus solitarius (c / mnts), som er de projektion områder af carotis organer input 13,25,26,30 (figur 5 ), og de medullære raphe kerner 12,13.
Ex vivo, in deafferented betingelser, neuroner i det RTN og VLM er blevet beskrevet at ændre deres c-fos immunreaktivitet under betingelser med reduceret O 2 16-18 år. C-FOS debeskyttelse kan også kombineres med andre immunhistokemiske detekteringer at karakterisere fænotypen af aktiverede celler 14,31
Figur 1. Undersøgelse Design for brug af c-FOS Detection Kort de neuronale strukturer involveret i luftvejene tilpasninger til Hypoxi eller hyperkapni. Kronologisk trin c-FOS afsløring teknik i CNS. CNS: Centralnervesystemet; IHC:. Immunhistokemi Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. c-fos induktion. (A) In vivo induktion protokol. Et dyr blev anbragt i et hermetisk cHamber og eksponeret for enten luft (21% O2; 79% N2), Hyperkapni (21% O2; 4% CO2; 75% N2), eller hypoxiske (10% O2; 90% N2) gas blanding i 2 timer. (B) Ex vivo induktion protokol. CNS blev dissekeret ud fra nyfødt gnaver i alderen 0 til 4 dage. Forlængede marv og rygmarven blev isoleret under forstørrelse for at opnå præparater. De blev anbragt i et kammer med den ventrale overflade vender opad, overhældt med aCSF (pH 7,4) ved 26 ± 1 ° C. Modeling hypoksisk stimulering in vivo blev udført ved at reducere den del af O 2 i aCSF ved at boble et anoxisk gasblanding, der indeholder 95% N2 og 5% CO2. Modeling Hyperkapni stimulering in vivo blev udført under anvendelse af en syre aCSF der afveg fra normal aCSF i form af NaHCO3 fusion (fald). Syren aCSF er mættet med O2 og adjuplace til pH 7,23 ved gennembobling med 95% O2 og 5% CO2. Hver stimulering betingelse blev anvendt i 30 min. aCSF:. kunstig cerebrospinalvæske Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Centralnervesystemet Sampling. In vivo CNS blev opnået ved dissektion efter fiksativ procedure ved anvendelse af 4% paraformaldehyd perfunderet via det vaskulære system. Ex vivo blev CNS direkte nedsænket i 4% paraformaldehyd efter dissektion. Efterfølgende blev CNS kryobeskyttet ved nedsænkning i en kryobeskyttende opløsning og skåret i 40 um tykke koronale snit under anvendelse af en kryostat. De Rostro-caudale dele af medulla blev anbragt i en 12-brønds plade indeholdende PBS before immunhistokemiske procedurer. CNS: Centralnervesystemet; PBS:. Phosphatpufret saltopløsning Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Indirekte Immunohistokemiske procedurer. Snittene blev først inkuberet med et kanin polyklonalt primært antistof mod c-fos-proteinet. Bagefter blev de behandlet med et biotinyleret gede-anti-kanin sekundært antistof mod det primære antistof. Efter denne inkubation blev snit behandlet med et avidin-biotin-peroxidase-kompleks, som binder tæt til det sekundære antistof at forstærke signalet. Faktisk komplekset indeholder flere peroxidasemolekyler fører til en høj farvningsintensitet. Endelig blev snit farvet ved anvendelse af en opløsning af 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochlorid og nikkel ammoniumsulfat, som producerer en mørk grå bundfald i nærværelse af peroxidase enzymet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. c-fos-positive neuroner på dele af medulla oblongata i kontrolmus og mus indgivet for hypoxi in vivo. (A) Tegning af en sektion af medulla oblongata tilpasset fra Paxinos og Franklin 24 (Bregma -7, 48 mm ). Den stiplede område delimitates de kommissurale og median dele af nucleus tractus solitarius c / mnts. Boksen illustrerer strukturerne illustreret ved mikrofotografier (B1 og B2). (B) Photomicrographs udført (x100) på c / mnts niveau i normoxi (B1. kontrol, sort ramme) eller under hypoxi (B2. blå ramme). De sorte pile viser c-fos-positive celler. (C) Histogram, der viser det gennemsnitlige antal c-fos-positive celler per sektion på c / mnts niveau i normoxi (sort søjle) eller under hypoxi (blå bar). Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. * Angiver en signifikant forskel mellem normoxi og hypoxi værdier - Students uparrede t-test; *** P <0,001. CC: central kanal i rygmarven; c / mnts:. kommissurale og median dele af nucleus tractus solitarius Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Immunohistologisk Procedure. Kronologisk trin i cFOS procedure. Ab-I, primært antistof; Ab-II, sekundært antistof; BSA, Bovine Serum Albumin; DAB, 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid; Ni, nikkel ammoniumsulfat; PBS 0,1 M, 0,1 M phosphat-pufret saltvand (pH 7,4); PBST, 0,1 M phosphatpufret saltopløsning suppleret med 0,3% Triton X-100; Serum, serum fra arter, der anvendes til sekundært antistof produktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-fos er et umiddelbart tidligt gen, og påvisningen af det produkt, c-FOS-protein, er klassisk anvendes til at identificere neuronale populationer involveret i specifikke respiratoriske responser in vivo 11,13,25,28 og ex vivo 16-18, 27,32,33.
Kritiske skridt i protokollen
Vær forsigtig under perfusion trin. De 4% PFA løsning skal være godt forberedt og fiksering og post-fiksering trin skal være lang nok til at opnå optimal udskæring og farvning. Desuden åbenbaringen er det vigtigste skridt i proceduren; intensiteten af farvningen bør kontrolleres for at undgå baggrundsstøj.
Fordele ved Teknik og har betydning for eksisterende metoder
Selv om nogle neuroner ikke synes at udtrykke c-fos gen 5, dette migThOD har vist sig at være nyttigt at bestemme nervebaner aktiveret, for eksempel i respiratorisk rytme tilpasning under kemiske udfordringer. Sammenlignet med andre umiddelbare tidlige gener, c-fos har en lav ekspression i fravær af stimulering, giver lettere kvantificering af neuronal aktivitet under en test situation, 6.
C-FOS påvisning er en cellulær teknik, der indikerer globale ændringer i aktivitet for at analysere neuronale populationer involveret i respons på adskillige stimuli. Sammenlignet med neuronal aktivitet analyse ved hjælp af en elektrofysiologisk tilgang, som det meste af tiden kun vedrører et lille antal celler i et defineret hjerne område, c-FOS afsløring tillader én at værdsætte ændringer i aktivitet i en lang række celler og derfor at definere aktiv områder i hele CNS. C-fos påvisning er let kompatibel med uhæmmet og vågen dyr, hvilket ikke er tilfældet under neuronal aktivitet optagelse ved strømophysiology. Dette er en fordel, fordi den undgår stress og interferens af bedøvelsesmidler med de opnåede resultater.
Ex vivo, anvendte vi en 30 min periode stimulation. Det blev tidligere vist, at denne stimulering er tilstrækkelig til at fremkalde ændringer i c-fos-ekspression på den neuronale niveau 34-36. Fem minutters stimulering er tilstrækkeligt til at inducere ændringer i c-fos-ekspression, som observeres efter en latenstid på 15 til 20 min 37. De relaterede stigninger i c-fos-ekspression, er relateret til ændringer i aktivitet, der finder sted i de første 10 minutters stimulering.
Begrænsninger af teknikken
Efter stimulering, er en forsinkelse, før akkumulering af c-fos i kernen. Denne forsinkelse på omkring 30 min svarer til mRNA og proteinsyntese. Denne post er imod umiddelbarheden af resultater, der kan være SKAFFESined ved at registrere aktiviteten af neuroner med elektrofysiologi. Dette kan medføre tab af information om hurtige ændringer i neuronal aktivitet efter en konkret og forbigående stimulus.
Som c-fos-proteinet kan have en halveringstid på 90 til 100 min 4, kan dets ekspression påvirkes af de kirurgiske procedurer eller stress i forbindelse med manipulation af dyret, dets begrænsning, eller ændringer i dens miljø. Det er således nødvendigt for at minimere manipulationer, der kan fremkalde ændringer i neuronal aktivitet ikke er relateret til den undersøgte stimulus og til at udføre væv prøvetagning umiddelbart efter afslutningen af den fysiologiske stimuli.
Ændringer og fejlfinding af teknikken
I denne protokol, åbenbaringen skridt brugte en løsning, der indeholdt 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid, nikkel ammoniumsulfat, og hydrogenperoxid, men de kommercielle kits til peroxidase kunne alså anvendes til dette trin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
