Arenavirus-सेल लगाव के मापन के लिए बेहद संवेदनशील परख
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenaviruses है कि प्रकृति में 1-3 कृन्तकों में मुख्य रूप से रखा जाता है छा, एकल असहाय आरएनए वायरस के एक परिवार के हैं। जबकि इन वायरस आमतौर पर कृंतक जलाशयों 1,2 में एक स्पर्शोन्मुख, लगातार संक्रमण की स्थापना, वे मनुष्यों 3 में गंभीर बीमारी का कारण बन सकता है। महत्वपूर्ण रोगजनक प्रजातियों नई दुनिया Junin वायरस (JUNV) 4 और पुरानी दुनिया लासा वायरस 5, जो etiologic अफ्रीका में दक्षिण अमेरिका और लासा बुखार में अर्जेंटीना रक्तस्रावी बुखार के एजेंट हैं, क्रमशः शामिल हैं। लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस (LCMV), परिवार के 6 prototypic वायरस, एक दुनिया भर में वितरण किया गया है और immunosuppressed में असुरक्षित व्यक्तियों 6 में सड़न रोकनेवाला मैनिंजाइटिस, विकासशील भ्रूण 7 में गंभीर जन्म दोष, या उच्च मारक सहित रोग राज्यों की एक किस्म के लिए जिम्मेदार है ठोस अंग प्रत्यारोपण 8,9 निम्न व्यक्तियों। संयुक्त राज्य अमेरिका की कमीखाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदित टीके या प्रभावी विषाणु-विरोधी इन वायरस से निपटने के लिए उपन्यास रणनीतियों उपचारात्मक इन उभरती / फिर से उभरते रोगजनकों निशाना बनाने के लिए विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण जरूरत पर प्रकाश डाला गया।
Arenavirus जीनोम दो एकल असहाय आरएनए क्षेत्रों, बड़े (एल) (~ 7.2 केबी) और छोटे (एस) (~ 3.6 केबी) खंडों 10 के होते हैं। जबकि एल खंड वायरल पोलीमर्स (एल) और मैट्रिक्स प्रोटीन (जेड) को कूटबद्ध एस खंड वायरल nucleoprotein (एनपी) और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) encodes। एल और एस जीनोमिक शाही सेना खंडों (vRNAs) virions 10-12 में पैक कर रहे हैं। Arenavirus संक्रमण के प्रारंभिक कदम वायरल कणों की कुर्की वायरल जीपी और अपनी इसी मेजबान सेल रिसेप्टर्स जो JUNV के लिए, मानव transferrin रिसेप्टर 1 (hTfR1) शामिल 13,14 के बीच एक संवाद के माध्यम से कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए है। कुर्की के बाद, JUNV कणों क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis 15 के माध्यम से सेल में रखा जाता है।कणों तो देर इंडोसोम जहां इस डिब्बे के कम पीएच जीपी 16,17 के सक्रियण चलाता है के लिए यातायात। एक बार सक्रिय, endosomal झिल्ली में जीपी इनकोडिंग संलयन पेप्टाइड सम्मिलित करता है, वायरल और endosomal झिल्ली के बीच विलय की शुरुआत। कोशिका द्रव्य, जहां वे जीनोमिक प्रतिकृति और प्रतिलेखन के लिए टेम्पलेट्स के रूप में सेवा में विरिअन पैक vRNAs की रिहाई में सफल संलयन का परिणाम है। जब वायरल संरचनात्मक प्रोटीन और vRNAs के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न कर रहे हैं, नए कण इकट्ठा और संक्रमित कोशिका से कली जीवन चक्र पूरा करने के लिए 18।
उपचारात्मक रोगजनक arenaviruses निशाना बनाने के लिए नई रणनीति की खोज की सुविधा के लिए, हमारे समूह मेजबान कारक है कि मेजबान के लिए वायरस के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन नगण्य हैं की पहचान पर ध्यान केंद्रित किया है। इस संदर्भ में, वायरल जीवन चक्र इस तरह मेजबान कारकों द्वारा नियंत्रित की सटीक मंच (ओं) को परिभाषित करने के लिए गाइड करने के लिए आवश्यक हैएंटीवायरल रणनीतियों का विकास। इस के साथ साथ, हम एक मात्रात्मक (क्यू) आरटी पीसीआर आधारित परख है कि चयनित मेजबान प्रोटीन और / या एंटीवायरल अणुओं वायरल प्रविष्टि 19 के इस प्रारंभिक चरण को प्रभावित करती है कि क्या पहचान करने के प्रयोजन के लिए arenavirus-सेल लगाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। Arenavirus-सेल लगाव को मापने के लिए वैकल्पिक तरीकों बायोटिन 20, फ्लोरोसेंट रंगों 21, या 22 रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ लेबल virions चित्रित किया है। इन तरीकों को कमियाँ इनपुट वायरस की एक बड़ी मात्रा, रेडियोधर्मिता का उपयोग (संक्रमण (MOI) जैसे उच्च multiplicities), और / या इनपुट वायरस (जैसे एकाग्रता और / या वायरस की लेबलिंग) तैयार करने के लिए अतिरिक्त कदम से निपटने के लिए आवश्यकता शामिल कर सकते हैं । विशेष रूप से, उच्च MOI के उपयोग के लिए यह मुश्किल अनुत्पादक लगाव घटनाओं 15,23 बनाम उत्पादक भेद करने के लिए बनाता है। QRT- पीसीआर आधारित यहाँ वर्णित परख के लिए के रूप में कुछ के रूप में 20 पट्टिका का उपयोग कर लगाव घटनाओं का पता लगाने कर सकते हैंमिंग इकाइयों के वायरस (PFUs) है, जो एक 48 अच्छी तरह से थाली के लिए 0.0004 के MOI में तब्दील हो। इसलिए, परख की मजबूत संवेदनशीलता उच्च MOI के लिए आवश्यकता के रूप में अच्छी तरह से किसी भी वायरस लेबलिंग या एकाग्रता कदम पर काबू। इसके अलावा, परख हो सकता है i) विरिअन endocytosis को मापने के लिए के रूप में अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में वायरस जीनोम की रिहाई के रूप संलयन निम्नलिखित अनुकूलित और द्वितीय) (उदाहरण के लिए वायरस-विशिष्ट QRT- पीसीआर अभिकर्मकों के विकास के माध्यम से अन्य वायरस के साथ प्रयोग के अनुरूप है, देखते हैं 24-27)।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल का वर्णन हम सीधा है और मजबूत निम्नलिखित महत्वपूर्ण विचार मनाया जाता है प्रदान की है। सबसे पहले, सख्त पूर्व पीसीआर तकनीक नियोजित किया जाना चाहिए (एक उत्कृष्ट समीक्षा के लिए 28 देखें)। यह आव…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अनुदान T32 AI055402 (जे), R21 AI088059 (जेबी), और P20RR021905 के माध्यम से उपयोगी विचार विमर्श और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान इन अध्ययनों के समर्थन के लिए (जेबी) के लिए मार्कस थाली, नाथन रॉय, क्रिस्टोफर Ziegler, एमिली ब्रूस, और बेंजामिन राजा धन्यवाद ।
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
