Saggio altamente sensibile per la misura dell'attaccamento Arenavirus-cell
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenavirus sono una famiglia di avvolgeva, virus a RNA a singolo filamento che si mantengono prevalentemente nei roditori in natura 1-3. Mentre questi virus in genere stabiliscono un asintomatica, infezione persistente in serbatoi roditori 1,2, possono causare gravi malattie negli esseri umani 3. Specie patogene importanti includono il virus Nuovo Mondo Junin (JUNV) 4 e il virus Vecchio Mondo Lassa 5, che sono gli agenti eziologici di febbre emorragica argentina in Sud America e febbre di Lassa in Africa, rispettivamente. Virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV), il virus prototipo della famiglia 6, ha una distribuzione a livello mondiale ed è responsabile di una varietà di stati patologici tra cui la meningite asettica nei soggetti immunocompetenti 6, gravi difetti di nascita nel feto in via di sviluppo 7, o ad alta letalità in immunodepressi individui a seguito solido-trapianto di organi 8,9. La mancanza di Stati UnitiFood and Drug Administration (FDA) -approvato vaccini o farmaci antivirali efficaci per combattere questi virus mette in evidenza la necessità critica di sviluppare nuove strategie per indirizzare terapeuticamente questi patogeni emergenti / ri-emergente.
Il genoma Arenavirus si compone di due segmenti a singolo filamento di RNA, la grande (L) (~ 7,2 kb) e piccolo (S) (~ 3,6 kb) segmenti di 10. Il segmento S codifica la nucleoproteina virale (NP) e glicoproteina busta (GP) mentre il segmento L codifica la polimerasi virale (L) e la proteina della matrice (Z). La L e segmenti di RNA genomici S (vRNAs) sono confezionati in virioni 10-12. Il primo passo di infezione Arenavirus è l'attaccamento di particelle virali per ospitare cellule attraverso una interazione tra il GP virale e le sue corrispondenti recettori della cellula ospite, che, per JUNV, comprende il recettore umano transferrina 1 (hTfR1) 13,14. A seguito di attaccamento, le particelle JUNV sono presi nella cella via clatrina mediata endocitosi 15.Le particelle quindi il traffico al fine endosome dove il basso pH di questo comparto determinerà l'attivazione della GP 16,17. Una volta attivato, gli inserti peptide di fusione GP-codificato nella membrana endosomal, avviando la fusione tra le membrane virali e endosomali. risultati di fusione di successo nel rilascio delle vRNAs virione-confezionati nel citoplasma, dove servono come modelli per la replicazione e la trascrizione genomica. Quando vengono generati una quantità sufficiente di proteine strutturali virali e vRNAs, nuove particelle assemblare e gemma dalla cellula infettata per completare il ciclo di vita 18.
Per facilitare la scoperta di nuove strategie per indirizzare le terapeuticamente arenavirus patogeni, il nostro gruppo si è concentrata sull'identificazione di fattori dell'ospite che sono fondamentali per la propagazione del virus, ma indispensabili per l'host. In questo contesto, definendo la fase precisa (s) del ciclo di vita virale controllata da tali fattori dell'ospite è necessario guidare lasviluppo di strategie antivirali. Qui, descriviamo un (q) saggio RT-PCR-based che può essere utilizzato per misurare allegato Arenavirus cellule al fine di identificare se le proteine ospitanti selezionate e / o molecole antivirali influenzano questa fase iniziale di ingresso del virus 19. Approcci alternativi per misurare l'attaccamento Arenavirus cellule hanno caratterizzato virioni etichettati con biotina 20, coloranti fluorescenti 21, o isotopi radioattivi 22. Inconvenienti di questi metodi possono includere il requisito per grandi quantità di virus in ingresso (ad esempio elevati molteplicità di infezione (MOI)), l'uso di radioattività, e / o fasi di manipolazione aggiuntivi per preparare virus in ingresso (ad esempio, concentrazione e / o l'etichettatura del virus) . In particolare, l'uso di alta MOI rende difficile distinguere produttiva rispetto eventi di fissaggio non produttive 15,23. Il saggio qRT-PCR-based descritto qui in grado di rilevare gli eventi di attacco utilizzando come pochi come 20 placca perunità Ming (PFUs) di virus, che si traduce in un MOI di 0,0004 per un piatto 48 pozzetti. Pertanto, la forte sensibilità del saggio supera il requisito per alta MOI nonché eventuali operazioni di etichettatura virus o di concentrazione. Inoltre, il test può essere i) atto a misurare virione endocitosi, nonché rilascio di genoma del virus nel citoplasma in seguito alla fusione e ii) su misura per l'utilizzo con altri virus attraverso lo sviluppo di reagenti qRT-PCR virus-specifici (per esempio, vedere 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo che descriviamo è semplice e robusta, purché siano rispettate le seguenti considerazioni critiche. In primo luogo, rigorosa tecnica di pre-PCR deve essere impiegato (si veda il 28 per un'eccellente recensione). E 'indispensabile che tutti i reagenti e le attrezzature sono privi di DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio qPCR e che i controlli appropriati sono in atto per rilevare tale contaminazione. In secondo luogo, per la parte di attacco virus-cellula del protocollo, il vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, e Benjamin Re per utili discussioni e il National Institutes of Health per il supporto di questi studi, attraverso borse di studio T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), e P20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
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