Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

doi: 10.3791/53654 Published: February 22, 2016

Summary

Denne protokol viser en metode til at udføre kvantitativ, encellede in situ analyse af proteinekspression at studere afstamning specifikation i mus præimplantations embryoer. De procedurer, der er nødvendige til indsamling af blastocyster, hel-mount immunofluorescent påvisning af proteiner, er billeddannelse af prøver på en konfokal mikroskop, og nuklear segmentering og billedanalyse beskrevet.

Abstract

Denne protokol viser en metode til at udføre kvantitativ, encellede in situ analyser af proteinekspression at studere afstamning specifikation i muse præimplantations embryoer. De nødvendige procedurer for embryonindsamlingsteam, immunofluorescens, billedbehandling på en konfokal mikroskop, og image segmentering og analyse er beskrevet. Denne fremgangsmåde tillader kvantificering af ekspressionen af ​​multiple nukleare markører og den rumlige (XYZ) koordinater for alle celler i embryonet. Det udnytter MINS, et billede segmentering softwareværktøj specielt udviklet til analyse af konfokale billeder af præimplantations embryoner og embryonale stamceller (ESC) kolonier. MINS udfører ukontrollerede nuklear segmentering på tværs af X, Y og Z dimensioner, og producerer information om celle position i det tredimensionale rum, samt nukleare niveauer af fluorescens for alle kanaler med minimal brugerinput. Mens denne protokol er blevet optimeret til analyse af billederaf præimplantations fase musefostre, kan det let tilpasses til analyse af andre prøver, der udviser et godt signal-støj-forhold, og hvor høj nuklear densitet udgør en forhindring for billedsegmentering (f.eks., ekspression analyse af embryonale stamceller (ESC ) kolonier, differentierende celler i kultur, embryoner af andre arter eller stadier, etc.).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musen præimplantationsperioden embryo er et paradigme for at studere fremkomsten og vedligeholdelse af pluripotens in vivo, såvel som en model for studiet af celle skæbne specifikation og de ​​novo epitelialisering i pattedyr. Præimplantationsperioden stadier af pattedyrs udvikling er dedikeret til oprettelsen af ​​de tre cellelinier, der udgør blastocyst, nemlig pluripotente epiblasten - hvilket giver anledning til de fleste somatiske væv og kimceller - og to extraembryonic slægter, den trophectoderm (TE) og primitive endoderm (pRE) (figur 1A) 1,2. Denne protokol beskriver procedurer til (1) høst og løse præimplantationsperioden etape musefostre, (2) udføre immunofluorescens at mærke proteiner af interesse, (3) udføre hel-mount billeddannelse ved hjælp af en konfokal mikroskop med z-sektionering evner og (4) udføre nukleare segmentering af konfokale billeder og efterfølgende kvantitativ billede analyser. Denne rørledning tillader than uvildig måling af protein niveauer for tildeling af celle identiteter til at karakterisere subpopulationer af celler in situ. Denne protokol kan gennemføres i så lidt som 3 - 4 dage for en enkelt kuld (generelt op til 10 musefostre), fra embryonindsamlings- til dataanalyse (figur 1B). Den samtidige analyse af flere kuld vil øge billedbehandling og dataanalyse tid byrde, hvilket forlænger den samlede længde af protokollen.

Den præimplantationsperioden fase mus embryo er et eksperimentelt medgørlig system, som på grund af sin lille størrelse og stereotype morfologi 3, er velegnet til i toto billeddannelse af cellulære processer med enkelt-celle opløsning. For at udføre en fordomsfri, systemer-niveau analyse af et statistisk relevant antal embryoner, en automatiseret, kvantitativ analyse pipeline er ønskelig. Men på grund af den høje nukleare tæthed af den indre cellemasse (ICM) af blastocyst ( (f.eks ikke udviser en binær fordeling på tværs af en population). Vi har for nylig udviklet og valideret et billede segmentering metode skræddersyet til mus præimplantations embryoer og for mus embryonale stamceller (EKSF), der opnår høj nøjagtighed, mens kræver minimal brugerinput 4-8.

Analysen pipeline præsenteres her kredser om MATLAB-baserede image segmentering værktøj Modular Interactive Nuclear Segmentering (minutter) 4. MINS performs uovervåget nukleare segmentering på store partier af konfokal Z-stakke, efter at brugeren har etableret et minimalt antal billedegenskaber, ved hjælp af en grafisk brugergrænseflade (GUI) (tabel 1) 4. Denne rørledning har vist effektiv til generering af højkapacitets data om proteinekspression og celle lokalisering i både vildtype, eksperimentelt behandlede og genetisk modificerede embryoner og ESC 5-7. I nærværende protokol, beskriver vi anvendelsen af ​​minutter til segmentering af præimplantationsperioden-trins embryo billeder. For eksempler på MINS ydeevne på økonomiske og sociale råd henvises til 4,7. Den automatiserede nukleare segmentering trin reducerer den tid, byrden af identifikation celle processen, mens de rumlige og fluorescens målinger intensitet tillade en uvildig bestemmelse af celle identiteter og generering af tredimensionelle kort over genekspression domæner og celle position i fosteret (figur 1C 5,6. MINS er frit tilgængelige på http://katlab-tools.org (softwaren kræver en MATLAB licens).

Ingen tilgang udviklet til dato giver mulighed generation af sådanne dybdegående data om proteinekspression og celle lokalisering i mus præimplantations embryoer. Alle forsøg hidtil på at kvantificere disse typer af data er blevet begrænset til den manuelle beslutsomhed og kvantificering af celle numre til forskellige populationer i fosteret (enten helt manuelt eller software-assisteret) 9-19. Denne tilgang (indarbejde MINS software) er blevet skræddersyet til og testet på mus præimplantations embryoner og økonomiske og sociale råd; alligevel dens ydeevne på andre systemer med høj nukleare tæthed, selv om endnu uprøvet, forventes at være tilsvarende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik erklæring: Alt dyr arbejde, herunder dyrehold, avl og offer blev godkendt af Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), protokol # 03-12-017.

1. Embryo Collection

Bemærk: Alt dyr arbejde, skal være godkendt af institutionelle og lokale myndigheder og i overensstemmelse med lokale og institutionelle regler.

  1. Mate en jomfru hunmus med en frugtbar stud mandlige af de ønskede genotyper.
    Bemærk: Hvis oprette naturlige parringer, vælge hunner i brunst fase af estral cyklus øger chancerne for samleje på den ønskede dato. Hvis fremkalde superovulation, henvises til de protokoller, der er beskrevet i 20.
  2. Kontrol af tilstedeværelse af en vaginal prop i morgen under anvendelse af en stump sonde. Ideelt set gør dette før middag (12:00), som samleje propper går tabt i løbet af dagen. Overvej noon af detektering af vaginalprop embryoniske dag (E) 0,5.
  3. På den ønskede dag og tidspunkt for fosterudvikling, varme op M2 eller skylning holding medium (FHM) til RT eller fortrinsvis 37 ºC. Bemærk: Enten M2 eller FHM kan anvendes til skylning og håndtering embryoner. Når den ikke er i brug, gemme disse medier ved 4 ºC. Estimere brugen af ​​~ 2 ml medium fra hver uterus.
  4. Optø frosne 4% paraformaldehyd (PFA) i phosphatbufret saltvand (PBS) eller forberede nogle frisk opløsning. Anslå 500 pi 4% PFA opløsning pr brønd af en 4-brønds plade. Fix et kuld på hver brønd af en 4-brønds plade. Bemærk: Alternativt kan en 96-brønds plade anvendes til at fastsætte og lagre embryoner. Hvis du bruger en 96-brønds plade, bruge 100 ul PFA opløsning pr godt.
  5. Træk et glas Pasteur-pipette ved hjælp af en åben flamme til at tegne en kapillær ende på spidsen.
  6. Sacrifice kvinde ved cervikal dislokation eller CO2 inhalation eller som krævet af lokale og institutionelle regler. Det er ofte desirable at bekræfte aflivning af dyret ved cervikal dislokation.
  7. Spray maven af ​​dyret med 70% ethanol for at minimere hårtab og udfører en abdominal incision, først gennem huden og efterfølgende gennem kroppen væg (peritoneum) for at blotlægge de indre organer.
    Bemærk: Følgende trin beskriver proceduren for at indsamle blastocyster fra livmoderen af en gravid kvindelig mus på noget tidspunkt mellem E3.25 og E4.5 (figur 1A). For protokoller om indsamling af præimplantations embryoner tidligere end E3.25, se 20.
  8. Find livmoderen og fjerne fra dyret. Holder cervikal ende af livmoderen med en tang, skære gennem cervix og trække op forsigtigt at strække begge uterine horn.
  9. Trim fedt fra livmoderen, pas på ikke at gennembore livmodervæggen. Dette kan gøres nemt ved fjernelse, mens den stadig er fastgjort til legemet af dyret, som livmoderen kan strækkes ud. Alternativt er detkan gøres senere, under et dissektionsmikroskop, i RT PBS. For en mere detaljeret protokol om dissektion af livmoderen, se protokoller 5 & 8 20
  10. Skær over æggelederne, under æggestokkene, at frigive hele livmoderen, sted på en petriskål og dæk med PBS.
    Bemærk: Dette trin tillader også vask af overskydende blod eller andre rester fra livmoderen, hvilket letter efterfølgende blastocyst høst.
  11. Separate både livmoderhornene ved at skære gennem den proximale ende, på begge sider af livmoderhalsen og kassér livmoderhalsen. Adskille hvert æggelederen fra livmoderen ved at skære under tangen, der forbinder dem (figur 1A). Overfør begge horn til et fald på manipulation medium (enten M2 eller FHM) for embryonindsamlingsteam og manipulation.
  12. Under en dissektion mikroskop, flush blastocyster ud af livmoderen og ind i mediet ved at tvinge 0,5 - 1 ml M2 eller FHM gennem hver uterine horn fra livmoderhalsen åbning. Brug en 1ml sprøjte med en hypodermal nål. Bemærk: Nålen kan være stumpe ved hjælp af en arkivering sten for at undgå at rive uteri, selv om dette ikke er kritisk. En detaljeret diagram for uterin skylning kan findes i 21.
  13. Brug af dissektion mikroskop, lokalisere blastocyster, som vil blive spredt i hele dråbe medium. Tillad op til 1 - 2 min for blastocyster at synke til bunden af ​​skålen efter skylning. Brug af munden-kontrollerede, glas Pasteur pipette med en kapillær ende, indsamle alle blastocyster og overføre til en frisk dråbe medier.
  14. Skyl blastocyster ved at flytte dem gennem 2 - 3 dråber frisk M2 eller FHM. Flyt embryoner i grupper på 5 - 10 blastocyster ad gangen.
    Bemærk: Flytning større grupper på én gang vil fremskynde processen, men det vil også øge chancerne for et uheld at miste mange embryoner. Hvis uuddannet i brugen af ​​munden-kontrollerede pipetter, praktiserende embryo manipulation og overførsel bør overvejes før beginning eksperimentet.
  15. Fjern zona pellucida (ZP) fra uklækkede blastocyster (generelt <E4.0) ved kort vask dem i sur Tyrodes opløsning. Så snart ZP ikke længere er synlig, overføre blastocyster tilbage til manipulation medier. Behold kun embryoner i syre Tyrodes, så længe det er strengt nødvendigt, for at undgå skader på cellerne.
    1. Vær forsigtig ved håndtering blottede blastocyster, de overholder meget nemt til glas- og plastoverflader. Manipulation medium indeholder 4 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) for at forhindre vedhæftning, men syre Tyrodes eller PBS ikke derfor at reducere risikoen for skader eller tab af embryonerne ikke afhente mere end 2 - 5 nøgne blastocyster på et tidspunkt når manipulere dem i BSA-fri eller serumfrit PBS eller syre Tyrodes.
      Bemærkning: Alternativt belægge glaspipette med 1% BSA før anvendelse for at reducere vedhæftningen af ​​embryoner til glasoverfladen.
  16. Coat bunden af ​​hver brøndaf en 4-brønds vævskulturskål med et tyndt lag af 1% agar, til 0,9% NaCl forhindre embryoer i at klæbe til plasten. Alternativt tilsættes 4 mg / ml BSA til PBS (PBS-BSA).
  17. Fyld en brønd af det belagte 4-brønds vævskulturskål med 500 pi RT PBS (eller PBS-BSA) og en anden brønd med 500 pi 4% PFA i PBS.
  18. Skyl blastocyster i RT PBS og fix i 4% PFA i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Overførsel til PBS (eller PBS-BSA) efter fiksering.
  19. Hvis embryoner ikke vil blive behandlet med det samme, dække PBS indeholdende embryonerne med et lag af mineralsk olie for at forhindre fordampning (der fører til udtørring af prøven), og opbevar pladen ved 4 ºC.
    Bemærk: Forskellige fikseringsmetoder og tider kan anvendes afhængigt af forsøget, at epitoperne af interesse og antistofferne anvendes. Uanset hvilken den foretrukne metode, være konsekvent gennem hele ækvivalente eksperimenter for at lette efterfølgende sammenligning af farvningsresultaterne.
    Bemærk: Pausepunkt: Embryoner kan opbevares ved 4 ºC i PBS i op til flere uger før man går videre til næste trin. Sikre PBS er steril og / eller tilsættes 100 U / ml penicillin + 100 pg / ml streptomycin (Pen-Strep) for at forhindre bakteriel forurening (især ved anvendelse af PBS-BSA) foregribende langvarig opbevaring.

2. Immunofluorescens

  1. Udfør immunofluorescens bruger en protokol, der tidligere er blevet testet og vist sig at være robust for hel-mount immunfluorescens. Bemærk: Vi anbefaler, der er beskrevet i 22 og 11. I denne artikel førstnævnte vil blive beskrevet. Uanset hvilken den foretrukne metode, være konsekvent gennem hele ækvivalente eksperimenter for at lette sammenligningen af ​​farvningsresultaterne.
  2. Anvende en fleksibel, polyvinyl, klar, U-bund 96 brønd plade til at udføre de sekventielle trin i immunofluorescens-protokollen. Fyld hver brønd med 50 - 100 pi opløsning og flytte embryoner fra én løsningtil en anden med en L-formet mund pipette. Bemærk Denne fremgangsmåde minimerer forbruget af reagenser og letter sporing trin samt den parallelle farvning af flere forsøgsgrupper.
    1. Valgfrit: Coat bunden af ​​brøndene med et tyndt lag af 1% agar, 0,9% NaCl for at forhindre adhæsion af embryoner til plasten. Må ikke tilføje BSA til immunofluorescens løsninger.
  3. Forbered PBX (0,1% Triton X-100 i PBS). Hvis foregribe resultaterne af flere immunofluorescens eksperimenter, forberede 50 ml PBX og opbevares ved 4 ºC mellem eksperimenter.
  4. Forbered permeabilisering opløsning (0,5% Triton X-100, 100 mM glycin i PBS). Lav 1 ml (eller alt efter hvad der er nødvendigt) frisk permeabilisering løsning for hvert forsøg.
  5. Forbered blokerende opløsning (2% hesteserum (HS) eller 20% føtalt bovint serum (FBS) med Pen-Strep i PBS). Forbered 10 ml og opbevares ved 4 ºC mellem eksperimenter.
    1. Der er ikke observeret forskelle mellem ententype serum, dog være konsekvent i valget af blokeringsopløsning anvendes for tilsvarende eksperimenter.
  6. Skyl faste embryoner i 5 minutter ved stuetemperatur i PBX (~ 100 pi).
  7. Permeabilisere embryoner i 5 minutter ved stuetemperatur i permeabilisering opløsning (~ 100 pi).
  8. Skyl embryoner i 5 minutter ved stuetemperatur i PBX (~ 100 pi).
  9. Blok embryoner til 30 min til 1 time ved stuetemperatur i ~ 100 pi blokeringsopløsning. Dæk opløsningen med et lag af mineralsk olie for at forhindre fordampning eller holde i et fugtigt kammer.
    Bemærk: Embryoner kan blokeres i op til O / N perioder ved 4 ºC uden mærkbar forbedring eller skade i forhold til 30 min blokerende trin.
  10. Inkuber embryoner O / N ved 4 ºC i primært antistof / antistoffer fortyndet med blokerende opløsning (~ 100 pi). Dæk opløsningen med et lag af mineralsk olie for at forhindre fordampning eller holde i et fugtigt kammer.
    1. Bestem optimal fortynding for hver primært antistof forhånd. Se discussion og Materialer sektion for testede fortyndinger af en række antistoffer.
  11. Efter O / N inkubation skylles embryoner 3x i 5 minutter hver ved stuetemperatur i PBX (~ 100 pi).
  12. Blok embryoner til 30 min til 1 time ved stuetemperatur i ~ 100 pi blokeringsopløsning. Dæk opløsningen med et lag af mineralsk olie for at forhindre fordampning eller holde i et fugtigt kammer.
  13. Inkuber embryoner i 1 til 2 timer ved 4 * C i sekundært antistof / antistoffer fortyndet ved 4 ug / ml i ~ 100 pi blokeringsopløsning. Dæk opløsningen med et lag af mineralsk olie for at forhindre fordampning eller holde i et fugtigt kammer.
  14. Skyl embryoner 2x i 5 min hver ved RT i PBX.
  15. Flyt embryoner til foretrukne DNA pletten. Hvis du bruger Hoechst 33342, fortyndes til 5 ug / ml i PBS. Dæk opløsningen med et lag af mineralsk olie for at forhindre fordampning eller holde i et fugtigt kammer.
    Bemærk: Pause punkt: Hvis embryoner ikke bliver afbildet med det samme, kan de opbevares i up til flere uger i nuklear farvningsopløsning. I dette tilfælde sikrer PBS er steril og / eller tilføje Pen-Strep eller natriumazid for at forhindre bakterievækst og kontaminering.

3. Konfokal Imaging

Bemærk: Enkelte konfokale mikroskop konfigurationer vil kræve særlige erhvervelse parametre, der skal justeres for systemet og softwaren på plads. Men det følgende afsnit giver et sæt generelle regler at følge, der bør være gældende for en given installation.

  1. Ved hjælp af en fin mund pipette, gør mikrodråber PBS eller nukleare plet løsning på glasoverfladen af ​​en 35mm glas-bund fad og dæk med mineralsk olie. Som et alternativ, bruge en almindelig dækglas med silikone separatorer for at undgå at beskadige embryoner og tildækkes med en objektglas. Bemærk: Når du bruger en almindelig dækglas, embryoner kan ikke efterfølgende re-positioneret eller nyttiggøres i genotypning, derfor anbefaler vi kraftigt brug af glas-bundretter.
  2. Placer embryoner i mikrodråber og arrangere på en sammenhængende måde, gerne med ICM-hulrum akse parallel med glasoverfladen. Opsæt parabol på indehaveren af ​​mikroskopet. Bemærk: Billeder opnået på laserscanning konfokale mikroskoper lider Z-aksen-associeret tab af fluorescens intensitet. Derfor konsistens i arrangementet er vigtig for at sammenligne intensiteter mellem tilsvarende regioner på forskellige embryoner.
  3. Opsæt reference- parametre ved hjælp af vildtype embryoner, der ikke har været genstand for nogen form for behandling, der kan ændre genekspression.
    1. Anskaf billeder ved hjælp af en stor forstørrelse objektiv (dvs. 40X eller højere) for at få data, der vil lette præcis segmentering ved hjælp af MINS værktøjet fire.
      Bemærk: Brug af digital zoom på en 20X mål vil ikke give billeder af tilstrækkelig opløsning til segmentering ved hjælp MINS. Man bør også bemærke den arbejdsafstand (WD) af målet, som det skal væretilstrækkelig til at tillade erhvervelse af en Z-stak, der spænder over en hel blastocyst, derfor lang WD (~ 130 - 150 um) mål er sædvanligvis nødvendigt. Vist i figur 2 billeder - 4 blev erhvervet ved hjælp af en 40X / NA 1,30 olie nedsænkning mål med en arbejdsafstand på 210 um.
    2. Brug den laveste laser output, som giver et stærkt signal-til-støj-forhold uden blegning fluoroforerne.
    3. Juster gain og offset for at opnå den bredeste dynamikområde uden overeksponere prøven. Udsættes billederne for at dække det meste af, eller spænder over hele, skala rækkevidde grå vil lette påvisning af små forskelle i intensitet mellem billeder.
    4. Brug en lille (1 um) Z-trin, da Z-aksen opløsning er kritisk for præcis segmentering med MINS.
      Bemærk: XY dimensioner påvirker ikke den nukleare segmentering proces, kun billede filstørrelsen. Generelt 512 x 512 pixels er en tilstrækkelig XY opløsning til offentliggørelse kvalitet billeder uden compromisynge plads på harddisken.
    5. Kritisk skridt: Hold billeddannelse parametre konsistente inden for og på tværs af billeddiagnostiske sessioner af det samme eksperiment for at kunne sammenligne prøver.
  4. Billeddannelse batcher af embryoner:
    1. Billede sammenhængende grupper (kuld, eksperimenter) i en enkelt session muligt.
    2. Hold parametre konsistente inden for og på tværs af billeddiagnostiske sessioner for gentagelser af det samme eksperiment.
    3. Billede embryoner hele (hele Z-akse) for at fange hver eneste celle.
      Bemærk: Hvis det ønskes, kan embryo genotypebestemmelse ske efter billeddannelse som beskrevet i 23. Behovet for nested PCR skal bestemmes empirisk og vil afhænge af det sted, der skal analyseres, og de anvendte primere.
  5. Sørg for at være i stand til at matche embryoner til billeder med tilbagevirkende kraft.

4. Image Analysis and Data Pre-behandling

  1. Hent og installer MINS 4 fra http: // Katlab-tools.org (MATLAB licens påkrævet).
  2. Udføre billede segmentering:
    1. Følg den grafiske brugergrænseflade (GUI) af minutter at indlæse en konfokal billede eller stak fra harddisken, registrere de kerner og segment billedet. Læg hele Z-stak af rådata, mikroskop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Se tabel 2 for oplysninger om de enkelte trin og instruktioner findes på http://katlab-tools.org og fire. Når du er færdig, se resultatet af hvert trin ved at klikke på den tilsvarende 'Vis' knappen. En gul tag over knappen angiver operation i processen, en grøn tag indikerer operation afsluttet.
      Bemærk: MINS øjeblikket ikke .czi filer, .tiff sekvenser eller multi-position filer - hver Z-stak skal være en uafhængig fil.
    2. Efter tilfredsstillende segmentering, gemme rørledningen skabt, så det kan bruges direkte til andre embryoner eller kuld.
  3. Batch-Mode segmentering:
    Bemærk: Single filer kan være segmenteret individuelt. Eftersom embryoner inden for et kuld eller eksperiment er generelt af sammenlignelige fase, kan MINS anvende segmenteringen pipeline skabt til et enkelt billede til en gruppe af dem uden opsyn.
    1. Fra menuen Batch-Mode Kør, klik på 'Tilføj filer "og indlæse alle filer, der skal behandles på en gang. Bemærk: Filer fra forskellige kilder kan sættes til segmentering køen.
    2. Klik på 'Start Batch-Mode Kør' og give tid til software til at behandle filerne. Bemærk: Segmentering output vil blive gemt i den samme mappe, hvor de originale filer, hvor placeret.
  4. vurdering Segmentering og manuel korrektion
    Bemærk: MINS segmenter billeder med meget stor nøjagtighed (> 85%), dog kan kvaliteten af ​​farvningen og billeddannelse, samt tidspunktet for embryo, påvirker MINS ydeevne. Generelt, jo højere den nukleare massefylde inden embryonet, jo mere sandsynligt segmentering fejl tage place (figurerne 2D, 3). Således bør segmentering nøjagtighed evalueres for hver prøve og manuelt korrigeres, hvis nødvendigt. To typer af fejl opstår typisk: over-segmentering og under-segmentering.
    1. Løsning over-segmentering:
      1. Identificer falske positiver - apoptotiske vesikler (figur 3A a, b, d, asterisker) eller andre elementer, der ikke er intakte kerner, men som kan være blevet identificeret som sådan af MINS.
        Bemærk: Generelt sådanne falske positiver har en mindre størrelse end reelle kerner og kan, i de fleste tilfælde, kan let identificeres og sorteres på regnearket. Imidlertid er visuel undersøgelse anbefales kraftigt, som oftentimes kerner kan kun delvist segmenteret, hvilket resulterer i en mindre, men gyldig segmenteret volumen (figur 3A B, pilespids).
      2. Slet de tilsvarende poster for falske positiver fra * statistics.csv fil. Bevar de oprindelige * statistik.csv fil til fremtidig reference og redigere kun en kopi af den.
      3. Hvis en kerne har været over-segmenteret og præsenteres som 2 eller flere kerner (figur 3A c, pil og pilespidser), enten fusionere posterne som gennemsnittet deres intensitet niveau eller, hvis lignende, beholde en af posterne for at celle og kassér hvile.
    2. Løsning under-segmentering:
      1. Identificere begivenheder, hvor MINS har undladt at detektere grænsen mellem to eller flere kerner og følgelig segmenteret dem som en enkelt kerne (figur 3A d, pil og 3B). Bemærk: Dette er et problem for en nøjagtig celletal, men endnu vigtigere, til kvantificering protein niveauer, som niveauerne målt vil være gennemsnittet af de celler, der har været fejlagtigt fusioneret, og som kan tilhøre forskellige slægter.
      2. Identificer begivenheder, hvor MINS har undladt at registrere en kerne helt.
      3. I disse tilfælde (4.4.2.1 og 4.4.2.2), måle de gennemsnitlige gråtoner feller hver kanal i under- eller un-segmenteret celle (r) ved hjælp af et alternativt værktøj, såsom ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), og erstatte den fejlagtige rekord med de korrekte niveauer. Bevar den originale * statistics.csv fil til senere brug og kun redigere en kopi af den. For at gøre dette ved hjælp ImageJ at følge disse trin:
        1. Åbn den relevante multi-kanal stak på ImageJ og importere den tilsvarende * overlaid.tiff fil genereret af minutter, som en virtuel stak ( 'Filer ">" Import ">" TIFF virtuel stak ... «).
        2. Find en medial sektion af under- eller un-segmenteret kerne.
        3. Brug af frihånd markeringsværktøj skitsere omkredsen af ​​den under- eller un-segmenteret kerne på DNA pletten kanal.
        4. Tryk Crl + M (Cmd + M på en Macintosh), eller gå til menuen Analyser, og vælg 'Measure «. Denne handling vil optage Mean grå værdi for området skitseret, og vil vise det på et nyt vindue. Gå til "Analyze">9 Set målinger ... "og sørg for 'Mean grå værdi er valgt. Vælg eventuelt andre parametre, der skal måles.
        5. Under anvendelse af samme område skitseret i trin 4.4.2.3.3, gentages målingen for hver af fluorescens kanaler af interesse. Resultaterne vil blive tilføjet til den foregående på målingerne 'resultater' vindue.
        6. Brug målingerne opnåede at erstatte de fejlagtige registreringer i * statistics.csv fil. Hvis kernen ikke var blevet segmenteret, indsætte en ny række, tildele den en ny celle-ID og indføre de værdier, der er opnået i ImageJ under den tilsvarende kolonne for hver kanal. Denne celle vil ikke have rumlige koordinater (X, Y og Z-værdier). Hvis kernen var blevet undersegmented, duplikere sin række, tildele forskellige Cell-id'er til hver ny celle og indføre de værdier, der er opnået i ImageJ under den tilsvarende kolonne. I dette tilfælde vil begge celler deler rumlige koordinater.
          Bemærk: hvis rumlige fordeling skal analyseres, vi recommend eksklusive XYZ koordinater af disse celler, da de vil overlappe. Til dette formål, når der oprettes nye poster, tildele Cell-id'er til dem, som er let skelnes fra de originale (f.eks ikke-heltal).
    3. Score delende celler. Bemærk: MINS detekterer mitotisk samt interfasen kerner, men kan ikke skelne mellem dem.
      1. Hvis mitotiske kerner skal betragtes særskilt i analysen, manuelt scorer disse og tilføje denne information til datafilen. For at optage mitotiske celler, tilføje en ny variabel (kolonne) til * statistics.csv datafilen og tildele forskellige værdier til mitose og interfase kerner.
  5. Data forbehandling.
    Bemærk: Når regneark er korrigeret for over- og under-segmentering, de er klar til at blive analyseret. Analyseprocessen og data præsentation vil afhænge af den specifikke eksperiment. Men nedenfor er nogle generelle data transformationerVi anbefaler at gennemføre inden analyse:
    1. Omdan fluorescensintensiteten værdier i deres logaritme eller kvadratroden at reducere spredningen af ​​dataene. Dette hjælper også visualisering, som de rå data tendens til at koncentrere nær akserne for grunden (se figur 4B, C).
    2. Korrigere Z-associerede dæmpning af fluorescens:
      Bemærk: Fluorescensintensitet i laserscanning konfokal mikroskopi billeder nedsætter dybere på Z-aksen en skive er placeret (fig 4E, F).
      1. Hvis en af ​​de fundne i prøverne epitoper er en allestedsnærværende og homogent udtryk husholdning nukleare markør, normalisere fluorescensintensiteterne af de andre epitoper ved at dividere deres værdier i hver celle af den tilsvarende værdi af husholdning markør.
      2. I mangel af en sådan henvisning markør, kompensere Z-associeret tab af fluorescens på følgende måde:
        1. Plot værdierne af hver markør (Yakse af grafen) over Z-positionen (X akse i grafen) til at visualisere faldet i intensitet over Z - plot sammen værdierne for al kontrol, vildtype embryoner (figur 4F).
        2. Monter en lineær model (regression kurve) til plottet opnået i det foregående trin (intensitet værdier over Z) for hver markør (fig 4F).
        3. Ret alle værdier for hver markør ved hjælp af følgende formel:
          log (oprindelige værdi) + Z * hældning af modellen (figur 4D, G).
          Bemærk: De specifikke trin for at udføre denne korrektion vil afhænge af den analyse software, der bruges (R, Matlab, etc.). Hvis du bruger R køre følgende formel til at passe en lineær model til data:
          > Lm (log (kanal) ~ Z, data = dataramme)
          hvor, kanal er fluorescensen kanal, der skal korrigeres, Z er Z-koordinaten og dataramme er tabel, der indeholder alle værdier for den ønskede embryo (er) (det * STATistics.csv fil genereret af minutter eller en modifikation af det).
          Bemærk: Resultatet af den ovenstående formel vil have følgende format:
          (Intercept) Z
          4,76373 -0,01947
          hvor værdien Z er hældningen på regressionslinien for at datasæt, som absolut værdi skal bruges til at ændre den oprindelige værdi med formlen i 4.5.2.2.3 (se figur 4G for et eksempel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at lette data fortolkning og præsentation, der skal sørges for ikke at beskadige de embryoner under indsamling og manipulation, så alle celler og deres relative position kan analyseres figur 2A -. D viser eksempler på intakte blastocyster på forskellige stadier med en udvidet hulrum. Skulle skader opstå, skal der tages ekstra forsigtig, når at analysere og fortolke resultater.

Kvaliteten og pålideligheden af ​​de data, der genereres ved hjælp af denne protokol er afhængig af kvaliteten af ​​fikseringen og på signal-til-støj-forhold af antistofferne anvendes til at detektere proteiner af interesse. Brug altid frisk fiksativ og afprøve nye antistoffer, med relevante positive og negative kontroller, før du begynder et sæt eksperimenter. Figur 2A viser eksempler på god antistoffer til en række nukleare proteiner. Figur 2B viser en example af en god antistof for et cytoplasmatisk protein (DAB2). Figur 2C viser et eksempel på en dårlig farvning, med lavt signal-til-støj-forhold, hvor prøven blev fastsat for kun 10 min. I dette tilfælde er antistoffet anvendes til GATA4 (Santa Cruz, sc-1237) kræver O / N fiksering for at tilvejebringe et stærkt signal (se 24 for forekomster af embryoner af O / N og farvet med dette antistof). Forøgelse af signalniveauet i efterbehandlingen afslører en meget støjende billede. Derimod anti-GATA4 anvendes til figur 2A (sc-9053) giver høj signal-til-støj-forhold efter kun 10-min fiksering. Detaljer for disse og andre robuste antistoffer findes i afsnittet Materialer.

De begrænsende faktorer for en god MINS segmentering er a) forstørrelsen af det mål, der anvendes til billedbehandling, b) Z-opløsning og c) kvaliteten af den nukleare farvning. Figur 2D viser eksempler på embryoner afbildet med en oil nedsænkning 40X målsætning med en NA på 1,30 og en 0,21 mm WD. Middle paneler viser forstørrelser af ICM'er hvor individuelle kerner og grænsen mellem dem kan skelnes. Hvis du ikke bruger DNA-farvning (dvs.., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, etc.) fluorescens værdier for kvantificering, parametre erhvervelse kan justeres individuelt for at opnå det bedste signal. Bundpaneler viser, hvordan mere avancerede embryonet, jo højere nukleare densitet og dermed jo større er chancen for segmentering fejl (pilespids og pil). Figur 3 viser eksempler på fejl, der MINS kan begå, såsom detektering apoptotiske kerner som levende celler ( stjernerne i paneler i figur 3aa, Ab, Ad), over-segmentering (pil og pilespidser i figur 3AC) eller under-segmentering (pil i figur 3 Ad). Figur 3B viser en sekvens af Z-skiver af en under-segmentering begivenhed, hvor to celler er blevet identificeret som en. Bemærk hvordan MINS segmentering tager Z-aksen i betragtning til at segmentere et volumen, der omfatter alle skiver, hvor en given celle er til stede.

Endelig vil detaljerne i dataanalyse afhænge af spørgsmålet under undersøgelse, derfor retningslinjer for analyseprocessen kan ikke gives her. Vi har imidlertid fundet visse indledende datatransformationer at være anvendelige Figur 4B -.. D viser plots af fluorescensen værdier for markørerne NANOG og GATA6 i ICM af embryonet vist i figur 4A Figur 4B viser de rå fluorescensværdier opnået fra MINS (efter manuel korrektion af under- og over-segmentering). Figur 4C viser de samme data efter en logaritmisk transformation, som adskiller værdierne fra plottet akser (en kvadratrod transformation er også muligt, og giver en lignende plot). Figur 4D viser de samme data efter automatisk correcting værdierne for Z-associerede dæmpning i fluorescens, som forklaret i trin 4.5.2.2 af protokollen. Eksempler på denne Z-associeret fluorescens henfald er givet i billedet i figur 4E og plottene i 4F. Figur 4G viser virkningen af transformationen dataene forklaret i 4.5.2.2. Farver, der repræsenterer enten epiblasten (rød, NANOG +, GATA6-) eller PRE (blå, NANOG-, GATA6 +) identitet er blevet tilføjet til plottet som funktion af den NANOG og GATA6 værdier. I dette særlige eksempel, celler, hvor forholdet mellem log [GATA6] / log [NANOG]> 1,25 blev anset Pre, celler, hvor forholdet mellem log [GATA6] / log [NANOG] <1 blev betragtet EPI, og celler med et mellemprodukt forholdet blev anset uforpligtede (ingen i dette tilfælde). Alle data transformationer og marker er blevet gjort i Rstudio imidlertid valget af software er ikke kritisk og vil afhænge af den endelige bruger.

"Figur Figur 1. Embryo Beliggenhed, Tidslinje og Analyse Pipeline. (A) Skematisk af en (af to) mus uterin horn og stadier af præimplantationsperioden udvikling, på linje med det område af hornet, hvor de skal findes. (B) Eksperimentel tidslinje med timing for hvert trin. Trin af protokollen og pause punkter (blå) er angivet. (C) Oversigt over erhvervelse billede og analyse rørledning ved hjælp MINS. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Eksempler på Immunofluorescens og nuklear Density. (A) Eksempler på gode immunofluorescens resultater med testede antistoffer til nuklear transcription faktorer. Anti-CDX2 blev påvist med en AlexaFluor 488 æsel-anti-muse-sekundært antistof, anti-GATA6 med en AlexaFluor 568 æsel-anti-gede, anti-NANOG med en AlexaFluor 647 æsel-anti-kanin, anti-GATA4 (Santa Cruz, sc-9053 ) med en AlexaFluor 488 æsel-anti-kanin og anti-OCT4 med en AlexaFluor 647 æsel-anti-muse. Alle primære antistoffer er anført i Materialer Tabel. Cytoplasmatisk GATA4 nuklear farvning er ikke-specifik, og synes også i Gata4 null embryoner (ikke vist). (B) Eksempel på god immunofluorescens for et cytoplasmatisk protein, DAB2. Det er blevet påvist ved anvendelse af en AlexaFluor 488 æsel-anti-muse. (C) Eksempel på dårlig immunofluorescens, med et lavt signal-til-støj-forholdet for en nuklear faktor. GATA4 er blevet detekteret med et anti-GATA4 rejst i ged (Santa Cruz, sc-1237, og at sc-9053 (kanin-anti-GATA4) blev anvendt i (A)) og en AlexaFluor 568 æsel-anti-ged. ( Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Eksempler på MINS fejl. (A) Sekvens af individuelle Z-sektioner fra et embryo viser eksempler på MINS segmentering fejl. Apoptotiske celler som ikke desto mindre er identificeret som kerner er markeret med en stjerne (*) i paneler a, b og d. I panel B, ID # 39 (pilespids), omend meget lille, betyder identificere den tilsvarende kerne og kan således efterlades ukorrigerede. I panel c, ID # 66 (pil) spænder to forskellige nuclei, som har til gengæld blevet identificeret separat (pilespidser, id'er # 65 # 54 og # 53). I panelet d, har to celler (ID # 63) blevet identificeret som en enkelt (se pilen markerer tynde grænse) og denne rekord bør derfor blive duplikeret for celletælling formål. (B) MINS detekterer celler langs Z-aksen. Billederne viser en sekvens af Z-skiver af to celler, der er blevet fejlagtigt mærket som en enkelt (# 123). Bemærk hvordan det blå område afgrænsning kernerne er kontinuert langs Z. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Eksempel på segmentering og Data Transformations. (A) Billeder af ICM celler af en blastocyst farvet for NANOG og GATA6 og øjebliksbillede af nukleare segmentering af sammeembryo hjælp minutter på det nukleare farvning kanal (Hoechst 33342). (BD) NANOG og GATA6 fluorescensværdierne i ICM-celler målt ved MINS plottet som rådata (B), efter at have udført logaritmisk transformation (C) og efter korrektion værdier for fluorescens henfald langs Z-aksen og automatisk tildeling celle identiteter baseret på det korrigerede værdier (D). Eksempler på korrektion data for fluorescens henfald langs Z-aksen - (G E). (E) Billeder af en blastocyst mærket med Hoechst og anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), som viser fluorescens fald langs Z-aksen. (F) Scatter plots af fluorescensværdierne langs Z-aksen for Hoechst og AF488 for en pulje af embryoner herunder den der er vist i (E). Grå linje repræsenterer regression kurve for hvert sæt af værdier. (G) samme data som i F, efter at kompensere fluorescens forfald for hver celleved anvendelse af følgende faktor: Z-koordinaten * hældningen af ​​den lineære model (se trin 4.5.2.2 i protokollen). Paneler E - G blev oprindeligt udgivet af forfatterne i Node (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Hver prik repræsenterer en celle. Scale = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

brugerinput
Lysstyrke tærskel * (letter nuklear detektion i dunkle billeder)
Relativ X / YZ opløsning
Kanal til segment
nuklear diameter
Billede støjniveau
MINS Output
Segmentering Z-stack med nuclei id'er
nuklear volumen
XYZ koordinater for hver kerne
Gennemsnit og summation af fluorescensværdierne for hver fluorescens kanal og nucleus
Fordele
Nøjagtig segmentering (> 85%) af kerner i hele stakken - genkender alle forekomster af en kerne i tilstødende z-sektioner
Enkelt celle opløsning
Unsupervised segmentering af partier af embryoner
Segmentering rørledninger kan enten gemmes og genbruges eller justeres for hver enkelt embryo

Tabel 1. MINS Egenskaber

Load Billede Ved prompten indføre Z relative opløsning forbillede. Den kan fås fra filen metadata ved hjælp af standard-reader eller anvende følgende formel: X (eller Y) opløsning / Z opløsning (alle i um).
Indtast løbenummeret (1 - 5) til den kanal, der skal segmenteret. Brug af DNA-farve kanal for segmentering vil detektere alle celler i billedet, men andre kanaler kan være segmenteret separat også.
Indtast rammen at begynde segmentering på (1 som standard). Gælder kun for filer med flere tidsrammer.
Forbedre Billede (valgfrit) Det hvide og sorte punkt i billedet kan justeres for at lette påvisning. Generelt sænke det hvide punkt og re-skalering 0 - 255 (for 8-bit billeder) eller 0-4096 (for 12-bit billeder) vil gøre billedet lysere og lette afsløringen af ​​dim kerner.
Detect Kerner Vælg den anslåede nukleare diameter (generelt mellem 30 og 40 px i blastocyster).
Til støjende billeder støjniveauet kan justeres. Ellers vil standardværdien blive anvendt.
Segment Kerner Brug standardparametre.
Classify Kerner MINS kan skelne trophectoderm (TE) fra indre cellemasse (ICM) celler i præimplantations embryoer baseret på positionen. Dette kan også gøres manuelt eller baseret på fluorescens niveauer, hvis der anvendes en TE markør.
Eksport Resultater Vælg de filer, der skal genereres:
- Segmentering overlejret over kanalen anvendte (.tiff sekvens fil),
- Segmentering eneste (.tiff sekvens fil),
- Regneark med id'er til alle celler detekteret, XYZ koordinater og fluorescens niveauer (gennemsnit og sum) for alle kanaler for hver celle (.csv-fil).
Alle filer eksporteres som standard. Filerne gemmes i same mappe, hvor billederne er placeret.

Tabel 2. MINS Segmentering Pipeline

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den nuværende protokol beskriver en metode til at udføre en kvantitativ analyse af hel-mount immunfluorescens på præimplantations scene museembryoer. En robust immunofluorescens protokol 22 efterfølges af høj opløsning, hel-mount konfokal billeddannelse og ved billedanalyse segmentering ved anvendelse af en skræddersyet stykke software 4. Mens valget af immunfluorescens-protokol er ikke kritisk, finder vi en præsenteres her 22 at være hurtig, pålidelig og at tilvejebringe robust signal for mange af antistofferne, vi har testet. Andre protokoller kan følges, forudsat at deres ansøgning er konsistent på tværs tilsvarende eksperimenter. Mens mange faktorer påvirker udfaldet af hver enkelt eksperiment, og direkte sammenligning mellem forsøgene er ikke nødvendigvis muligt, har vi fundet, at stræbe efter sammenhæng på tværs gentagelser og udføre tilstrækkelige tekniske replikater reducerer variation. Derfor, når optimeret, fiksering og immunolabeling reagenser og protokoller, samt billeddannende betingelser bør holdes konstant mellem tilsvarende eksperimenter.

De væsentligste problemer, der kan opstå under anvendelsen af denne protokol falder i to grupper: 1) dårlig kvalitet farvning, med dim signal, og 2) suboptimal segmentering, med mange fejl (dvs. over- og under-segmentering). Lav kvalitet immunfluorescens er generelt på grund af forkert fiksering af prøverne eller antistofferne ikke er egnet til hel-mount immunfluorescens. Sørg PFA er frisk (enten frisk tilberedt eller optøet til RT fra -20 ºC ikke længere end en uge før). I betragtning af den lille størrelse af præimplantations embryoer, bør 10-min fiksering i PFA tilstrækkeligt. Vi har imidlertid fundet visse antistoffer, hvilket gav et stærkere signal med længere fikseringstidspunkter (se Materialer). Hvis et antistof, der tidligere er blevet testet giver svagt signal, prøve forskellige fiksering protokoller. Ikke alle antistoffer udføre håndfast på hel-mount immunofluorescence og valget af primære antistof er kritisk for resultatet af forsøget. Nye antistoffer bør afprøves på fostre og den optimale koncentration bestemt empirisk. I Materialer diagrammet giver vi oplysninger om et antal antistoffer, vi har testet og bruge rutinemæssigt. Der henvises til offentliggjort litteratur eller producentens oplysninger, når de overvejer nye antistoffer. Bemærk at ikke alle antistoffer, der er egnede til Western blot-arbejde i hel-mount immunofluorescens, og koncentrationerne er nødvendige for immunfluorescens kan være op til en størrelsesorden højere. Kommercielle sekundære antistoffer virker generelt godt ud af kassen, dog være konsekvent i brugen af ​​primær-sekundær antistof kombinationer hele tilsvarende eksperimenter, vil blive sammenlignet.

Kvaliteten af ​​billedet segmentering afhænger både kvaliteten af ​​den nukleare farvning og på den nukleare tæthed i ICM af embryonet. stræbe Altid for lyse,skarpe kerner og bruge en høj opløsning mål (40X eller mere). Hvis det nukleare pletten signalet er lavt, skal du bruge en frisk portion eller et nyt parti. Så længe det nukleare pletten ikke anvendes til kvantificering, kan parametrene erhvervelse indstilles for hver foster for at registrere skarpe, lyse kerner. Ligeledes, hvis der anvendes en anden end den kernefarvning kanal for segmentering, vil signal-til-støj-forhold af den bestemte kanal bestemme kvaliteten af ​​segmenteringen. Sent tidspunkt blastocyster (E4.0 fremefter) præsentere en meget høj nukleart tæthed i ICM. Det er derfor på disse stadier, at høj kvalitet farvning er mest kritisk. Ikke desto mindre vil segmentering fejl finder sted oftest på disse stadier. Indføre den anslåede nukleare diameter og støjniveau billedet på MINS rørledningen, udforske resultatet af hvert trin ved hjælp af 'Vis' knappen og justere parametrene, indtil et tilfredsstillende resultat er opnået. Brug parametre, der producerer den bedste segmenteringog manuelt rette fejl under databehandling. Bemærk, at sene fase embryoner (~ E4.5) har en høj celletal og manuel data korrektion vil være tidskrævende.

Begrænsningerne i denne protokol bestemmes af konfokalmikroskop, der anvendes til erhvervelse billede. Som omtalt, bruge en høj-forstørrelse mål, med en arbejdsafstand, der tillader Z-aksen billeddannelse af hele embryo (præimplantations museembryoer kan nå op til 150-160 um i diameter). Tilsvarende vil antallet af epitoper, som kan detekteres bestemmes ved antallet af kanaler mikroskopet kan erhverve på en gang. Ved hjælp af denne protokol, kan tre forskellige epitoper udover DNA (4 kanaler i alt) mærkes samtidigt på hver prøve. Sikre instrumentet er kalibreret til hver fluorescens kanal, er gating optimeret, og at laseren output er konsekvent.

De her beskrevne fremgangsmåder tillader analyse af cellen position langsXYZ akser samt kvantificering af protein ekspressionsniveauer in situ for hver enkelt celle i museblastocyster. Det er vores erfaring, kan alternative metoder ved hjælp af en hvilken som helst anden tilgængelig software ikke give den grad af opløsning, at rørledningen anvendt i denne protokol kan (se 4 for en direkte sammenligning med andre værktøjer). Den høje nukleare densitet findes i ICM af blastocyst forårsager andre værktøjer til at generere så mange fejl, at omfanget af manuel korrektion gør deres anvendelse upraktisk. Alternativt er manuelle celletælling og fluorescensmålinger vaeret anvendt til undergrupper af celler eller definerede regioner af embryo 10,11,18,19,24. manuel optælling og måling af alle fluorescens-kanaler og celle position, på tværs af alle XYZ akser, for snesevis af celler til stede i hvert foster, vil dog være så tidskrævende, at det ikke ville give mulighed for high-throughput analyse for hvilke vores protokol blev udtænkt . Endvidere manuel enURDERING af fluorescensniveauer er tilbøjelig til bias, mens en rørledning, såsom den er beskrevet her tillader en objektiv måling af fluorescensintensiteter for efterfølgende bestemmelse af celle identitet. For at tildele celle identiteter, at investigator bør etablere en standard kriterium anvendes på tværs af alle prøver for en bestemt eksperimentel oprettet. I betragtning af de forskellige faktorer - biologiske og tekniske - der kan påvirke udfaldet af immunolabeling bør dette kriterium bestemmes ved hjælp af passende kontrol eksperimenter og tidligere offentliggjorte data hvor det er muligt. Vi forestiller os en nær fremtid, hvor en algoritme kan være udformet til automatisk bestemmelse af celle identitet uanset eksperimentet. Imidlertid vil et sådant værktøj kun komme fra mere omfattende anvendelse og forbedring af den nuværende metode, sandsynligvis koblet med machine learning algoritmer.

I betragtning af den enkelhed af denne rørledning og stereotype Morpholnologi af mus præimplantations embryoner, denne protokol er let skalerbar til analyse af et stort antal embryoner, således at high-throughput analyser af null fænotyper 5,6 eller andre eksperimentelle manipulation 7. Endelig, mens den nuværende protokol er designet og optimeret til analyse af præimplantations mus embryoner og ESC kolonier, ser vi ingen grund a priori, hvorfor det ikke kunne anvendes på andre systemer med lignende egenskaber - nemlig høj nukleare tæthed. Vi opfordrer andre til at eksperimentere og tilpasse denne protokol til andre scenarier og give feedback for dens fremtidige forbedringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Embryo collection
Blunt probe for plug checking Roboz RS-9580
Forceps Roboz RS-4978
Surgery scissors Roboz RS-5910
Glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C
Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece Sigma A5177
Longer rubber tubing Fisher 14-178-2AA   
M2 Millipore MR-015-D
FHM Millipore MR-024-D
Acid Tyrode's solution Millipore MR-004-D
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Bovine Serum Albumin  Sigma A9647
4-well plates Nunc/Thermo-Fisher 12-566-300   
Immunofluorescence
96-well U-bottom plates Fisher 14-245-73
Triton X-100 Sigma T8787
Glycine Sigma G7403
Horse serum Sigma H0146
Primary antibodies Concentration
CDX2 Biogenex AM392-5M 1:200
GATA6 R&D AF1700 1:100
GATA4 Santa Cruz sc-9053 1:100, 10 min fixation
GATA4 Santa Cruz sc-1237 1:100, O/N fixation
SOX17 R&D AF1924 1:100
Nanog ReproCELL RCAB0002P-F 1:500
OCT4 Santa Cruz sc-5279 1:100, 10 min to O/N fixation
DAB2 BD BD-610464 1:200
Secondary antibodies Life Technologies Various 1:500
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Imaging
35 mm glass-bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer running 64-bit Windows OS n/a Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software) Mathworks n/a
MINS (software) Free n/a http://katlab-tools.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145, (3), R65-R80 (2013).
  2. Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51, (4), 219-233 (2013).
  3. Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. (2015).
  4. Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2, (3), 382-397 (2014).
  5. Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141, (5), 1001-1010 (2014).
  6. Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29, (4), 454-467 (2014).
  7. Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10, (9), 1508-1520 (2015).
  8. Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
  9. Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119, (2), 520-531 (1987).
  10. Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134, (23), 4219-4231 (2007).
  11. Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135, (18), 3081-3091 (2008).
  12. Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313, (2), 594-602 (2008).
  13. Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136, (19), 3215-3222 (2009).
  14. Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137, (5), 715-724 (2010).
  15. Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (14), 6364-6369 (2010).
  16. Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137, (20), 3361-3372 (2010).
  17. Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350, (2), 393-404 (2011).
  18. Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140, (2), 267-279 (2013).
  19. Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141, (19), 3637-3648 (2014).
  20. Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  21. Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9, (3), 559-574 (2014).
  22. Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
  23. Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25, (14), 6289-6302 (2005).
  24. Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140, (21), 4311-4322 (2013).
Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53654, doi:10.3791/53654 (2016).More

Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53654, doi:10.3791/53654 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter