Abstract
מחקרים רבים מבקשים לזהות ולמפות את אזורי המוח מעורבי תקנות פיסיולוגיות ספציפיות. The-פוס ג פרוטו-אונקוגן, גן ראשונים מיידי, מתבטא נוירונים בתגובה לגירויים שונים. מוצר החלבון ניתן לאתר בקלות עם טכניקות immunohistochemical המובילות לשימוש של זיהוי c-FOS למפה קבוצות של נוירונים המציגים שינויים בפעילותם. במאמר זה התמקדנו בזיהוי אוכלוסיות גזע המוח עצבי מעורבת הסתגלות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia. שתי גישות תוארו לזהות אוכלוסיות נוירונים מעורבים vivo בחיות לשעבר vivo בהכנות גזע המוח deafferented. בשנת vivo, בעלי חיים שנחשפו תערובות גז hypercapnic או חוסר חמצן. גופיים, ההכנות deafferented היו superfused עם חוסר חמצן או מלאכותי הנוזל השדרתי hypercapnic. בשני המקרים, בין אם מלא בחי vivo או דוארx הכנות vivo נשמרו בתנאי normoxic ו normocapnic. ההשוואה של שתי גישות אלה מאפשר קביעת מקורם של קרי ההפעלה העצבית, היקפי ו / או מרכזי. בשנת vivo לשעבר vivo, brainstems נאספו, קבוע, ופרוסים למקטעים. לאחר סעיפים הוכנו, זיהוי immunohistochemical של חלבון C-FOS נעשה על מנת לזהות את קבוצות גזע המוח של תאים מופעלים על ידי גירויים היפוקסי או hypercapnic. תאים תווית נספרו במבנים הנשימה בגזע המוח. לשם השוואה למצב מלא, היפוקסיה או hypercapnia הגדיל את מספר תאי שכותרתו ג-FOS באתרי גזע מוח כמה הספציפיים מונחים ובכך מכוננים של המסלולים העצביים המעורבים בעיבוד של כונן הנשימה המרכזי.
Introduction
הגן פוס c- זוהה לראשונה בתחילת 1980 1,2 ו מוצריה התאפיין בשנת 1984 כחלבון גרעיני בעלי תכונות-מפעיל גנים 3,4. והיא הועלתה מנגנוני לטווח ארוך הקשורים גירוי נוירון. ואכן, שינויים בפעילות עצבית להוביל מפלי שניית שליח איתות משרי הביטוי של C-FOS הגן מוקדם המיידי, אשר גורם ייצור של גורם שעתוק ג-FOS. האחרון יוזם את הביטוי של גנים מאוחר ובכך משתתף בתגובות הסתגלות של מערכת העצבים לסוגים רבים ושונים של 4 גירויים. לכן, מאז סוף 1980 5,6, זיהוי החלבון C-FOS נעשה בהם שימוש תכוף כדי לחקור את ההשפעות של הגורמים החיצוניים על שעתוק הגנים בכלל 4 ועל הפעילות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עבור מיפוי מסלולים עצביים מעורב פיזיולוגי שונהתנאי al.
C-FOS בסל הביטוי נחקר במינים שונים, כוללים עכברים, חולדות, חתולים, קופים, ואנושי 4. ובכך, קינטיקה הביטוי שלה ידוע טוב יחסית. הפעלת השעתוק היא מהירה (5 עד 20 דקות) 7,8, והצטברות mRNA מגיעה לשיא בין 30 ל -45 דקות לאחר תחילת גירוי 9 וירידה עם זמן מחצית חיים קצרים של 12 דקות. סינתזת חלבון C-FOS כדלקמן הצטברות mRNA ויכולה להיות מזוהית על ידי אימונוהיסטוכימיה ב 20 כדי 90 דקות פוסט גירוי 6.
ניתוח של ביטוי c-Fos משמש קלסי במחקרי in vivo לזהות את רשת הנשימה המרכזית המעורבת בתגובות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia 10-14. לאחרונה, הכלי הזה שמש גם בהכנות גזע מוח vivo לשעבר לחקור עיבודי רשת נשימה מרכזיים היפוקסיה או hypercapnia 15-18. ואכן, הכנות אלה ליצור פעילות קצבית מתבוללים קלסיים לכונן הנשימה המרכזית 19. לכן, זה סוג של הכנה יש את היתרון של להיות deafferented לחלוטין, ולכן, תוצאות לגבי הביטוי פוס-ג רק לשקף את התוצאות של גירוי מרכזי ללא כל התערבות של מבנים היקפיים.
גילוי ג-FOS יכול להתבצע על ידי גישות immunohistochemical או immunohistofluorescence. עקיפת immunodetection מחייב שימוש נוגדן ראשוני נגד ג-FOS וכן נוגדנים משני המכוונים נגד המין שבו הנוגדן הראשוני הופק. לקבלת השיטה immunohistochemical, נוגדנים משני הוא מצומדות עם אנזים (peroxidase, למשל) שפועל על מצע (H 2 O 2 עבור peroxidase). המוצר של התגובה האנזימטית הוא פותח על ידי אַב צֶבַע (3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloridה), אשר מכתים אותו ניתן לראות תחת מיקרוסקופ אור. התגובה יכולה להיות מחוזקת באמצעות אמוניום סולפט ניקל. שיטות אלה מאפשרים זיהוי של נוירונים פעילים במהלך אתגרים פיסיולוגיים שונים ולכן זיהוי ו / או המיפוי של מסלולים היקפיים ומרכזי מעורב התגובות הפיזיולוגיות הרצופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: זיהוי c-FOS הוא הליך סטנדרטי מעורבים מספר שלבים (איור 1). כל הניסויים בוצעו על חולדות או עכברים. פרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדת אתיקת ניסויים בבעלי חי צ'רלס דרווין (Ce5 / 2011/05), נעשו בהתאם להוראת מועצת הקהילות האירופיות של 22 בספטמבר 2010 (2010/63 / EU) עבור טיפול בבעלי חיים, וכן נערכים בהתאם עם חוקים צרפתים עבור טיפול בבעלי חיים.
1. הכנת פתרונות
- הכן 0.2 חיץ פוספט M נתרן: להוסיף 6.24 גרם לאא 2 4 PO * 2H 2 O ו 22.56 גרם Na 2 HPO 4 * H 2 O ל L 1 מים מזוקקים תוך ערבוב.
- הכן 4% Paraformaldehyde (PFA): להוסיף 20 גרם של PFA ל -150 מ"ל מים מזוקקים. מחממים את הפתרון 80 ° C תוך ערבוב. כדי לנקות את הפתרון, מנמיכים את האש ומוסיפים 1 או 2 טיפות של 1 N NaOH לעזור paraformaldehyde לפזר. שלם 250 מיליליטרעם מים מזוקקים ולהוסיף 250 מ"ל של חיץ פוספט 0.2 M (pH 7.4). חנות ב 4 מעלות צלזיוס. אשמור על עצמך מתאים כאשר משתמש ריאגנטים אלה. ידית עם כפפות, חלוק מעבדה, ומשקפי בטיחות מתחת למכסה המנוע כימי.
הערה: כן PFA 4% ביום לפני perfusions. לקבוע את עוצמת הקול של 4% PFA כפונקציה של גיל, מספר מינים של בעלי חיים. - כן פתרון cryoprotective: בשנת 250 מיליליטר של 0.2 M פוספט שנאגר מלוח, לערבב 5 גרם של-pyrrolidone פוליוויניל, 150 גרם של סוכרוז 2.5 גרם של נתרן כלורי. לאחר פירוק מוחלט, להוסיף 150 מ"ל של אתילן גליקול ולהתאים 500 מ"ל מים מזוקקים. אחסן את הפתרון cryoprotective על 4 מעלות צלזיוס.
- כן 0.1 M שנאגר מלוח פוספט (PBS): להוסיף 18 גרם של NaCl 1 ליטר מים מזוקקים תוך ערבוב. לאחר פירוק מוחלט, להוסיף 1 ליטר 0.2 M של חיץ פוספט נתרן.
- הכן בופר פוספט השלימו עם 0.3% טריטון X100 (PBST): להוסיף 3 מ"ל של טריטון X100 כדי 997 מ"ל של PBS.
- הכן 0.05 מ 'טריס חיץ (pH 7.6): להוסיף 3.03 גר' טריס-Hydrochloride ו 0.70 גרם טריס בסיס ל -500 מ"ל מים מזוקקים תוך ערבוב.
- הכן סרום עיזים 2% ב PBST: עבור צלחת אחת, להכין 30 מ"ל של תמיסת. להוסיף 600 μl של סרום עיזים 30 מ"ל PBST ומערבבים היטב. להוסיף 2.5 מ"ל לכל טוב.
הערה: סרום המשמש חייב לבוא ממינים המשמשים לייצור נוגדנים משני - הכן נוגדן polyclonal ארנב נגד החלבון C-FOS (1: 4000, SC-52) ב PBST עם אלבומין בסרום שור (0.25%). עבור צלחת אחת, להכין 30 מיליליטר של תמיסה. הוסף 75 מ"ג של אלבומין בסרום שור 30 מ"ל PBST ומערבבים היטב. לאחר מכן, להוסיף 7.5 μl של נוגדן polyclonal ארנב נגד החלבון C-FOS.
- כן biotinylated עז נוגדנים נגד ארנב (1: 500) ב PBST עם שור אלבומין (0.25%). עבור צלחת אחת, להכין 30 מיליליטר של תמיסה. הוסף 75 מ"ג של אלבומין בסרום שור 30 מ"ל PBST ומערבבים היטב. לאחר מכן, להוסיף60 μl של נוגדן נגד ארנב עז biotinylated.
- כן המורכב avidin ביוטין-peroxidase (1: 250) ב PBST (פתרון ABC). עבור צלחת אחת, להכין 30 מיליליטר של תמיסה. להוסיף 120 μl של ריאגנט ו -120 μl של מגיב B ל -30 מ"ל PBST ומערבבים היטב.
הערה: פתרון ABC חייב להיות מוכן לפחות 30 דקות לפני השימוש. - כן פתרון מצע. מיד לפני השימוש, להכין את הפתרון כדלקמן (עבור צלחת אחת): להוסיף 20 מ"ג של אמוניום סולפט ניקל 10 מ"ג של tetrahydrochloride 3.3-diaminobenzidine 50 מ"ל טריס-חוצץ. סנן ולהגן מפני אור. להוסיף 2.0 מ"ל לכל טוב. בשנת הפתרון הנותרים (25 מ"ל) להוסיף 17 μl של H 2 O 2 (H 2 O 2 פתרון של 30% O H 2). להוסיף 2.0 מ"ל לכל טוב.
הערה: טיפול הולם יש לנקוט בעת שימוש ריאגנטים אלה. ידית עם כפפות ומעילים מעבדה.
2. C-FOS Induction ועיבוד רקמות in vivo
הערה: הניסויים בוצעו בחולדות (ספראג Dawley) או עכברים (C57BL / 6).
- מניחים את החיות תיבת אטום מאוורר עם חוסר חמצן (% O 2 8 N 2 מאוזן) או hypercapnic (CO 2 4%, O 2 21% N 2 מאוזן) תערובת גז עבור שעה 2 (איור 2 א).
- לטשטש את החיה עם זריקה intraperitoneal של pentobarbital (100 מ"ג / ק"ג). Perfuse את transcardially חיה עם 4% 20 PFA. ידית עם כפפות לטיפול ולשימוש מתחת למכסה המנוע כימי.
- לאחר זלוף, לנתח את המוח 20 ו לטבול אותו 7 מ"ל של 4% PFA בתוך שפופרת 15 מ"ל במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להסיר את המוח מפני PFA לטבול אותו לחלוטין בפתרון cryoprotective. חנות ב -18 ° C (איור 3). השלך את שאר בגופה של החיה על ידי רשות פסולת העיבוד המתאימהthway.
הערה: Cryoprotection הוא צעד בין קיבעון PFA והקפאה. זה מפחית את ההיווצרות של גבישי קרח בתאים עם שפתרונן הקפאה תהיה בצורה אמורפית. הדגימות הקבועות חייבות להיות ספוגות בתמיסת cryoprotective (המוכנה בשלב 1.3) לפחות 24 שעות ב 4 ° C. טפל בו בזהירות וכפפות מתחת למכסה המנוע כימי.
C-FOS 3. אינדוקציה רקמות עיבוד Ex Vivo
הערה: ניסויים בוצעו חולדות או עכברים היילוד בלבד.
- לבודד את מערכת העצבים המרכזית כפי שתואר על ידי Suzue 19. מניחים אותו בתא הקלטה Superfuse זה ללא הרף עם נוזל Cerebro-השדרה מלאכותית בשיעור של 7.5 מ"ל / דק 'ב 26 ° C 21 (aCSF: מ"מ: 130.0 NaCl, 5.4 KCl, 0.8 2 CaCl, 1.0 2 MgCl, 26.0 3 NaHCO, 30.0-גלוקוז D; רווי O 2 ו- מותאם pH 7.4 באמצעות הזרמת גזים עם 95% O 2 ו -5CO 2%) (איור 2 ב).
- החזר את aCSF עם (הרכב אותו מבעבע עם 95% N 2 ו 5% CO 2, pH 7.4) deoxygenated aCSF היפוקסיה או על ידי aCSF acidified (aCSF רגיל עם NaHCO 3 מופחת 10.0 מ"מ, מבעבע עם 95% O 2 ו 5% CO 2) עבור hypercapnia. החל הגירוי למשך 30 דקות (איור 2 ב).
- גופיים, לאחר תקופת אינדוקציה, להעביר את מערכת העצבים המרכזית של עכברים או חולדות הילוד ב 2.5 מ"ל של 4% PFA בתוך שפופרת 2.5 מ"ל במשך 48 שעות ולאחסן ב -18 ° בתמיסה cryoprotective לשימוש מאוחר יותר (איור 3).
הערה: גופיים, זה לא הכרחי כדי perfuse חיות. מחקר קודם מצביע על כך דגימות קטנות מדידות פחות מ -10 מ"מ קוטר ניתן לתקן על ידי דיפוזיה פשוטה 22. שיעור צטט חדירה (מרחק, במ"מ, עבור דיפוזיה מקבעת לתוך הרקמה) עבור אלדהיד הוא 2 או 3 מ"מ / שעה.4. גזע המוח חתך
הערה: החל מ שלב זה עד הסוף, הפרוטוקול הוא זהה לחלוטין עבור in vivo ו זירוזים vivo לשעבר.
- לפני חיתוך, להציב אדם אחד גם להכניס בצלחת 12-היטב ולהוסיף 2.5 מ"ל של PBS היטב כל אחד.
- הפוך חלקים העטרה סדרתי (40 מיקרומטר) של גזע המוח עם cryostat ולאסוף אותם בצלחת 12 באר. עבור גזע המוח הבוגר, להפוך כ -70 פרוסות (איור 3).
הערה: אפשר רקמות סעיף מכמה חיות במקביל צלחת אחת.
5. נהלים immunohistological (טבלה 1)
הערה: לאורך כל ההליך, בסעיפים להישאר מוסיף גם.
- יום 1 - הרס פעילות peroxidase אנדוגני, הלא ספציפית מצור אתר קישור, ו דגירה עם הנוגדן הראשוני (איור 4)
- לִשְׁטוֹףהסעיפים במשך 10 דקות עם 0.1 M PBS ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
- לדכא את פעילות peroxidase אנדוגני ידי דוגרים חלקים העטרה למשך 30 דקות ב RT עם מי חמצן H 2 O 2, 3% ב 0.1 M PBS (2.5 מ"ל לכל טוב).
- שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם 0.1 M PBS ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
- חסום את אתר קישור מקשים שאינם ספציפי על ידי דוגרי חלקי עטרה עבור שעה 1 ב RT עם סרום עיזים (2%) ב PBST.
- דגירה חלקים העטרה במשך 48 שעות ב 4 ° C עם נוגדן polyclonal ארנב נגד החלבון C-FOS (1: 4000, SC-52,) ב PBST עם אלבומין בסרום שור (0.25%) (2.5 מ"ל לכל טוב).
- יום 3 - דגירה עם נוגדנים משני ופיתוח של תגובת צבע (איור 4)
- שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם PBS 0.1 M ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
- דגירהחלקים העטרה עבור שעה 1 ב RT עם נוגדן נגד ארנב עז biotinylated (1: 500) ב PBST עם אלבומין בסרום שור (0.25%) (2.5 מ"ל לכל טוב).
הערה: החוקר יכול גם להשתמש נוגדנים משני מצמידים בדיקה ניאון בשלב זה. במקרה זה, להפסיק את הפרוטוקול בשלב זה ולבחון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות. - שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם PBST ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
- דגירה חלקים העטרה עבור שעה 1 עם תסביך avidin ביוטין-peroxidase (1: 250) ב PBST (2.5 מ"ל לכל טוב).
- שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם PBST ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור על 2 פעמים.
- שטוף את הסעיפים במשך 10 דקות עם 0.05 מ 'טריס-הצפה ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור על 2 פעמים.
- דגירת חלקי העטרה עם tetrahydrochloride 0.02% 3.3-diaminobenzidine, אמוניום סולפט ניקל 0.04% ואת מי חמצן 0.01% 0.05 M טריס חיץ (pH 7.6) אt RT (2.0 מ"ל לכל טוב). בשנת הפתרון הנותרים (25 מ"ל) להוסיף 17 μl H 2 O 2 (H 2 O 2 פתרון של 30% H 2 O) (2.0 מ"ל לכל טוב).
הערה: החוקר צריך לקבוע את זמני פיתוח תחת מיקרוסקופ אור. עם זאת, 5 עד 10 דקות מספקות עוצמת מכתים טובה. - כאשר המכתים עוצם הוא אופטימלי (מבוקר תחת מיקרוסקופ אור, ראה איור 5 ואיור 6), לעצור את התגובה על ידי שטיפת החלקים במשך 10 דקות עם 0.1 M PBS ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 4 פעמים. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים.
- דגימה הרכבה (להישמר מהם וכפפות מתחת למכסה המנוע כימי)
- סעיפי הר סדר בשקופיות ו-אוויר יבש. לשם כך, להפיץ את הסעיפים בזהירות כדי rostro- הזנב עם מברשות בשקופיות. ברור לתייג את השקופיות על פי דגימות.
- מייבשים עם אל המוחלטcohol: לטבול את השקופיות עבור 30 שניות ב RT באמבט אלכוהול מוחלט. חזור פעמיים.
- בהיר עם קסילן: לטבול את השקופיות אמבטיה קסילן במשך 3 דקות ב RT. חזור פעמיים.
- Coverslip את השקופיות עם הרכבה בינונית. לשם כך, להחיל 5 טיפות של הרכבה בינונית בשקופית ולאחר מכן להחיל את הזכוכית המכסה מבריחים את בועות האוויר. אוויר יבש במשך 48 שעות.
6. נתונים וניתוח סטטיסטי
- בדוק חלקים תחת מיקרוסקופ אור. חזותי לספור נוירונים FLI בהגדלה גבוהה (200x) באמצעות ציוני דרך סטנדרטיות 23,24. מכתים punctiform c-Fos מותאמת גרעינים של נוירונים.
- עבור כל אזור נתח, לספור את מספר תאי ג-FOS החיובי לכל סעיף ולהשוות את המספר הממוצע בין תנאים המלאים המגורים. בהתאם הנורמליות של נתונים, להשתמש במבחן t של סטודנט מזווג או מבחן מאן-וויטני. הבדלים נחשבו משמעותי אם P0; 0.05. מגרש את ההפצה של נוירונים FLI גבי (100x גדלה) ציור באמצעות צינור ציור מצורף המיקרוסקופ וצלם עם מצלמה דיגיטלית (איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גילוי ג-FOS הוא כלי שימושי המאפשר קבוצות זיהוי של תאים מופעלים בתנאים מסוימים כגון היפוקסיה ו hypercapnia in vivo (איור 2 א) או במצבי המחקים תנאים אלה לשעבר vivo (איור 2 ב). בשנת vivo, שזה עתה נולד, צעיר , או מכרסמים מבוגרים הושמו תיבת אטום שבו סביבת הגזים מתחדשת ללא הרף על ידי תערובת גז עם רכב הגדיר במדויק במשך 30 עד 180 דקות 13,25,26 (איור 2 א). כמו מעשי הגירוי על כל הגוף, השינוי הנלווה ג-FOS יכול לשקף הן מסלולים מופעלים מרכזיים ואת הפריפריה. Ex vivo, הכנות deafferented המכילות את הלשד המוארך וחוט שדרה הונחו בתא superfused ברציפות עם aCSF עם רמות שונות של O 2 או pH על מנת לבנות מודל תנאי חוסר חמצן או hypercapnic (
מערכת העצבים המרכזית היה קבוע עם PFA, או על ידי זלוף דרך המחזור המערכתי in vivo, או על ידי טבילה vivo לשעבר (איור 3). בשל ההבדל הזה, הדיפוזיה מקבע ארוך vivo לשעבר מ in vivo. לפיכך, אות C-FOS עלולה להיפגע, במיוחד במבנים עמוקים. עם זאת, משום שניתוח ג-FOS תמיד מבוצעת גישה השוואתית בין מלאה מגורה בחיות vivo או לשעבר ההכנות vivo, הבדל זה לא יפריע תוצאות מהשוואה קפדנית שליטה מומרץ נתונים. לאחר מכן, מערכת העצבים המרכזית היה cryoprotected, מחולק, ועסקת imהליך munohistochemical (איור 3, איור 4). בדרך זו, באזורים מסוימים בגזע מוח נשימה זוהו in vivo כמו שינוי פעילותם תחת אתגרים היפוקסי או hypercapnic, כולל גרעין retrotrapezoid (RTN), המהווה את האתר המרכזי הראשי של CO 2 chemoreception 10,13,28,29, את לשד ventrolateral (VLM), אשר מכיל את מחולל קצב inspiratory 13, commissural וחלקים החציוני של הגרעין Tractus solitarius (ג / mNTS), אשר הם התחומים הקרנה של הגופים התרדמה קלט 13,25,26,30 (איור 5 ), ואת 12,13 גרעיני raphe מדולרי.
Ex vivo, בתנאים deafferented, הנוירונים של RTN ואת VLM תוארו לשנות immunoreactivity ג-FOS שלהם בתנאים של O מופחת 2 16-18. C-FOS דהtection עשוי להיות משולב עם לתגליות immunohistochemical אחרות לאפיין את הפנוטיפ של תאים מופעלים 14,31
מערך מחקר באיור 1. לשימוש של איתור ג-FOS למפות את המבנה הנוירונים המעורבים עיבודי הנשימה היפוקסיה או hypercapnia. צעדים כרונולוגיים של טכניקת זיהוי c-FOS במערכת העצבים המרכזית. CNS: מערכת עצבים מרכזית; IHC:. אימונוהיסטוכימיה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. C-FOS אינדוקציה. (א) בשנת vivo פרוטוקול אינדוקציה. בעל חיים הושמו ג הרמטיhamber ו חשוף לאוויר או (21% O 2, 79% N 2), hypercapnic (21% O 2, 4% CO 2; 75% N 2), או חוסר חמצן (10% O 2, 90% N 2) גז התערובת במשך שעה 2. (ב) פרוטוקול אינדוקציה Ex vivo. CNS היה גזור מ- מכרסם היילוד בגילאי 0 עד 4 ימים. המוח המוארך וחוט השדרה בודדו בהגדלה להשיג את ההכנות. הם הושמו בתא עם משטח הגחון כלפי מעלה, superfused עם aCSF (pH 7.4) בשעה 26 ± 1 ° C. דוגמנות גירוי היפוקסי in vivo בוצע על ידי הקטנת החלק היחסי של O 2 aCSF ידי מבעבע תערובת גז anoxic המכיל 95% N 2 ו -5% CO 2. דוגמנות גירוי hypercapnic in vivo בוצע באמצעות aCSF חומציים שונה מן הרגיל aCSF מבחינת ריכוז NaHCO 3 (קיטון). ACSF חומצה רווי O 2 ו adjusted כדי 7.23 pH ידי מבעבע עם 95% O 2, 5% CO 2. כל מצב גירוי יושם למשך 30 דקות. aCSF:. מלאכותי הנוזל השדרתי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. המרכזית דגימה מערכת העצבים. בשנת vivo, מערכת העצבים המרכזית הושג על ידי לנתיחה לאחר הליך מקבע באמצעות 4% paraformaldehyde perfused דרך מערכת כלי הדם. Ex vivo, מערכת העצבים המרכזית היה שקוע ישירות paraformaldehyde 4% לאחר דיסקציה. כתוצאה מכך, מערכת העצבים המרכזית היה cryoprotected ידי טבילה בתמיסה cryoprotective ופרוסים לתוך 40 מיקרומטר חלקים העטרה עבה באמצעות cryostat. סעיפי זנב-rostro של לשד הונחו בצלחת 12-היטב המכילה PBS beforדואר נהלי immunohistochemical. CNS: מערכת עצבים מרכזית; PBS:. פוספט-בופר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. נהלים immunohistochemical עקיפים. הסעיפים הודגרו ראשון עם נוגדן ראשוני ארנב polyclonal נגד חלבון C-FOS. לאחר מכן, הם טופלו עם נוגדנים משני biotinylated עז נגד ארנב נגד הנוגדן הראשוני. לאחר דגירה זו, חלקים טופלו עם תסביך avidin ביוטין- peroxidase, אשר נקשר בחוזקה אל נוגדנים משני כדי להגביר את האות. ואכן, המתחם מכיל מספר מולקולות peroxidase שמובילות עוצמת מכתים גבוהה. לבסוף, סעיפים הוכתמו באמצעות פתרון של 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride ו אמוניום סולפט ניקל, אשר מייצרת משקע אפור כהה בנוכחות האנזים peroxidase. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. ג-FOS חיובי נוירונים על קטעי הלשד המוארך בשליטת עכברים ועכברים שהוגשו היפוקסיה in vivo. (א) ציור של קטע הלשד המוארך המותאם Paxinos ופרנקלין 24 (גבחת -7, 48 מ"מ ). האזור המקווקו delimitates החלקים commissural ו החציוני של ג solitarius גרעין Tractus / mNTS. תיבת ממחיש המבנים מאויר על ידי photomicrographs (B1 ו- B2). (ב) Photomicrographs ביצע (x100) בבית ג / mNTS רמה normoxia (B1. שליטה, מסגרת שחורה) או תחת היפוקסיה (B2. מסגרת כחולה). החיצים השחורים להראות תאי c-FOS החיובי. (ג) היסטוגרמה מראה את המספר הממוצע של התאים ג-FOS חיובי לכל סעיף ב c / רמת mNTS ב normoxia (פס שחור) או תחת היפוקסיה (הפס הכחול). ערכים באים לידי ביטוי כמו ממוצע ± סטיית תקן. * מציין הבדל מובהק בין ערכי normoxia ו היפוקסיה - מבחן t המזווג של הסטודנט; *** P <0.001. CC: התעלה המרכזית של חוט השדרה; ג / mNTS:. חלקים commissural חציון הגרעין Tractus solitarius אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
נוהל בטבלה 1. immunohistological. צעדים כרונולוגיים של CFהליך OS. Ab-I, נוגדן ראשוני; Ab-II, נוגדנים משני; BSA, שור סרום אלבומין; DAB, 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride; Ni, אמוניום סולפט ניקל; 0.1 M PBS, 0.1 M שנאגרו מלוחים פוספט (pH 7.4); PBST, 0.1 M פוספט שנאגר מלוח השלים עם 0.3% Triton X-100; סרום, סרום ממינים המשמשים לייצור נוגדנים משני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-Fos הוא גן מוקדם מיידי, ואת זיהוי המוצרים שלה, חלבון C-FOS, משמש קלסי לזהות אוכלוסיות נוירונים המעורבים בתגובות נשימה ספציפיות in vivo 11,13,25,28 לשעבר vivo 16-18, 27,32,33.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
היזהר במהלך שלב זלוף. פתרון 4% PFA חייב להיות מוכן היטב את צעדי קיבעון קיבעון הפוסט חייבים להיות מספיק זמן כדי לקבל חיתוך מכתים אופטימלי. יתר על כן, ההתגלות היא הצעד החשוב ביותר של ההליך; עוצמת המכתים צריכה להיות מבוקרת כדי למנוע רעש רקע.
יתרונותיו של הטכניקה והמשמעות ביחס שיטות קיימות
למרות נוירונים מסוימים לא נראים המבטאים את הגן-פוס ג 5, זה ליthod הוכח להיות שימושי כדי לקבוע מופעל מסלולים עצביים, למשל בעיבוד קצב נשימה בזמן אתגרים כימיים. לעומת גנים מוקדם מיידיים אחרים, C-FOS יש ביטוי נמוך בהיעדר הגירוי, המאפשר כימות קל של פעילות עצבית תחת מבחן מצב 6.
הגילוי-FOS ג היא טכניקה הסלולר המציינת שינויים גלובליים בפעילות על מנת לנתח אוכלוסיות נוירונים מעורבים בתגובה לכמה גירויים. בהשוואה לניתוח פעילות עצבי באמצעות גישת אלקטרו, אשר רוב דאגות הזמן רק מספר קטן של תאים באזור המוח מוגדר, איתור ג-FOS היתרים אחד להעריך שינויים של פעילות במספר רב של תאים ולכן להגדיר פעיל אזורי שלמי CNS. C-FOS זיהוי תואם בקלות עם בעלי חיים מרוסנים ערים, וזה לא המקרה במהלך הקלטת פעילות עצבית ידי אלקטרונophysiology. זהו יתרון כי זה ימנע מתח והפרעה של הרדמה עם התוצאות שהתקבלו.
גופיים, השתמשנו תקופה של 30 דקות של גירוי. בעבר הכלי היה הראו כי גירוי זה מספיק כדי לגרום שינויים בביטוי C-FOS ברמה העצבית 34-36. חמש דקות של גירוי מספיקות כדי לגרום שינויים בביטוי C-FOS, אשר נצפים לאחר תקופה לטנטית של 15 עד 20 דקות 37. העליות הקשורות בביטוי C-FOS קשורות לשינויים המתרחשים פעילות במהלך גירוי 10 דקות של הראשון.
מגבלות של הטכניקה
בעקבות גירוי, עיכוב נדרש לפני ההצטברות של c-FOS בגרעין. עיכוב זה של כ -30 דקות מתאים mRNA סינתזת חלבון. פריט זה מתנגד למיידיות התוצאות שעלולות להיות obtaשאינו עומד על ידי הקלטת הפעילות של נוירונים עם אלקטרופיזיולוגיה. זה יכול לגרום לאובדן של מידע אודות שינויים מהירים בפעילות עצבית לאחר גירוי ספציפי וחולף.
כמו חלבון C-FOS יכול להיות זמן מחצית חיים של 90 עד 100 דקות 4, הביטוי שלה עשוי להיות מושפע על ידי פעולות כירורגיות או לחץ קשורות המניפולציה של החיה, האילוץ שלה, או לשינויים בסביבה שלה. לפיכך, יש צורך למזער מניפולציות שיכולים לגרום לשינויים בפעילות עצבית אינם קשורים לגירוי למד לבצע דגימת רקמה מייד לאחר תום הגירוי הפיזיולוגי.
שינויים ופתרון בעיות של הטכניקה
בפרוטוקול זה, צעד ההתגלות המשמש פתרון שהכיל 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride, אמוניום סולפט ניקל, מי חמצן, אבל הערכות המסחריות peroxydase יכולות אלכך לשמש בשלב זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
