Summary

Test très sensible pour la mesure de l'attachement arénavirus-cell

Published: March 02, 2016
doi:

Summary

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Abstract

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

Introduction

Arénavirus sont une famille de virus enveloppés, d'ARN simple brin qui sont maintenus principalement chez les rongeurs dans la nature 1-3. Bien que ces virus établissent généralement, une infection persistante asymptomatique dans les réservoirs de rongeurs 1,2, ils peuvent causer des maladies graves chez l' homme 3. Espèces pathogènes importants comprennent le virus du Nouveau Monde Junin (JUNV) 4 et le virus Lassa Vieux Monde 5, qui sont les agents étiologiques de la fièvre hémorragique argentine en Amérique du Sud et de la fièvre de Lassa en Afrique, respectivement. Virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), le virus prototypique de la famille 6, a une distribution mondiale et est responsable d'une variété d'états pathologiques , y compris la méningite aseptique chez les personnes immunocompétentes 6, des malformations congénitales graves chez le fœtus en développement 7, ou létalité élevée en immunodéprimés personnes suivantes solide transplantation d' organes 8,9. Le manque de États-UnisFood and Drug Administration (FDA) CSEh vaccins ou des antiviraux efficaces pour lutter contre ces virus met en évidence le besoin critique de développer de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement ces agents pathogènes émergents / ré-émergentes.

Le génome de arénavirus se compose de deux segments simple brin d' ARN, la grande (L) (~ 7,2 kb) et petite (S) (~ 3,6 kb) 10 segments. Le segment S code pour la nucléoprotéine virale (NP) et de glycoprotéine d'enveloppe (GP), tandis que le segment L code pour la polymerase virale (L) et de la protéine de matrice (Z). Le L et S segments d'ARN génomique (ARNv) sont emballés dans des virions 10-12. L'étape initiale de l' infection est arénavirus fixation des particules virales aux cellules hôtes par le biais d' une interaction entre le GP virale et ses récepteurs de cellules hôtes correspondantes qui, pour JUNV, comprend le récepteur de la transferrine humaine 1 (hTfR1) 13,14. Après la fixation, les particules JUNV sont prises dans la cellule par l' intermédiaire de la clathrine endocytose 15.Les particules puis la circulation à la fin du endosome où le faible pH de ce compartiment déclenche l'activation du GP 16,17. Une fois activés, les inserts peptide de fusion GP-codées dans la membrane endosomale, initiant la fusion entre les membranes virale et endosomique. Résultats de la fusion réussie dans la libération des ARNv de virions-emballés dans le cytoplasme, où ils servent de modèles pour la réplication génomique et de la transcription. Lorsque des quantités suffisantes de protéines et ARNv structurales virales sont générées, de nouvelles particules se rassemblent et le bourgeon de la cellule infectée pour terminer le cycle de vie de 18 ans.

Pour faciliter la découverte de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement les arénavirus pathogènes, notre groupe a mis l'accent sur l'identification des facteurs de l'hôte qui sont essentiels pour la propagation du virus, mais dispensable pour l'hôte. Dans ce contexte, définissant le moment précis (s) du cycle de vie viral contrôlé par ces facteurs de l'hôte est nécessaire pour guider ledéveloppement de stratégies antivirales. Nous décrivons ici une analyse quantitative (q) de test à base de RT-PCR qui peut être utilisée pour mesurer la fixation arénavirus des cellules dans le but d'identifier si les protéines hôtes choisies et / ou des molécules antivirales influencent cette phase initiale de la pénétration du virus 19. D' autres approches pour mesurer l' attachement arénavirus cellules ont présenté des virions marqués avec de la biotine 20, des colorants fluorescents 21, ou des isotopes radioactifs 22. Les inconvénients de ces méthodes peuvent inclure l'exigence de grandes quantités de virus d'entrée (par exemple , des multiplicités élevés d'infection (MOI)), l'utilisation de la radioactivité et / ou d' étapes de manipulation supplémentaires pour préparer le virus de l' entrée (par exemple , la concentration et / ou l' étiquetage des virus) . En particulier, l'utilisation de MOI élevé, il est difficile de faire la distinction productive par rapport à des événements de fixation improductives 15,23. Le test à base de qRT-PCR décrit ici peut détecter des événements de fixation en utilisant aussi peu que 20 pour la plaqueunités ming (UFP) du virus, ce qui se traduit par une MOI de 0,0004 pour une plaque de 48 puits. Par conséquent, la forte sensibilité de l'essai surmonte l'exigence de MOI élevé, ainsi que des mesures d'étiquetage de virus ou de concentration. En outre, le dosage peut être i) adapté pour mesurer virion endocytose ainsi que la libération du génome du virus dans le cytoplasme suivant la fusion et ii) adapté pour une utilisation avec d'autres virus à travers le développement de réactifs qRT-PCR spécifiques du virus (pour des exemples, voir 24-27).

Protocol

Remarque: Il est essentiel que le protocole décrit être effectuée en utilisant la technique de pré-PCR stricte (voir 28 pour une excellente vue d' ensemble sur la façon de mettre en place un laboratoire pré-PCR et la façon de mener des expériences en utilisant une technique bonne pré-PCR). Il est impératif que tous les réactifs et le matériel sont exempts d'ADN amplifié contenant la séquence cible qPCR et que les contrôles appropriés sont en place pour détecter une telle contamination. Un aperçu du proto…

Representative Results

Pour démontrer la sensibilité et la dynamique de l'essai qPCR, des quantités connues d'un plasmide codant pour le gène NP de JUNV C # 1 (gamme 5-5 x 10 7 copies) ont été soumis à qPCR comme décrit dans la section 4 du protocole. L'essai est sensible et peut détecter de manière fiable aussi peu que 5 copies de l'acide nucléique cible (figure 2). En outre, la plage dynamique de l'essai est grande et, comme le montre la figu…

Discussion

Le protocole que nous décrivons est simple et robuste à condition que les considérations critiques suivantes sont respectées. Tout d' abord, la technique stricte pré-PCR doit être utilisé (voir 28 pour une excellente revue). Il est impératif que tous les réactifs et le matériel sont exempts d'ADN amplifié contenant la séquence cible qPCR et que les contrôles appropriés sont en place pour détecter une telle contamination. Deuxièmement, pour la partie de fixation virus-cellule du protoco…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, et Benjamin roi pour des discussions utiles et les National Institutes of Health pour le soutien de ces études par le biais de subventions T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), et P20RR021905 (JB) .

Materials

DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument

References

  1. Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).

Play Video

Cite This Article
Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).

View Video