Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Summary

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Abstract

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

Introduction

Arenavírus são uma família de vírus com envelope, de ARN de cadeia simples que são mantidas essencialmente em roedores na natureza ^1-3. Embora estes vírus tipicamente estabelecer uma infecção assintomática, persistente em reservatórios de roedores ^1,2, que pode causar doença grave em humanos ^3. Espécies patogênicas importantes incluem o vírus Novo Mundo Junin (JUNV) ⁴ e o vírus Old Lassa Mundial ^5, que são os agentes etiológicos da febre hemorrágica argentina na América do Sul e da febre de Lassa na África, respectivamente. Vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), o vírus protótipo da família ^6, tem uma distribuição mundial e é responsável por uma variedade de doenças, incluindo meningite asséptica em indivíduos imunocompetentes ^6, defeitos congênitos graves no feto em desenvolvimento ^7, ou de alta letalidade em imunossuprimidas indivíduos na sequência de órgãos sólidos transplante ^8,9. A falta de Estados UnidosFood and Drug Administration (FDA) -aprovado vacinas ou medicamentos antivirais eficazes para combater estes vírus destaca a necessidade crítica de desenvolver novas estratégias para atingir terapeuticamente esses patógenos emergentes / re-emergente.

O genoma arenavírus consiste em dois segmentos de ARN de cadeia simples, a grande (L) (~ 7,2 kb) e pequena (s) (~ 3,6 kb) segmentos ^10. O segmento S codifica a nucleoproteína viral (NP) e a glicoproteína do envelope (GP), enquanto o segmento L codifica a polimerase viral (L) e proteína de matriz (Z). O L e segmentos de ARN genómico S (ARNv) são empacotados em viriões ^10-12. O passo inicial de infecção arenavírus é a ligação de partículas virais às células hospedeiras através de uma interacção entre o GP viral e os seus receptores de células hospedeiras correspondentes que, por JUNV, inclui o receptor de transferrina humana 1 (hTfR1) ^13,14. Após a ligação, as partículas JUNV são levados para dentro da célula através de endocitose mediada por clatrina ^15.Partículas de tráfego, em seguida, para o final do endossoma onde a baixo pH deste compartimento desencadeia a activação da GP ^16,17. Uma vez activadas, as inserções de péptidos de fusão codificada-GP na membrana endossomal, iniciando a fusão entre as membranas viral e endossomais. resultados da fusão de sucesso na liberação dos vRNAs embalados-virion no citoplasma, onde servem como modelos para replicação genômica e transcrição. Quando uma quantidade suficiente de proteínas estruturais virais e ARNv são gerados, novas partículas de montar e botão da célula infectada para completar o ciclo de vida ^{de 18 anos.}

Para facilitar a descoberta de novas estratégias para atingir terapeuticamente os arenavírus patogênicos, o nosso grupo tem-se centrado na identificação de factores do hospedeiro que são críticas para a propagação de vírus, mas dispensável para o anfitrião. Neste contexto, a definição do estádio preciso (s) do ciclo de vida viral controlada por esses factores do hospedeiro é necessária para guiar odesenvolvimento de estratégias antivirais. Aqui, nós descrevemos um (Q) ensaio quantitativo com base em RT-PCR que podem ser utilizados para medir a ligação de células arenavírus para o propósito de identificar se as proteínas hospedeiras seleccionadas e / ou moléculas antivirais influenciar esta fase inicial da entrada viral ^19. Abordagens alternativas para medir a fixação de células arenavírus têm caracterizado viriões marcados com biotina ^20, corantes fluorescentes ^21, ou isótopos radioactivos ^22. Inconvenientes para estes métodos podem incluir o requisito de grandes quantidades de vírus de entrada (por exemplo, elevadas multiplicidades de infecção (MOI)), a utilização de radioactividade, e / ou passos adicionais de manuseamento para a preparação do vírus de entrada (por exemplo, concentração e / ou a rotulagem de vírus) . Em particular, o uso de alta MOI torna difícil distinguir produtivo contra eventos de fixação não produtivas ^15,23. O ensaio à base de qRT-PCR descrito aqui pode detectar eventos de ligação utilizando tão pouco quanto 20 por placaunidades Ming (PFU) de vírus, que se traduz em um MOI de 0,0004 para uma placa de 48 poços. Portanto, a forte sensibilidade do ensaio supera a necessidade de alta MOI assim como quaisquer passos de rotulagem ou de vírus de concentração. Além disso, o ensaio pode ser i) adaptado para medir virião endocitose, bem como libertação de genoma do vírus no citoplasma da seguinte fusão e ii) adaptado para utilização com outros vírus através do desenvolvimento de reagentes de qRT-PCR específica para o vírus (para exemplos, ver ^24-27).

Protocol

Nota: É crítico que o protocolo descrito ser realizada utilizando rigorosa técnica de pré-PCR (ver 28 para uma excelente visão geral sobre como configurar um laboratório de pré-PCR e como conduzir experimentos usando boa técnica de pré-PCR). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1. <p class="j…

Representative Results

Para demonstrar a sensibilidade e gama dinâmica do ensaio qPCR, quantidades conhecidas de um plasmídeo que codifica o gene NP de JUNV C # 1 (intervalo 5-5 x 10 7 cópias) foram submetidos a qPCR como descrito na Seção 4 do protocolo. O ensaio é sensível e pode detectar de forma fiável tão poucos como 5 cópias do ácido nucleico alvo (Figura 2). Além disso, a gama dinâmica do ensaio é grande e, como mostrado na Figura 2, pode cobrir…

Discussion

O protocolo que descrevemos é simples e robusta desde que as seguintes considerações críticas são observadas. Em primeiro lugar, rigorosa técnica de pré-PCR deve ser empregado (ver ²⁸ para uma excelente revisão). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Em segundo lugar, para a parte de fixação de células com vírus do protocolo, o vírus, células…

Materials

DMEM	Life Technologies	11965-118
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-163	100x
HEPES Buffer Solution	Life Technologies	15630-130	100x
PBS pH 7.4	Life Technologies	10010-023	1x
Vero E6 cells	American Type Culture Collection	CRL-1586
Costar 48-well plate	Corning	3548
RNeasy mini kit	Qiagen	74106	do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer	Qiagen	79654
Taqman Universal PCR Master Mix	Life Technologies	4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl)	Life Technologies	4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)	Life Technologies	N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution	Life Technologies	N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl)	Life Technologies	N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’	Integrated DNA Technologies	250 nmol DNA oligo	standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’	Life Technologies	4304971	standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’	Life Technologies	4304971	standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’	Life Technologies	4316033	HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL)	Life Technologies	4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System	Life Technologies	4376598	or other qPCR instrument