Abstract
Många studier försöka identifiera och kartlägga områden i hjärnan som är involverade i specifika fysiologiska regler. Proto-onkogenen c-fos, en omedelbar tidig gen, uttrycks i neuroner som svar på olika stimuli. Proteinprodukten kan lätt detekteras med immunohistokemiska tekniker som leder till användning av c-FOS upptäckt att kartlägga grupper av nervceller som visar förändringar i sin verksamhet. I den här artikeln har vi fokuserat på att identifiera hjärnstammen neuronala populationer är inblandade i andnings anpassning till hypoxi eller hyperkapni. Två tillvägagångssätt har beskrivits för att identifiera inblandade neuronpopulationer in vivo i djur och ex vivo i deafferenterad hjärnstams preparat. In vivo djur exponerades för hyperkapni eller hypoxiska gasblandningar. Ex vivo, var deafferenterad preparat superfuseras med hypoxisk eller hyperkapni artificiell cerebrospinalvätska. I båda fallen, antingen kontroll in vivo djur eller ex vivo preparat hölls under normoxiska och normocapnic förhållanden. Jämförelsen mellan dessa två tillvägagångssätt möjliggör fastställandet av ursprung neuronala aktiverings dvs perifera och / eller centrala. In vivo och ex vivo har brainstems samlas in, fast, och skivade i sektioner. När sektionerna preparerades ades immunhistokemisk detektion av c-fos-protein som gjorts i syfte att identifiera de hjärnstammen grupper av celler som aktiveras av hypoxiska eller hyperkapni stimuleringar. Märkta celler räknades i hjärnstamsandnings strukturer. I jämförelse med kontroll tillstånd, hypoxi eller hyperkapni ökade antalet C-FOS märkta celler i flera specifika hjärnstams webbplatser som således konstitutiv av de nervbanor som är involverade i anpassningen av den centrala andningsdrift.
Introduction
C-fos-genen identifierades för första gången i början av 1980 1,2 och dess produkt präglades 1984 som ett nukleärt protein som har gen-aktivator egenskaper 3,4. Den deltar i långsiktiga mekanismer i samband med neuron stimulering. Faktiskt, förändringar i neuronal aktivitet leder till sekundära budbärarsystem signaleringskaskader som inducerar uttrycket av de omedelbara tidiga genen c-fos, vilket inducerar produktion av transkriptionsfaktorn c-fos. Den senare initierar uttryck av sena gener och därmed deltar i adaptiva svar i nervsystemet till många olika typer av stimuli 4. Således, sedan slutet av 1980 5,6, c-fos-proteindetektion har ofta använts för att studera effekterna av exogena faktorer på gentranskription i allmänhet 4 och på aktiviteten hos det centrala nervsystemet (CNS) för att kartlägga nervbanorna involverade i olika fysiologiskaal villkor.
Basal c-fos-uttryck har studerats i olika arter, inklusive möss, råtta, katt, apa och människa 4. Därigenom, kinetiken för dess uttryck är relativt väl känd. Transkriptionsaktivering är snabb (5-20 min) 7,8, och mRNA ackumuleringen når ett maximum mellan 30 och 45 min efter starten av stimuleringen 9 och avtar med en kort halveringstid på 12 minuter. C-fos-proteinsyntes följer mRNA-ackumulering och kunde detekteras genom immunhistokemi vid 20 till 90 min post-stimulering 6.
Analys av c-fos-uttryck är klassiskt används i in vivo-studier för att identifiera central andnings nätverk som deltar i ventilatoriska svar på hypoxi eller hyperkapni 10-14. På senare tid har det här verktyget används också i ex vivo hjärnstams förberedelser för att utforska centrala andningsnätverks anpassningar till hypoxi eller hypercapnia 15-18. Faktum är att dessa preparat genererar en rytmisk aktivitet klassiskt likställas med den centrala andningsdrift 19. Således, denna typ av preparat har fördelen av att vara helt deafferenterad och därför resultaten beträffande c-fos-uttryck endast återspegla konsekvenserna av en central stimulering utan något ingripande av perifera strukturer.
C-FOS detektion kan göras genom immunohistokemiska eller immunohistofluorescence metoder. Indirekt immundetektering nödvändiggör användningen av en primär antikropp mot c-fos och en sekundär antikropp riktad mot den art hos vilken den primära antikroppen producerades. För immunohistokemisk metod, är den sekundära antikroppen konjugerad med ett enzym (peroxidas, till exempel) som verkar på ett substrat (H2O 2 för peroxidas). Produkten av den enzymatiska reaktionen är utvecklad av en kromogen (3,3-diaminobensidin tetrahydrochloride), som färgar det och kan observeras under ljusmikroskop. Reaktionen kan förstärkas med hjälp av nickel ammoniumsulfat. Dessa metoder gör det möjligt för detektering av aktiva nervceller under olika fysiologiska utmaningar och därför identifiering och / eller kartläggning av perifera och centrala involverade i fysiologiska reaktioner i följd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: c-FOS upptäckt är ett standardiserat förfarande som inbegriper flera steg (Figur 1). Alla experiment utfördes på råttor eller möss. Experimentella protokoll godkändes av den etiska kommittén i djurförsök Charles Darwin (CE5 / 2011/05), sker i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv av den 22 september, 2010 (2010/63 / EU) för djurvård, och genomförs i enlighet med franska lagar för djurvård.
1. Beredning av lösningar
- Förbereda 0,2 M natriumfosfatbuffert: tillsätt 6,24 g NaH 2 PO 4 * 2 H2O och 22,56 g Na 2 HPO 4 * H2O till 1 L destillerat vatten under omrörning.
- Förbered 4% paraformaldehyd (PFA): tillsätt 20 g av PFA till 150 ml destillerat vatten. Värm lösningen till 80 ° C under omrörning. Att rensa lösning, minska värmen och tillsätt 1 eller 2 droppar av en N NaOH för att hjälpa paraformaldehyd upplösas. Komplett till 250 mlmed destillerat vatten och tillsätt 250 ml 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,4). Lagra vid 4 ° C. Ta lämplig vård när du använder dessa reagenser. Handtag med handskar, labbrock och skyddsglasögon enligt en kemisk huva.
Obs: Förbered 4% PFA dagen innan perfusion. Fastställa omfattningen av 4% PFA som en funktion av ålder, antal och arter av djur. - Förbereda kryoskyddande lösning: I 250 ml 0,2 M fosfatbuffrad koksaltlösning, blanda 5 g polyvinylpyrrolidon, 150 g sackaros och 2,5 g natriumklorid. Efter fullständig upplösning, tillsätt 150 ml etylenglykol och justera till 500 ml med destillerat vatten. Lagra den kryoskyddande lösningen vid 4 ° C.
- Förbereda 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS): tillsätt 18 g NaCl till 1 L destillerat vatten under omrörning. Efter fullständig upplösning, tillsätt 1 L 0,2 M natriumfosfatbuffert.
- Förbered Fosfatbuffrad saltlösning kompletterad med 0,3% Triton X100 (PBST): Tillsätt 3 ml Triton X100 till 997 ml PBS.
- Förbereda 0,05 M Tris-buffert (pH 7,6): tillsätt 3,03 g Tris-hydroklorid och 0,70 g Tris-bas till 500 ml destillerat vatten under omrörning.
- Förbereda 2% getserum i PBST: för en platta, framställa 30 ml lösning. Lägg 600 il getserum till 30 ml PBST och blanda väl. Tillsätt 2,5 ml per brunn.
Obs: Serum används måste komma från arter som används för sekundär antikroppsproduktion - Förbereda kanin-polyklonal antikropp mot c-fos-protein (1: 4000, sc-52) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%). För en platta, förbereda 30 ml lösning. Lägga 75 mg bovint serumalbumin till 30 ml PBST och blanda väl. Därefter, tillsätt 7,5 | il av kanin-polyklonal antikropp mot c-fos-proteinet.
- Förbereda biotinylerad get-anti-kanin-antikropp (1: 500) i PBST med serumalbumin från nötkreatur (0,25%). För en platta, förbereda 30 ml lösning. Lägga 75 mg bovint serumalbumin till 30 ml PBST och blanda väl. Lägg sedan till60 | il av biotinylerat get-anti-kanin-antikropp.
- Förbered avidin-biotin-peroxidas-komplex (1: 250) i PBST (ABC lösning). För en platta, förbereda 30 ml lösning. Lägg 120 pl av reagens A och 120 pl av reagens B till 30 ml PBST och blanda väl.
Obs: ABC lösning måste beredas minst 30 minuter före användning. - Framställa substratlösning. Omedelbart före användning framställa lösningen enligt följande (för en platta): tillsätt 20 mg av nickel ammoniumsulfat och 10 mg av 3,3-diaminobensidin-tetrahydroklorid till 50 ml Tris-buffert. Filtrera och skydda från ljus. Lägg 2,0 ml per brunn. I den kvarvarande lösningen (25 ml) tillsätt 17 | il av H2O 2 (H2O 2-lösning 30% i H2O). Lägg 2,0 ml per brunn.
Obs: Lämplig försiktighet bör iakttas vid användning av dessa reagens. Handtag med handskar och rockar.
2. c-fos InduInsatser och Tissue Processing In Vivo
Notera: Experiment utfördes på råttor (Sprague Dawley) eller möss (C57BL / 6).
- Placera djuren i en lufttät låda ventilerades med en hypoxisk (O 2 8% balanserad N2) eller hyperkapni (CO 2 4%, o 2 21% balanserad N2) gasblandning under 2 h (figur 2A).
- Söva djuret med intraperitoneal injektion av pentobarbital (100 mg / kg). BEGJUTA djuret transkardiellt med 4% PFA 20. Hantera varsamt och använd handskar enligt ett dragskåp.
- Efter perfusion, dissekera hjärnan 20 och doppa den i 7 ml 4% PFA i en 15 ml rör under 48 timmar vid 4 ° C. Ta sedan bort hjärnan från PFA och fördjupa det helt i kryoskyddande lösning. Förvaras vid -18 ° C (Figur 3). Förfoga över resten av djurets kropp med lämplig avfallsbehandlande pathway.
Obs: kryoskydd är ett steg mellan PFA fixering och frysning. Det minskar bildandet av iskristaller i cellerna med en lösning, vars frys kommer att vara i amorf form. De fasta proven måste impregneras i kryoskyddande lösning (framställd i steg 1,3) under minst 24 timmar vid 4 ° C. Hantera varsamt och handskar i dragskåp.
3. c-fos induktion och Tissue Processing Ex Vivo
Obs: Experiment utfördes i nyfödda råttor eller möss bara.
- Isolera CNS såsom beskrivits av Suzue 19. Placera den i en inspelning kammare och superfuse det kontinuerligt med artificiell cerebrospinalvätska med en hastighet av 7,5 ml / min vid 26 ° C 21 (aCSF: i mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl2, 1,0 MgCl2, 26,0 NaHCO 3, 30,0 D-glukos; mättad med O 2 och justerades till pH 7,4 genom gasning med 95% O2 och 5% CO2) (Figur 2B).
- Ersätta aCSF med en deoxygenerad aCSF (samma sammansättning bubblades med 95% N2 och 5% CO2, pH 7,4) för hypoxi eller av en surgjord aCSF (standard aCSF med NaHCOs 3 reduceras till 10,0 mM, bubblades med 95% O2 och 5% CO2) under hyperkapni. Tillämpa stimulering under 30 min (figur 2B).
- Ex vivo, efter induktionsperioden, överföra CNS hos nyfödda möss eller råttor i 2,5 ml 4% PFA i en 2,5 ml rör under 48 timmar och förvaras vid -18 ° C i en kryoskyddande lösning för senare användning (Figur 3).
Obs: Ex vivo är det inte nödvändigt att BEGJUTA djur. En tidigare studie visar att små prover av mindre än 10 mm i diameter kan fastställas genom enkel diffusion 22. En noterad penetrations (avstånd, i mm, för fixerings diffusion in i vävnaden) för aldehyden är 2 eller 3 mm / h.4. Brainstem Sektione
Obs: Från detta steg till slutet, är protokollet strikt densamma för in vivo och ex vivo induktioner.
- Innan skivning, placera en individ väl sätter i en 12-brunnar och tillsätt 2,5 ml PBS i varje brunn.
- Gör serie koronala sektioner (40 pm) i hjärnstammen med en kryostat och samla dem i 12-brunnar. För hela den vuxna hjärnstammen, gör ca 70 skivor (Figur 3).
Obs: Det är möjligt att vävnadssektionen från flera djur parallellt i en platta.
5. immunhistologisk procedurer (tabell 1)
Obs: hela förfarandet sektionerna kvar i brunnen skär.
- Dag 1 - Endogen peroxidasaktivitet förstörelse, icke-specifik bindningsställe blockad, och inkubering med den primära antikroppen (Figur 4)
- Tvättasektionerna i 10 min med 0,1 M PBS vid RT (2,5 ml per brunn). Upprepa 3 ggr.
- Undertrycka den endogena peroxidasaktiviteten genom inkubering av koronala sektioner för 30 min vid RT med väteperoxid H2O 2, 3% i 0,1 M PBS (2,5 ml per brunn).
- Tvätta sektionerna under 10 min med 0,1 M PBS vid RT (2,5 ml per brunn). Upprepa 3 ggr.
- Blockera den icke specifika bindningsstället genom inkubering av koronala sektioner för en timme vid RT med getserum (2%) i PBST.
- Inkubera koronala sektioner för 48 h vid 4 ° C med en kanin-polyklonal antikropp mot c-fos-protein (1: 4000, sc-52,) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%) (2,5 ml per brunn).
- Dag 3 - Inkubation med sekundär antikropp och utveckling av en färgreaktion (Figur 4)
- Tvätta sektioner under 10 minuter med PBS 0,1 M vid RT (2,5 ml per brunn). Upprepa 3 ggr.
- inkuberakoronala sektioner för en timme vid RT med en biotinylerad get-anti-kanin-antikropp (1: 500) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%) (2,5 ml per brunn).
Notera: Undersökaren kan även använda en sekundär antikropp kopplad till en fluorescerande prob i detta skede. I det här fallet, stoppa protokollet i detta skede och undersöka direkt med hjälp av ett fluorescensmikroskop. - Tvätta sektionerna under 10 min med PBST vid RT (2,5 ml per brunn). Upprepa 3 ggr.
- Inkubera koronala sektioner för en timme med ett avidin-biotin-peroxidas-komplex (1: 250) i PBST (2,5 ml per brunn).
- Tvätta sektionerna under 10 min med PBST vid RT (2,5 ml per brunn). Upprepa 2 gånger.
- Tvätta sektionerna i 10 min med 0,05 M Tris-buffert vid RT (2,5 ml per brunn). Upprepa 2 gånger.
- Inkubera koronala sektioner med 0,02% 3,3-diaminobensidin-tetrahydroklorid, 0,04% nickel ammoniumsulfat och 0,01% väteperoxid i 0,05 M Tris-buffert (pH 7,6) ent RT (2,0 ml per brunn). I den kvarvarande lösningen (25 ml) tillsätt 17 | il H2O 2 (H2O 2-lösning 30% i H2O) (2,0 ml per brunn).
Obs: Utredaren bör fastställa utvecklingstider under ljusmikroskop. Emellertid 5 till 10 min ger bra färgningsintensitet. - När färgningsintensitet är optimal (kontrollerat under ljusmikroskop, se Figur 5 och Figur 6), stoppa reaktionen genom att tvätta sektionerna under 10 minuter med 0,1 M PBS vid RT (2,5 ml per brunn). Upprepa 4 gånger. Då, tvätta sektionerna med destillerat vatten.
- Provtagning montering (hantera varsamt och handskar i dragskåp)
- Mount sektioner seriellt på diabilder och lufttorka. För detta spred noggrant avsnitt i rostro-caudal order med borstar på bilderna. Märk bilderna enligt proverna.
- Dehydrera med absolut alhol: Doppa glasen i 30 sek vid RT i absolut alkohol bad. Upprepa två gånger.
- Klart med xylen: doppa bilderna i xylenbad under 3 min vid RT. Upprepa två gånger.
- Täck bilderna med monteringsmedium. För detta gäller 5 droppar monteringsmedium på bilden och sedan använda täckglaset genom att driva ut luftbubblorna. Lufttorka i 48 timmar.
6. Data och statistisk analys
- Undersök stycken under ett ljusmikroskop. Visuellt räkna FLI nervceller vid hög förstoring (200x) med hjälp av standardlandmärken 23,24. C-Fos punktformig färgning är lokaliserad i kärnan av nervceller.
- För varje analyserat område, räkna antalet c-fos-positiva celler per sektion och jämföra det genomsnittliga antalet mellan kontroll- och stimulerade betingelser. Beroende på normalitet av data använder oparade students t-test eller Mann-Whitney-test. Skillnader ansågs signifikanta om P0; 0,05. Rita fördelningen av FLI neuroner på en ritning (förstoring 100x) med hjälp av en ritning rör fäst vid mikroskopet och fotograferade med en digitalkamera (Figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C-FOS upptäckt är ett användbart verktyg som gör det möjligt att identifiera grupper av aktiverade celler under specifika förhållanden såsom hypoxi och hyperkapni in vivo (figur 2A) eller i situationer som efterliknar dessa villkor ex vivo (Figur 2B). In vivo, nyfödda, unga eller vuxna gnagare placerades i en lufttät låda i vilken den gasformiga miljön ständigt förnyas genom en gasblandning med en komposition exakt definierad i 30 till 180 min 13,25,26 (Figur 2A). Som agerar stimulering på hela kroppen, kan den relaterade förändringar i c-FOS reflektera både centrala och perifera aktiverade vägar. Ex vivo deafferenterad preparat innehållande förlängda märgen och ryggmärgen placerades i en kammare kontinuerligt superfuseras med en aCSF med olika nivåer av O2 eller pH i syfte att modellera hypoxiska eller hyperkapni betingelser (
CNS fixerades med PFA, antingen genom en perfusion via den systemiska cirkulationen in vivo, eller genom en nedsänkning ex vivo (Figur 3). På grund av denna skillnad, är ett fixativ diffusion längre ex vivo än in vivo. Således kan c-fos-signalen att påverkas, särskilt i djupa strukturer. Men eftersom c-FOS analys utförs alltid i en jämförande metod mellan kontroll och stimuleras in vivo djur eller ex vivo preparat, denna skillnad skulle inte störa med resultaten från en strikt jämförelse av kontroll och stimulerade data. Efter det var CNS cryoprotected, sektioneras och engagerade i immunohistochemical förfarande (Figur 3, Figur 4). På detta sätt har några andningshjärnstamsområden identifierats in vivo som modifierande deras aktivitet under hypoxiska eller hyperkapni utmaningar, inklusive retrotrapezoid kärnan (RTN), som är den viktigaste centrala platsen för CO2 chemoreception 10,13,28,29, den ventrolaterala medulla (VLM), som innehåller den inspiratoriska rytmgeneratorn 13, den kommissurala och median delar av nucleus tractus solitarius (c / mnts), som är de projektionsområden carotid organ ingång 13,25,26,30 (figur 5 ), och märg rafekärnor 12,13.
Ex vivo, i deafferenterad förhållanden, neuroner i det RTN och VLM har beskrivits att ändra sin c-fos-immunoreaktivitet under betingelser av reducerat O 16-18 februari. C-fos deskydd kan också kombineras med andra immunhistokemiska detekteringar att karakterisera fenotypen av aktiverade celler 14,31
Figur 1. Studera Design för användning av c-FOS Detection att kartlägga Neuronal strukturer som deltar i andnings Anpassningar till hypoxi eller Hyperkapni. Kronologiskt stegen c-FOS detekteringsteknik i CNS. CNS: centrala nervsystemet; IHC. Immunohistokemi klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. C-FOS induktion. (A) In vivo-induktionsprotokoll. Ett djur placerades i en hermetisk cHamber och exponerades för antingen luft (21% O2; 79% N2), hyperkapni (21% O2; 4% CO2; 75% N 2) eller hypoxiska (10% O2; 90% N2) gas blandningen under 2 h. (B) Ex vivo induktionsprotokollet. CNS dissekerades ut från nyfödd gnagare i åldern 0 till 4 dagar. Förlängda märgen och ryggmärgen isolerades under förstoring för att erhålla förberedelserna. De placerades i en kammare med den ventrala ytan vänd uppåt, superfuseras med aCSF (pH 7,4) vid 26 ± 1 ° C. Modellering hypoxisk stimulering in vivo utfördes genom att minska den del av O 2 i aCSF genom att bubbla en anoxisk gasblandning innehållande 95% N2 och 5% CO2. Modellering hyperkapni stimulering in vivo utfördes med användning av en syra aCSF som skilde sig från normal aCSF i termer av NaHCOs 3 koncentration (minskning). Syran aCSF är mättad med O2 och justerbasted till pH 7,23 genom att bubbla med 95% O2 och 5% CO2. Varje stimulerings villkoret applicerades under 30 min. aCSF. artificiell cerebrospinalvätska Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. centrala nervsystemet Provtagning. In vivo CNS erhölls genom dissektion efter fixeringsförfarande med användning av 4% paraformaldehyd perfusion via kärlsystemet. Ex vivo var CNS direkt nedsänkt i 4% paraformaldehyd efter dissekering. Därefter CNS kryoskyddades genom nedsänkning i en kryoskyddande lösning och skivad i 40 um tjocka koronala sektioner med hjälp av en kryostat. De rostro-kaudala sektioner av medulla placerades i en 12-brunnars platta innehållande PBS before immunhistokemiska förfaranden. CNS: centrala nervsystemet; PBS. Fosfatbuffrad saltlösning klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Indirekta Immunohistokemiska förfaranden. Sektionerna inkuberades först med en kanin polyklonal primär antikropp mot c-fos-proteinet. Efteråt behandlades de med en biotinylerad get anti-kanin sekundär antikropp mot den primära antikroppen. Efter denna inkubering sektioner behandlas med ett avidin-biotin-peroxidas-komplex, som är tätt binder till den sekundära antikroppen för att förstärka signalen. I själva verket innehåller komplexa flera peroxidas molekyler som leder till en hög färgningsintensitet. Slutligen har sektioner färgades med användning av en lösning av 3,3-diaminobenzidine tetrahydro och nickel ammoniumsulfat, vilket ger en mörkgrå fällning i närvaro av peroxidasenzymet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. c-FOS-positiva neuroner på delar av förlängda märgen i kontrollmöss och möss överlämnats till hypoxi in vivo. (A) Teckning av en del av förlängda märgen anpassas från Paxinos och Franklin 24 (Bregma -7, 48 mm ). Den streckade området avgränsar de commissural och median delar av kärnan Tractus solitarius c / mnts. Lådan illustrerar strukturerna som illustreras av mikrofotografier (B1 och B2). (B) Photomicrographs utförs (x100) på c / Mnts nivå normoxi (B1. kontroll, svart ram) eller under hypoxi (B2. blå ram). Svarta pilar visar c-fos-positiva celler. (C) Histogram visar medelantalet c-FOS-positiva celler per avsnitt på c / Mnts nivå normoxi (svart fält) eller under hypoxi (blåa fältet). Värden uttrycks som medelvärde ± SD. * Indikerar en signifikant skillnad mellan normoxi och hypoxi värden - Students oparade t-test; *** P <0,001. CC: central kanal av ryggmärgen; c / mnts. commissural och median delar av kärnan tractus solitarius Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Immunohistological ordningen. Kronologiskt steg av CFOS förfarande. Ab-I, primär antikropp; Ab-II, sekundär antikropp; BSA, bovint serumalbumin; DAB, 3,3-diaminobensidintetrahydroklorid; Ni, nickel ammoniumsulfat; PBS 0,1 M, 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4); PBST, 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning kompletterad med 0,3% Triton X-100; Serum, serum från arter som används för sekundär antikroppsproduktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-fos är en omedelbar tidig gen, och detekteringen av dess produkt, c-fos-protein, är klassiskt används för att identifiera neuronala populationer som är involverade i specifika respiratoriskt svar in vivo 11,13,25,28 och ex vivo 16-18, 27,32,33.
Kritiska steg inom protokollet
Var försiktig under perfusion steget. Den 4% PFA lösning måste vara väl förberedda och fixerings och postfixeringsstegen måste vara tillräckligt lång för att erhålla optimal skivning och färgning. Vidare är uppenbarelsen det viktigaste steget i förfarandet; intensiteten av färgningen bör styras för att undvika bakgrundsljud.
Fördelar med teknik och betydelse med hänsyn till befintliga metoder
Även om vissa nervceller inte tycks uttrycka c-fos-genen 5, detta migThOD har visat sig vara användbara för att bestämma nervbanor aktiverad, till exempel i andningsrytm anpassning under kemiska utmaningar. Jämfört med andra omedelbara tidiga gener, har c-fos en låg expression i frånvaro av stimulering, vilket tillåter enklare kvantifiering av neuronal aktivitet enligt ett testsituationen 6.
C-FOS upptäckt är en cellulär teknik som anger globala förändringar i verksamheten för att analysera neuronala populationer som är involverade i svar på flera stimuli. Jämfört med nervaktivitet analys med hjälp av en elektrofysiologisk metod, som för det mesta gäller endast ett litet antal av celler i ett definierat område i hjärnan, medger c-FOS upptäckt en att uppskatta förändringar av aktivitet i ett stort antal celler och därmed definiera aktiv områden i hela CNS. C-FOS upptäckt är lätt kompatibel med ohämmad och vakna djur, vilket inte är fallet vid nervaktivitet inspelning av elektrophysiology. Detta är en fördel eftersom det undviker stress och störningar av anestetika med de erhållna resultaten.
Ex vivo, använde vi en 30 min period av stimulering. Det har tidigare visat att denna stimulering är tillräcklig för att inducera förändringar i c-fos-uttryck på neuronal nivå 34-36. Fem minuter av stimulering är tillräckliga för att framkalla förändringar i c-fos-uttryck, som observeras efter en latent period av 15 till 20 minuter 37. De relaterade ökningar i c-fos-uttryck är relaterade till förändringar i verksamheten sker under de första 10 min av stimulering.
Begränsningar av tekniken
Efter stimulering, är en fördröjning krävs innan ackumuleringen av c-fos i kärnan. Denna fördröjning av ca 30 min motsvarar mRNA och proteinsyntes. Denna post motsätter sig omedelbara resultat som kan vara obtasökte genom registrering av aktiviteten av nervceller med elektrofysiologi. Detta kan leda till en förlust av information om snabba förändringar i neuronal aktivitet efter en specifik och övergående stimulans.
Som c-FOS-proteinet kan ha en halveringstid på 90 till 100 min 4, kunde dess expression påverkas av de kirurgiska procedurer eller stress i samband med manipulering av djuret, dess begränsning, eller förändringar i dess miljö. Således är det nödvändigt att minimera manipulationer som kan framkalla förändringar i neuronal aktivitet inte är relaterade till den studerade stimulans och för att utföra vävnadsprovtagning omedelbart efter slutet av den fysiologiska stimulus.
Modifieringar och felsökning av tekniken
I detta protokoll, uppenbarelsen steget använde en lösning som innehöll 3,3-diaminobensidintetrahydroklorid, nickel ammoniumsulfat, och väteperoxid, men de kommersiella kit för peroxidas kunde alså användas för detta steg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
