Summary

Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

Published: February 22, 2016
doi:

Summary

Этот протокол представляет собой метод для выполнения количественного, для одной ячейки в месте анализа экспрессии белка изучать спецификации клонов у мышей преимплантационных эмбрионов. Процедуры, необходимые для сбора бластоцисты, вся монтажа обнаружение Иммунофлуоресцентной белков, томография образцов на конфокальной микроскопии и ядерного сегментации и анализа изображений описаны.

Abstract

Этот протокол представляет собой способ для выполнения количественной, одноклеточный на месте анализов экспрессии белка изучать спецификации клонов в мышиных эмбрионов предимплантационной. Процедуры, необходимые для получения эмбрионов, иммунофлюоресценции, визуализации на конфокальной микроскопии и сегментации изображений и анализа описаны. Этот метод позволяет количественное определение экспрессии нескольких ядерных маркеров и пространственные (XYZ) координаты всех клеток в эмбрионе. Он использует минут, при этом изображения инструмента сегментации программное обеспечение, специально разработанной для анализа конфокальных изображений преимплантационных эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) колоний. MINS осуществляет неконтролируемый ядерный сегментацию через X, Y и Z размеры, и производит информацию о положении клеток в трехмерном пространстве, а также уровень ядерные флуоресценции для всех каналов с минимальным пользовательского ввода. Хотя этот протокол был оптимизирован для анализа изображенийиз предимплантационной эмбрионов этап мыши, он может быть легко адаптированы к анализу любых других образцов, обладающих хорошим соотношением сигнал-шум и где высокая плотность ядер представляет препятствие для сегментации изображений (например., выражение анализ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК ) колонии, дифференцируя клеток в культуре, эмбрионы других видов или стадий, и т.д.).

Introduction

Мыши предимплантационной эмбрионов является парадигмой для изучения возникновения и поддержания плюрипотентности в естественных условиях, а также модели для изучения спецификации клеточных судеб и De Novo эпителизации у млекопитающих. В предимплантационная этапы развития млекопитающих посвящены созданию трех клеточных линий, которые составляют бластоцисты, а именно плюрипотентных эпибласте – что приводит к большинству соматических тканей и зародышевых клеток – и двух внеэмбриональные родах, то трофэктодерме (ТЕ) и примитивный эндодермы (предварительно) (1А) 1,2. Этот протокол описывает процедуры (1) эмбрионов урожай и исправить предимплантационной стадии мыши, (2) выполняет иммунофлюоресценции маркировать белки, представляющие интерес, (3) осуществляют весь монтажа изображений с помощью конфокальной микроскопии с Z-секционирования возможностей и (4) выполнить ядерной сегментацию конфокальных изображений и анализирует последующее количественное изображение. Этот трубопровод позволяет тон Несмещенные измерение уровней белка для присвоения клеточных идентичностей охарактеризовать субпопуляции клеток на месте. Этот протокол может быть осуществлена ​​в качестве лишь 3 – 4 дней в течение одного помета (как правило, до 10 эмбрионов мыши), из коллекции эмбриона к анализу данных (Фиг.1В). Одновременный анализ нескольких пометов приведет к увеличению изображения и анализа данных в реальном времени бремя, таким образом, расширяя общую длину протокола.

Эмбрион предимплантационной стадии мышь экспериментально сговорчивым система, которая, учитывая ее небольшие размеры и стереотипное морфология 3, хорошо подходит для в целом визуализации клеточных процессов с разрешением одноклеточного. Для того чтобы осуществить объективную, системы уровня анализа статистически соответствующее количество эмбрионов, автоматизированная, количественный анализ трубопровода желательно. Тем не менее, из-за высокой плотности ядер массы внутренней клеточной (ICM) бластоцисты ( <stRong> 1А, 2D), обычные сегментация изображения платформы не в состоянии обеспечить достаточную точность, чтобы установить автоматизированную или полуавтоматическую рабочий процесс. С другой стороны, руководство сегментации, в то время как точные, не позволяет обрабатывать большие когорты клеток и эмбрионов, а также не подходит для воспроизводимой, беспристрастной определения клеточных идентичностей – что особенно важно при изучении стадий развития, где формы маркера выражение не полностью решены (например, не проявляют бинарный дистрибутив через населением). Недавно мы разработали и утверждена метод сегментации изображений специально для мыши преимплантационных эмбрионов стадии и мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), что обеспечивает высокую точность, но требует ввода минимальные пользователя 4-8.

Трубопровод анализ, представленный здесь вращается вокруг MATLAB основе инструмента сегментации изображения Модульная Интерактивная ядерной сегментации (МИН) 4. MINS рerforms неконтролируемого ядерного сегментацию на больших партий конфокальной Z-стеки после того как пользователь установил минимальное количество свойств изображения, используя графический пользовательский интерфейс (GUI) (таблица 1) 4. Этот трубопровод доказала эффективность для генерации данных с высокой пропускной способностью на экспрессии белка и локализации клеток в обоих дикого типа, экспериментально обрабатывают и генетически модифицированные эмбрионы и стволовые клетки 5-7. В настоящем протоколе, мы опишем применение минут до сегментации зародыша изображений предимплантационной стадии. Примеры исполнения минут на ESCs см до 4,7. Автоматизированная шаг ядерная сегментация позволяет значительно сократить время трудоемкости процесса идентификации ячейки, в то время как пространственные и флуоресценции измерений интенсивности позволит объективную определение клеточных идентичностей и генерацию трехмерных карт экспрессии генов доменов и положение клеток в эмбрионе (рис 1С </strong>). Кроме того, масштабируемость этого процесса делает его применимым к анализу отдельных пометов через многочисленные группы экспериментально обработанных эмбрионов или эмбрионов различных генетических фонов 5,6. MINS находится в свободном доступе на http://katlab-tools.org (программное обеспечение требует лицензии MATLAB).

Нет подход, разработанный на сегодняшний день не позволяет генерировать такие данные углубленных на экспрессию белка и локализации клеток в мышь преимплантационных эмбрионов. Все попытки до сих пор в количественном эти типы данных были ограничены в ручном определения и количественного числа клеток для различных групп населения в зародыше (либо полностью вручную, либо программного обеспечения при содействии) 9-19. Этот подход (включающий программное обеспечение мин) был специально для и протестирован на мышиных эмбрионов и предимплантационной ESCs; Тем не менее его производительность на других системах с высокой плотностью ядерной, хотя еще не проверялось, как ожидается, будет эквивалентна.

Protocol

Заявление по этике: Все животное работа, в том числе животноводства, селекции и жертвы был одобрен Институциональные животных уходу и использованию комитета Memorial Sloan Kettering Cancer Центра (IACUC), протокол # 03-12-017 мимо. 1. эмбрионов Примечание: Все животное ?…

Representative Results

Для облегчения интерпретации данных и представления, следует позаботиться, чтобы не повредить эмбрионов во время сбора и обработки, так что могут быть проанализированы все клетки и их взаимное расположение фиг.2А -. D приведены примеры неповрежденных бластоц?…

Discussion

Настоящий Протокол описывает метод для выполнения количественного анализа целом монтажа иммунофлуоресценции на предимплантационной эмбрионов этап мыши. Надежный протокол 22 иммунофлюоресценции следует высоким разрешением, целый монтажа конфокальной микроскопии и сегментаци…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.

Materials

Embryo collection
Blunt probe for plug checking Roboz RS-9580
Forceps Roboz RS-4978
Surgery scissors Roboz RS-5910
Glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C
Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece Sigma A5177
Longer rubber tubing Fisher 14-178-2AA   
M2 Millipore MR-015-D
FHM Millipore MR-024-D
Acid Tyrode's solution Millipore MR-004-D
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Bovine Serum Albumin  Sigma A9647
4-well plates Nunc/Thermo-Fisher 12-566-300   
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence
96-well U-bottom plates Fisher 14-245-73
Triton X-100 Sigma T8787
Glycine Sigma G7403
Horse serum Sigma H0146
Primary antibodies Concentration
CDX2 Biogenex AM392-5M 1:200
GATA6 R&D AF1700 1:100
GATA4 Santa Cruz sc-9053 1:100, 10 min fixation
GATA4 Santa Cruz sc-1237 1:100, overnight fixation
SOX17 R&D AF1924 1:100
Nanog ReproCELL RCAB0002P-F 1:500
OCT4 Santa Cruz sc-5279 1:100, 10 min to overnight fixation
DAB2 BD BD-610464 1:200
Secondary antibodies Life Technologies Various 1:500
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Name Company Catalog Number Comments
Imaging
35 mm glass-bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C
Name Company Catalog Number Comments
Segmentation
Computer running 64-bit Windows OS n/a Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software) Mathworks n/a
MINS (software) Free n/a http://katlab-tools.org

References

  1. Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
  2. Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
  3. Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
  4. Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
  5. Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
  6. Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
  7. Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
  8. Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
  9. Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
  10. Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
  11. Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
  12. Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
  13. Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
  14. Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
  15. Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
  16. Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
  17. Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
  18. Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
  19. Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
  20. Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
  21. Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  22. Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
  23. Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
  24. Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).

Play Video

Cite This Article
Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53654, doi:10.3791/53654 (2016).

View Video