Hochempfindliches Verfahren zur Messung von Arenavirus-Zell-Anlage
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenaviren sind eine Familie von umhüllten, einzelsträngige RNA – Viren , die in erster Linie bei Nagern in der Natur 1-3 gehalten werden. Während diese Viren normalerweise asymptomatisch, persistierende Infektion in Nagetierreservoirs 1,2 etablieren, können sie schwere Krankheiten verursachen beim Menschen 3. Wichtige pathogene Arten gehören die Neue Welt Junin – Virus (JUNV) 4 und die Alte Welt Lassa – Virus 5, die die Erreger der argentinischen hämorrhagisches Fieber in Südamerika und Lassa – Fieber in Afrika sind, beziehungsweise. Lymphatische choriomeningitis Virus (LCMV), das prototypische Virus der Familie 6, hat eine weltweite Verbreitung und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheitszuständen einschließlich aseptischer Meningitis bei immunkompetenten Personen 6, schwere Geburtsschäden in den sich entwickelnden Fötus 7 oder hohe Letalität bei immunsupprimierten Einzelpersonen folgende Festorgantransplantation 8,9. Der Mangel an USAFood and Drug Administration (FDA) -genehmigte Impfstoffe oder wirksame Virostatika diese Viren unterstreicht die kritische Notwendigkeit zur Bekämpfung neuer Strategien zur Entwicklung therapeutisch diese neuen / wieder auftretender Krankheitserreger zu zielen.
Die Arenavirus – Genom besteht aus zwei einzelsträngigen RNA – Segmente, die große (L) (~ 7,2 kb) und klein (S) (~ 3,6 kb) Segmente 10. Das S-Segment codiert, das virale Nukleoprotein (NP) und Hüll-Glycoprotein (GP) während der L-Segment die virale Polymerase (L) und Matrixprotein (Z) kodiert. Die L- und S – genomischen RNA – Segmente (vRNAs) in Virionen verpackt 10-12. Der erste Schritt der Arenavirus – Infektion ist Anlagerung von viralen Partikeln Zellen durch eine Wechselwirkung zwischen dem viralen GP und der entsprechenden Wirtszellrezeptoren für JUNV, die Host, den menschlichen Transferrin – Rezeptor 1 (hTfR1) 13,14 enthält. Nach Befestigung werden JUNV Partikel in die Zelle über Endozytose 15 Clathrin-vermittelte genommen.Partikel dann Verkehr zu den späten Endosomen , wo der niedrige pH – Wert dieses Fach die Aktivierung von GP 16,17 auslöst. Einmal aktiviert, die GP-kodierte Fusionspeptid Einsätze in die endosomale Membran, die Einleitung Fusion zwischen den viralen und endosomalen Membranen. Erfolgreiche Fusion führt zur Freisetzung der Virionen verpackten vRNAs in das Zytoplasma, wo sie als Vorlagen für die genomischen Replikation und Transkription dienen. Wenn ausreichende Mengen an viralen Strukturproteine und vRNAs erzeugt werden, neue Teilchen zusammenstellen und Knospe aus der infizierten Zelle 18 , um den Lebenszyklus zu vollenden .
Um die Entdeckung neuer Strategien erleichtern, um therapeutisch die pathogenen Arenaviren Ziel hat sich unsere Gruppe auf die Identifizierung von Wirtsfaktoren konzentriert, die für die Virusvermehrung von entscheidender Bedeutung sind, aber entbehrlich für den Host. In diesem Zusammenhang die genaue Stadium der Definition (en) des Zyklus viralen Lebens durch solche Wirtsfaktoren gesteuert ist notwendig, die FührungEntwicklung von antivirale Strategien. Hier beschreiben wir eine quantitative (q) RT-PCR-basierten Assays , die verwendet werden können , Arenavirus-Zellanheftung zur Messung zur Identifizierung , ob ausgewählte Wirtsproteinen und / oder antivirale Moleküle beeinflussen diese Anfangsphase der Viruseintritt 19. Alternative Ansätze Arenavirus-Zell – Bindung zu messen , haben Virionen mit Biotin 20, fluoreszierende Farbstoffe 21, oder radioaktive Isotope 22 markiert gekennzeichnet. Nachteile dieser Verfahren kann das Erfordernis für große Mengen von Eingangs Virus (zB hohe Multiplizität der Infektion (MOI)) umfassen, die Verwendung von Radioaktivität, und / oder zusätzliche Handhabungsschritte Eingangs Virus (zB Konzentration und / oder die Kennzeichnung Virus) vorzubereiten . Insbesondere ermöglicht die Verwendung von hohen MOI es schwierig 15,23 produktiv im Vergleich zu unproduktiven Befestigung Ereignisse zu unterscheiden. Die qRT-PCR-basierte Test hier beschriebene Befestigungs Ereignisse mit so wenig wie 20 Plaque erkennen fürming Einheiten (PFU) des Virus, die für eine 48-Well-Platte in einer MOI von 0,0004 übersetzt. Daher überwindet die starke Empfindlichkeit des Tests die Forderung nach hoher MOI sowie alle Viren Kennzeichnung oder Konzentrationsschritte. Weiterhin kann die Assay sein i) Virion Endozytose sowie Freisetzung des Virusgenoms in das Cytoplasma nach Fusion und ii) angepasst für die Verwendung mit anderen Viren durch die Entwicklung von virusspezifischen qRT-PCR-Reagenzien (Beispiele zu messen angepasst, siehe 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll, das wir beschreiben, ist einfach und robust, sofern die folgenden kritischen Überlegungen beachtet werden. Zunächst strenge pre-PCR – Technik muss (siehe 28 für eine ausgezeichnete Bewertung) eingesetzt werden. Es ist zwingend notwendig, dass alle Reagenzien und Ausrüstung von amplifizierte DNA-frei sind die qPCR Zielsequenz und entsprechende Kontrollen an Ort und Stelle, die solche Kontamination zu erkennen. Zweitens, für das Virus-Zell-Befestigungsabschnitt des Protokolls, dem Virus, Zel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce und Benjamin König für hilfreiche Diskussionen und die National Institutes of Health für die Unterstützung dieser Studien durch Zuschüsse T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) und P20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
