Abstract
Veel studies trachten de hersengebieden die betrokken zijn bij specifieke fysiologische regelgeving te identificeren en in kaart. Het proto-oncogen c-fos, een onmiddellijk vroege gen, tot expressie wordt gebracht in neuronen in reactie op verschillende stimuli. Het eiwitproduct kan gemakkelijk worden gedetecteerd met immunohistochemische technieken waardoor het gebruik van c-FOS detectie groepen neuronen die veranderingen in hun activiteit weergave-afbeelding. In dit artikel hebben we ons gericht op de identificatie van hersenstam neuronale populaties die betrokken zijn bij de ademhaling aanpassing aan hypoxie of hypercapnie. Twee benaderingen beschreven om mee neuronale populaties te identificeren in vivo bij dieren en ex vivo in deafferented hersenstam preparaten. In vivo dieren werden blootgesteld aan hypercapnische of hypoxische gasmengsels. Ex vivo werden deafferented preparaten superfused met hypoxische of hypercapnische kunstmatige cerebrospinale vloeistof. In beide gevallen, zowel in vivo controle dieren of ex vivo preparaten werden onder normoxische en normocapnic voorwaarden gehandhaafd. De vergelijking van deze twee benaderingen maakt de bepaling van de oorsprong van de neuronale dwz perifere en / of centrale. In vivo en ex vivo, brainstems verzameld, gefixeerd en in secties gesneden. Zodra secties werden bereid, werd immunohistochemische detectie van het c-fos eiwit gemaakt om de hersenstam groepen cellen geactiveerd door hypoxische of hypercapnische stimulaties identificeren. Gelabelde cellen werden geteld in hersenstam respiratoire structuren. In vergelijking met de controlegroep, hypoxie of hypercapnie verhoogde het aantal c-FOS gemerkte cellen in verschillende specifieke hersenstam sites die aldus constitutief van de zenuwbanen die bij de aanpassing van de centrale ademhalingscentrum zijn.
Introduction
Het c-fos gen werd geïdentificeerd voor het eerst aan het begin van 1980 1,2 en het product werd gekarakteriseerd in 1984 als nucleair eiwit met gen-activator eigenschappen 3,4. Hij neemt deel aan de lange termijn mechanismen geassocieerd met neuron stimulatie. Inderdaad, veranderingen in neuronale activiteit tot second messenger signalerende cascades die de expressie van het directe vroege gen c-fos, die de productie van de transcriptiefactor c-FOS induceert induceren. De laatste initieert de expressie van late genen en derhalve deel aan adaptieve responsen van het zenuwstelsel van vele verschillende soorten stimuli 4. Aldus, sinds eind 1980 5,6, c-FOS eiwitdetectie is vaak gebruikt om de effecten van exogene factoren op gentranscriptie in het algemeen 4 en op de activiteit van het centrale zenuwstelsel (CNS) studeren kaart brengen zenuwbanen betrokken bij verschillende fysiologischeal omstandigheden.
Basale c-fos-expressie is onderzocht in diverse species waaronder muizen, ratten, katten, apen en humane 4. Daardoor wordt de kinetiek van de expressie vrij goed bekend. De transcriptie-activering is snel (5 tot 20 min) 7,8 en de mRNA accumulatie bereikt een maximum tussen 30 en 45 minuten na het begin van stimulatie 9 en afneemt met een korte halfwaardetijd van 12 min. De c-FOS eiwitsynthese volgt accumulatie van mRNA en door immunohistochemie kan worden gedetecteerd bij 20 tot 90 min na stimulatie 6.
Analyse van c-fos-expressie is klassiek gebruikt in in vivo studies om de centrale respiratoire netwerk betrokken zijn bij de ademhaling responsen op hypoxie of hypercapnie 10-14 identificeren. Meer recent werd dit instrument ook gebruikt in ex vivo hersenstam voorbereidingen naar het centrum van de luchtwegen netwerk aanpassingen aan hypoxie of h te verkennenypercapnia 15-18. Sterker nog, deze voorbereidingen genereren een ritmische activiteit klassiek gelijkgesteld aan de centrale luchtwegen aandrijving 19. Dus dit soort preparaat heeft het voordeel dat volledig deafferented en derhalve resultaten met betrekking tot c-fos expressie de gevolgen van een centrale stimulatie geven alleen zonder tussenkomst van perifere structuren.
De c-FOS detectie daarin van immunohistochemische of immunohistofluorescence benaderingen. Indirecte immunodetectie vereist het gebruik van een primair antilichaam tegen c-FOS en een secundair antilichaam gericht tegen de soorten waarbij het primaire antilichaam werd geproduceerd. Voor de immunohistochemische methode wordt het secundaire antilichaam geconjugeerd met een enzym (peroxidase, bijvoorbeeld) die inwerkt op een substraat (H 2 O 2 voor peroxidase). Het product van de enzymatische reactie wordt ontwikkeld door een chromogeen (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride), die vlekken en onder lichtmicroscopie worden waargenomen. De reactie kan worden versterkt met behulp van nikkel ammoniumsulfaat. Deze werkwijzen maken de detectie van actieve neuronen in verschillende fysiologische problemen en dus de identificatie en / of het in kaart brengen van perifere en centrale routes betrokken bij de opeenvolgende fysiologische reacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: c-FOS-detectie is een gestandaardiseerde procedure met meerdere stappen (figuur 1). Alle experimenten werden uitgevoerd bij ratten en muizen. Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie in Animal Experiment Charles Darwin (CE5 / 2011/05), gedaan in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 22 september 2010 (2010/63 / EU) voor de verzorging van dieren, en uitgevoerd overeenkomstig met de Franse wetgeving voor de verzorging van dieren.
1. Voorbereiding van de Solutions
- Bereid 0,2 M natriumfosfaatbuffer: voeg 6,24 g NaH 2 PO 4 * 2 H 2 O en 22,56 g Na 2 HPO 4 * H 2 O tot 1 liter gedestilleerd water onder roeren.
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA): voeg 20 g PFA aan 150 ml gedestilleerd water. Verwarm de oplossing tot 80 ° C onder roeren. Om de oplossing te verwijderen, zet het vuur lager en voeg 1 of 2 druppels 1 N NaOH om de paraformaldehyde te ontbinden. Compleet tot 250 mlmet gedistilleerd water en voeg 250 ml 0,2 M fosfaatbuffer (pH 7,4). Bewaren bij 4 ° C. Neem passende zorg bij het gebruik van deze reagentia. Handvat met handschoenen, laboratoriumjas en een veiligheidsbril onder een chemische motorkap.
Let op: Bereid 4% PFA op de dag voor de perfusie. Bepaal het volume van 4% PFA als functie van leeftijd, aantal en diersoorten. - Bereid cryobeschermende oplossing: In 250 ml 0,2 M fosfaat gebufferde zoutoplossing, meng 5 g polyvinylpyrrolidon, 150 g sucrose en 2,5 g natriumchloride. Na volledige oplossing, voeg 150 ml ethyleenglycol en aanpassen aan 500 ml met gedestilleerd water. Bewaar de cryobeschermende oplossing bij 4 ° C.
- Bereid 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): voeg 18 g NaCl aan 1 l gedestilleerd water onder roeren. Na volledige oplossing, voeg 1 L 0,2 M natriumfosfaatbuffer.
- Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing, aangevuld met 0,3% Triton X100 (PBST): Voeg 3 ml van Triton X100-997 ml PBS.
- Bereid 0,05 M Tris-buffer (pH 7,6): voeg 3,03 g Tris-hydrochloride en 0,70 g Tris-base tot 500 ml gedestilleerd water onder roeren.
- Bereid 2% geit serum in PBST: voor een bord, voor te bereiden 30 ml oplossing. Voeg 600 ul van geit serum tot 30 ml PBST en meng goed. Voeg 2,5 ml per well.
NB: Serum gebruikt moet afkomstig zijn van soorten gebruikt voor secundaire productie van antilichamen - Bereid konijn polyklonaal antilichaam tegen het c-fos-eiwit (1: 4000, sc-52) in PBST met runderserumalbumine (0,25%). Voor een plaat, bereid 30 ml oplossing. Voeg 75 mg runderserumalbumine tot 30 ml PBST en meng. Voeg vervolgens 7,5 ui konijnen polyklonaal antilichaam tegen het c-fos eiwit.
- Bereid gebiotinyleerd geit anti-konijn-antilichaam (1: 500) in PBST met runder serumalbumine (0,25%). Voor een plaat, bereid 30 ml oplossing. Voeg 75 mg runderserumalbumine tot 30 ml PBST en meng. Dan toevoegen60 pl gebiotinyleerd geit anti-konijn antilichaam.
- Bereid avidine-biotine-peroxidase-complex (1: 250) in PBST (ABC oplossing). Voor een plaat, bereid 30 ml oplossing. Voeg 120 ul van reagens A en 120 pi reagens B tot en met 30 ml PBST en meng goed.
Opmerking: ABC oplossing komt overeen met ten minste 30 minuten voor gebruik. - Bereid substraatoplossing. Vlak voor gebruik bereid de oplossing als volgt (één plaat): voeg 20 mg nikkel ammoniumsulfaat en 10 mg 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride aan 50 ml Tris-buffer. Filteren en te beschermen tegen licht. Voeg 2,0 ml per well. In de resterende oplossing (25 ml) voeg 17 gl H 2 O 2 (H 2 O 2-oplossing 30% in H2O). Voeg 2,0 ml per well.
Opmerking: Passende zorg moeten worden genomen bij het gebruik van deze reagentia. Handvat met handschoenen en witte jassen.
2. c-fos Inductie en Weefsel bewerken In Vivo
Opmerking: Experimenten werden uitgevoerd bij ratten (Sprague Dawley) of muizen (C57BL / 6).
- Leg de dieren in een luchtdichte doos geventileerd met een hypoxische (O 2 8% gebalanceerd N2) of hypercapnische (CO 2 4% O 2 21% gebalanceerd N2) gasmengsel gedurende 2 uur (Figuur 2A).
- Verdoven het dier met intraperitoneale injectie van pentobarbital (100 mg / kg). Perfuseren het dier transcardiaal met 4% PFA 20. Handvat met zorg en gebruik handschoenen onder een chemische motorkap.
- Na perfusie, ontleden de hersenen 20 en dompel in 7 ml van 4% PFA in een 15 ml buis gedurende 48 uur bij 4 ° C. Verwijder vervolgens de hersenen van PFA en dompel het volledig in de cryoprotectieve oplossing. Bewaar bij -18 ° C (figuur 3). Gooi de rest van het lichaam van het dier door de bevoegde-afval verwerken van pathway.
Opmerking: cryoprotection is een stap tussen PFA fixatie en bevriezing. Het vermindert de vorming van ijskristallen in de cellen met een oplossing waarvan het bevriezen in amorfe vorm. De gefixeerde monsters moet worden geïmpregneerd in de cryobeschermende oplossing (bereid in stap 1,3) gedurende ten minste 24 uur bij 4 ° C. Voorzichtig behandelen en handschoenen onder chemische motorkap.
3. c-fos inductie en Weefsel bewerken Ex Vivo
Noot: Experimenten werden uitgevoerd bij pasgeboren ratten of muizen alleen.
- Isoleer het CNS zoals beschreven door Suzue 19. Dit in een opname kamer en superfuse deze continu met kunstmatige cerebrospinale vloeistof met een snelheid van 7,5 ml / min bij 26 ° C 21 (aCSF: mm: 130,0 NaCl, 5,4 KCI, 0,8 CaCl2, 1,0 MgCl2, 26,0 NaHCO3, 30,0 D-glucose, verzadigd met O2 en ingesteld op pH 7,4 door begassing met 95% O2 en 5% CO 2) (figuur 2B).
- Vervang de aCSF met gedeoxygeneerd aCSF (dezelfde samenstelling geborreld met 95% N2 en 5% CO 2, pH 7,4) gedurende hypoxie of door een aangezuurde aCSF (standaard aCSF met NaHCO3 verlaagd tot 10,0 mM, geborreld met 95% O2 en 5% CO 2) voor hypercapnie. Breng de stimulatie gedurende 30 min (figuur 2B).
- Ex vivo, na de inductieperiode, breng de CNS pasgeboren muizen of ratten in 2,5 ml van 4% PFA in een 2,5 ml buis gedurende 48 uur en bewaar bij -18 ° C in een cryoprotectieve oplossing voor later gebruik (figuur 3).
Opmerking: Ex vivo, is het niet nodig om dieren te perfuseren. Een eerdere studie suggereert dat kleine monsters van minder dan 10 mm kan worden vastgesteld door eenvoudige diffusie 22. Een opgegeven penetratiesnelheid (afstand, in mm, het fixeermiddel diffusie in het weefsel) voor aldehyd 2 of 3 mm / uur.4. hersenstam-Sectie
Opmerking: Van deze stap tot het einde, het protocol strikt dezelfde in vivo en ex vivo inducties.
- Alvorens te snijden, plaatst één persoon goed in te voegen in een 12-well plaat en voeg 2,5 ml PBS in elk putje.
- Maak seriële coronale secties (40 pm) van de hersenstam met een cryostaat en verzamelen in de 12-well plaat. Voor de hele volwassen hersenstam, maken ongeveer 70 plakken (figuur 3).
Opmerking: Het is mogelijk om weefselmonsters uit verscheidene dieren tegelijk in een plaat.
5. Immunohistologische Procedures (tabel 1)
Let op: Tijdens de gehele procedure, de afdelingen blijven in de put inserts.
- Dag 1 - Endogene peroxidase activiteit vernietigen, niet-specifieke bindingsplaats blokkade, en incubatie met het primaire antilichaam (figuur 4)
- Wassende secties gedurende 10 minuten met 0,1 M PBS bij kamertemperatuur (2,5 ml per putje). Herhaal dit 3 keer.
- Onderdrukken van de endogene peroxidase-activiteit door incubatie van de coronale secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met waterstofperoxide H 2 O 2, 3% in 0,1 M PBS (2,5 ml per putje).
- Was de secties gedurende 10 minuten met 0,1 M PBS bij kamertemperatuur (2,5 ml per putje). Herhaal dit 3 keer.
- Blokkeert de niet-specifieke bindingsplaats door het incuberen van de coronale secties gedurende 1 uur bij KT met geit serum (2%) in PBST.
- Incubeer de coronale secties gedurende 48 uur bij 4 ° C met een konijn polyklonaal antilichaam tegen het c-fos-eiwit (1: 4000, SC-52,) in PBST met runderserumalbumine (0,25%) (2,5 ml per putje).
- Dag 3 - incubatie met secundair antilichaam en ontwikkeling van een kleurreactie (figuur 4)
- Was de secties voor 10 min met PBS 0,1 M bij kamertemperatuur (2,5 ml per putje). Herhaal dit 3 keer.
- Incubeer decoronale secties gedurende 1 uur bij KT met een gebiotinyleerd geit anti-konijn-antilichaam (1: 500) in PBST met runderserumalbumine (0,25%) (2,5 ml per putje).
Opmerking: De onderzoeker kan ook een tweede antilichaam gekoppeld aan een fluorescente probe gebruikt in deze fase. In dit geval de protocol in dit stadium en onderzoekt direct met fluorescentie- microscoop. - Was de secties gedurende 10 minuten met PBST bij kamertemperatuur (2,5 ml per putje). Herhaal dit 3 keer.
- Incubeer de coronale secties voor 1 uur met een avidine-biotine-peroxidase-complex (1: 250) in PBST (2,5 ml per putje).
- Was de secties gedurende 10 minuten met PBST bij kamertemperatuur (2,5 ml per putje). Herhaal 2 keer.
- Was de secties voor 10 min met 0,05 M Tris-buffer bij RT (2,5 ml per putje). Herhaal 2 keer.
- Incubeer de coronale secties met 0,02% 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 0,04% nikkel ammoniumsulfaat en 0,01% waterstofperoxide in 0,05 M Tris-buffer (pH 7,6) eent RT (2,0 ml per putje). In de resterende oplossing (25 ml) voeg 17 gl H 2 O 2 (H 2 O 2-oplossing 30% in H2O) (2,0 ml per putje).
Opmerking: De onderzoeker moet ontwikkelingstijden bepalen onder lichtmicroscoop. Echter, 5-10 min biedt goede kleurintensiteit. - Wanneer kleuring intensiteit optimaal is (onder toezicht lichtmicroscoop, zie Figuur 5 en Figuur 6), stop de reactie door het wassen van de secties gedurende 10 minuten met 0,1 M PBS bij kamertemperatuur (2,5 ml per putje). Herhaal 4 keer. Vervolgens was de secties met gedestilleerd water.
- Bemonstering montage (voorzichtig behandelen en handschoenen onder chemische kap)
- Mount secties serieel op dia's en de lucht drogen. Hiervoor voorzichtig uit de secties in rostro-caudale order met borstels op de dia's. Duidelijk label de objectglaasjes volgens de monsters.
- Dehydrateren met absolute alin alcohol: dompel de dia's voor 30 sec bij KT in absolute alcohol bad. Herhaal dit twee keer.
- Clear met xyleen: dompel de dia's in xyleen bad voor 3 min bij RT. Herhaal dit twee keer.
- Dekglaasje de dia's met montage medium. Hiervoor gelden 5 druppels montage medium op de dia en breng de dekking van glas door het rijden van de luchtbellen. Lucht drogen gedurende 48 uur.
6. gegevens en statistische analyse
- Onderzoek secties onder een lichtmicroscoop. Visueel tellen FLI neuronen bij een hoge vergrotingsfactor (200x) met behulp van standaard bezienswaardigheden 23,24. De c-Fos puntvormig kleuring is gelokaliseerd in kernen van neuronen.
- Voor elk geanalyseerd gebied tel het aantal c-FOS-positieve cellen per sectie en vergelijkt het gemiddelde aantal tussen controle en gestimuleerde omstandigheden. Afhankelijk van de normaliteit van de gegevens, gebruikt ongepaarde student t-test of Mann-Whitney-test. Verschillen werden significant indien P beschouwd0; 0,05. Zet de verdeling van neuronen FLI op een tekening (vergroting 100x) met een tekening buis bevestigd aan de microscoop en gefotografeerd met een digitale camera (Figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De c-FOS detectie is een nuttig instrument dat de identificatie van groepen geactiveerde cellen toestaat onder specifieke omstandigheden zoals hypoxie en hypercapnie in vivo (Figuur 2A) of in situaties die deze omstandigheden ex vivo (Figuur 2B) na te bootsen. In vivo, pasgeboren, jonge of volwassen knaagdieren werden in een luchtdichte doos waarin de gasvormige omgeving voortdurend vernieuwd door een gasmengsel met een nauwkeurig gedefinieerde samenstelling gedurende 30 tot 180 min 13,25,26 (figuur 2A). Als de stimulatie werkt op het hele lichaam, zou de verwachte verandering in c-FOS tijdens zowel centrale als perifere geactiveerde pathways. Ex vivo deafferented preparaten met het verlengde merg en het ruggenmerg in een kamer continue gesuperfuseerd met aCSF met verschillende niveaus geplaatst O 2 of pH om hypoxische omstandigheden of hypercapnische modelleren (
De CNS werd gefixeerd met PFA, hetzij door een perfusie via de systemische circulatie in vivo, of door onderdompeling ex vivo (figuur 3). Door dit verschil, het fixeermiddel diffusie langer ex vivo dan in vivo. Zo zou de c-FOS signaal worden beïnvloed, vooral dieptestructuur. Omdat de c-FOS analyse altijd een vergelijkende aanpak tussen controle wordt uitgevoerd en gestimuleerd in vivo of ex vivo dieren preparaten, zou dit verschil geen afbreuk aan de resultaten van een strikte vergelijking controle- en gestimuleerd data. Daarna werd het CNS cryobeschermd, gesegmenteerd, en die zich bezighouden met de immunohistochemical procedure (Figuur 3, Figuur 4). Zo hebben sommige respiratoire hersenstam gebieden aangewezen in vivo modificatie van de activiteit onder hypoxische of hypercapnische problemen, waaronder de retrotrapezoid nucleus (RTN), die de belangrijkste centrale plaats van CO 2 chemoreceptie 10,13,28,29, de ventrolaterale medulla (VLM), waarbij de inspiratoire ritmegenerator 13, de mediaan commissural en delen van de nucleus tractus solitarius bevat (c / mnts), waarbij het uitsteeksel gebieden van de halsslagader organen ingang 13,25,26,30 (figuur 5 zijn ), en de medullaire raphe kernen 12,13.
Ex vivo, in deafferented omstandigheden neuronen van de RTN en VLM is beschreven dat de c-FOS immunoreactiviteit onder omstandigheden van verminderde O 16-18 februari veranderen. De c-FOS debescherming kan ook worden gecombineerd met andere immunohistochemische detecties het fenotype van geactiveerde cellen 14,31 karakteriseren
Figuur 1. Onderzoeksopzet voor het gebruik van c-FOS Detection de Neuronale structuren Betrokken bij Respiratory aanpassingen van Hypoxie of Hypercapnie kaart. Chronologische stappen van c-FOS detectietechniek in het CZS. CNS: centrale zenuwstelsel; IHC. Immunohistochemie Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. C-FOS inductie. (A) In vivo inductie protocol. Een dier werd in een hermetische cHamber en blootgesteld aan lucht (21% O2, 79% N2), hypercapnische (21% O2, 4% CO2, 75% N2) of hypoxische (10% O2, 90% N2) gas mengsel gedurende 2 uur. (B) Ex vivo inductie protocol. CNS werd ontleed uit pasgeboren knaagdieren 0-4 dagen oud. Verlengde merg en het ruggenmerg werden geïsoleerd onder vergroting om de voorbereidingen te verkrijgen. Zij werden in een kamer geplaatst met de ventrale zijde naar boven, superfused met aCSF (pH 7,4) bij 26 ± 1 ° C. Modelleren hypoxische stimulatie in vivo werd uitgevoerd door het verminderen van de fractie van O2 in de aCSF door doorleiden anoxische gasmengsel dat 95% N2 en 5% CO2. Modelleren hypercapnische stimulatie in vivo werd uitgevoerd met een zuur aCSF die qua NaHCO3 concentratie (afname) verschilde van normaal aCSF. Het zuur aCSF is verzadigd met O2 en adjusted tot pH 7,23 door doorborrelen met 95% O2 en 5% CO2. Elk stimulatiekanaal voorwaarde werd gedurende 30 min. aCSF:. kunstmatige cerebrospinale vloeistof Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. centrale zenuwstelsel sampling. In vivo, het CNS verkregen door ontleding na fixeermiddel werkwijze met 4% paraformaldehyde geperfuseerd via het vasculaire systeem. Ex vivo, werd het CNS direct ondergedompeld in 4% paraformaldehyde na dissectie. Vervolgens werd het CNS cryobeschermd door onderdompeling in een cryoprotectieve oplossing en gesneden in 40 urn dikke coronale secties met behulp van een cryostaat. De rostro-caudale delen van medulla werden geplaatst in een 12-well plaat met PBS before immunohistochemische procedures. CNS: centrale zenuwstelsel; PBS. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Indirecte Immunohistochemische Procedures. De coupes werden eerst geïncubeerd met een konijn polyklonaal primair antilichaam tegen c-FOS eiwit. Daarna werden ze met een gebiotinyleerd geit anti-konijn secundair antilichaam tegen het primaire antilichaam. Na deze incubatie werden de secties behandeld met een avidine-biotine-peroxidase-complex, die strak bindt aan het tweede antilichaam aan het signaal te versterken. Inderdaad, het complex bevat verschillende peroxidase moleculen leidt tot een hoge kleurintensiteit. Tenslotte werden secties gekleurd met een oplossing van 3,3-Diaminobenzidine tetrahydrochloride en nikkel ammoniumsulfaat, die een donkergrijze neerslag produceert in de aanwezigheid van het enzym peroxidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. c-FOS-positieve neuronen op gedeelten van de medulla oblongata in controle muizen en muizen aan hypoxie in vivo ingediend. (A) Tekening van een deel van de medulla oblongata aangepast van Paxinos en Franklin 24 (Bregma -7, 48 mm ). De gestippelde gebied wordt afgebakend het commissural en de mediaan delen van de nucleus tractus solitarius c / Mnts. De box illustreert de structuren geïllustreerd door microfoto (B1 en B2). (B) Photomicrographs uitgevoerd (X100) aan de c / Karpaten niveau normoxia (B1. controle, zwart frame) of onder hypoxie (B2. blauw kader). De zwarte pijlen geven c-FOS-positieve cellen. (C) Histogram toont het gemiddelde aantal c-FOS-positieve cellen per groep op C / Mnts niveau normoxia (zwarte balk) of onder hypoxie (blauwe balk). De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. * Geeft een significant verschil tussen normoxia en hypoxie waarden - Student's ongepaarde t-test; *** P <0,001. CC: centrale kanaal van het ruggenmerg; c / mnts:. commissural en de mediaan delen van de nucleus tractus solitarius Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Immunohistologische Procedure. Chronologisch stappen van de CFOS procedure. Ab-I, primaire antilichaam; Ab-II, secundair antilichaam; BSA, runderserumalbumine; DAB, 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride; Ni, nikkel ammoniumsulfaat; PBS 0,1 M, 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4); PBST, 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing aangevuld met 0,3% Triton X-100; Serum, serum van soorten gebruikt voor secundaire productie van antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-fos is een directe vroege gen, en de detectie van het product, de c-fos-eiwit, is klassiek gebruikt om neuronale populaties betrokken bij specifieke respiratoire responsen in vivo 11,13,25,28 identificeren en ex vivo 16-18, 27,32,33.
Kritische stappen in het Protocol
Wees voorzichtig tijdens de perfusie stap. De 4% PFA oplossing moet goed worden voorbereid en de fixatie en post-fixatie stappen moet lang genoeg zijn om een optimale snijden en vlekken te verkrijgen. Bovendien is de openbaring is de belangrijkste stap van de procedure; de intensiteit van de kleuring moet worden gecontroleerd om achtergrondruis vermijden.
De voordelen van de techniek en betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Hoewel sommige neuronen niet lijken mij de c-fos-gen 5 te drukken, ditthod is nuttig gebleken te bepalen zenuwbanen tijdens chemische uitdagingen geactiveerd, bijvoorbeeld ademritme adaptatie. Vergeleken met andere directe vroege genen c-fos een lage expressie in de afwezigheid van stimulatie, wat een eenvoudigere kwantificering van neuronale activiteit onder een testsituatie 6.
De c-FOS detectie een cellulaire techniek die globale veranderingen in activiteit geeft om neuronale populaties die deze reactie op verschillende stimuli analyseren. Vergeleken met neuronale activiteit analyse onder toepassing van een elektrofysiologische benadering, die meestal slechts in een klein aantal cellen binnen een bepaald hersengebied, c-FOS detectie toelaat een tot andersoortige activiteiten in een groot aantal cellen te waarderen en derhalve actief te definiëren gebieden in de hele CNS. C-FOS detectie moeilijk verenigbaar ongeremde en wakkere dieren, wat niet het geval tijdens neuronale activiteit opnemen van elektrophysiology. Dit is een voordeel omdat het spanning en interferentie van anesthetica met de verkregen resultaten vermijdt.
Ex vivo, gebruikten we een 30 min periode van stimulatie. Eerder werd aangetoond dat stimulatie voldoende is om veranderingen in c-fos expressie in neuronaal niveau 34-36 induceren. Vijf min stimulatie volstaan om veranderingen in c-fos expressie, die worden waargenomen na een latente periode van 15 tot 20 min 37 induceren. De gerelateerde toename in c-fos expressie betreffen de activiteit die plaatsvindt tijdens de eerste 10 minuten van de stimulatie.
Beperkingen van de Techniek
Na stimulatie is een vertraging vereist voordat de accumulatie van c-FOS in de kern. Deze vertraging van ongeveer 30 minuten correspondeert met mRNA en eiwitsynthese. Dit item is in tegenstelling tot de directheid van de resultaten die OBTA kunnen zijnined door registratie van de activiteit van neuronen met elektrofysiologie. Dit kan een verlies van informatie over de snelle veranderingen in de neuronale activiteit na een bepaalde en voorbijgaande stimulus veroorzaken.
Als c-FOS eiwit een halfwaardetijd van 90 wellicht 100 min 4, kan de expressie worden beïnvloed door de chirurgische procedures of stress in verband met de manipulatie van het dier, de beperking of veranderingen in zijn omgeving. Derhalve is het noodzakelijk om manipulaties die veranderingen in neuronale activiteit met betrekking tot de bestudeerde stimulans kan induceren en een weefselmonster direct uitgevoerd na afloop van de fysiologische stimulus minimaliseren.
Wijzigingen en probleemoplossing van de Techniek
In dit protocol, de openbaring stap gebruik gemaakt van een oplossing die 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride, nikkel ammoniumsulfaat, en waterstofperoxide bevatte, maar de commerciële kits voor peroxidase kon aldus worden gebruikt voor deze stap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
