Summary

Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши

Published: June 06, 2016
doi:

Summary

Цель этого протокола заключается в описании убыт- и амплитудно-метода функции, который применим для идентификации neogenin в качестве рецептора стадиеспецифический, что приводит к трофэктодерме и массовая дифференциация внутренней клеточной у эмбрионов предимплантационной мыши.

Abstract

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

Introduction

Преимплантационная эмбриональное развитие можно разделить на несколько различных стадий, от стадии одной клетки к морулы и бластоцисты. Многое данные свидетельствуют о том, что полярность и позиционные сигналы играют роль в раннем определении судьбы клеток в трофэктодерме (TE) и массы внутренней клетки (ИВМ). Тем не менее, характер репликами, как они преобразованных в клеточные сигналы, а также физиологические условия, в которых такие сигналы способны инициировать клеточной линии дифференцировки не известны. Эти дифференцированные клетки затем проходят специализацию, начинает приобретать характерные структуры и функции , необходимые для правильного формирования эмбриона и роста плаценты 1-3.

Предимплантационной эмбрионов особенно поддаются манипулированию путем прямой инъекции модифицированных генетических материалов, таких как миРНК или кДНК-мишени и, таким образом, могут быть использованы для изучения конкретных молекул-мишеней. Существует растущее понимание того, что генетическаяанализ эмбрионов позвоночных имеет решающее значение для углубления нашего понимания эмбрионального развития 4. Точное введение гена дикого типа или мутантной формы в эмбрион в своевременном контексте для достижения амплитудно или с потерей функции гена значительно облегчило изучение онтогенетически регулируемых генов. Убыт- и амплитудно-оф-функции с помощью микроинъекции генетических материалов в отдельных ранних эмбрионов не млекопитающих и млекопитающих сравнительно просто из – за их большого размера и большой восприимчивостью 5. Микроинъекция обычно выполняется с использованием не-вирусные векторы. Особое преимущество было принято за легкости использования невирусных векторов над вирусными векторами и трансгенов. Быстрое убыт- или система экспрессии усиления из-функции у эмбрионов мышей была разработана , что позволяет анализировать и понять функции генов в позвоночном эмбриологии 6,7.

Флуоресцентным эмбрионов значительно облегчит выбор MICRoinjected или генетически модифицированных эмбрионов и в то же время предоставляют средство для непрямого количественную оценку уровня экспрессии микроинъецировали миРНК или кДНК , основанный на интенсивности флуоресценции 8. Для выполнения этой маркировки, флуоресцентный белок, кДНК GFP или RFP, являются совместно вводят либо в виде слитых конструкций или по отдельности. Интенсивность флуоресценции GFP или RFP показывает степень экспрессии миРНК или чужеродной ДНК, чтобы гарантировать, что убыт- или получить его функции, было достигнуто.

Здесь мы приводим протокол микроманипуляций для убыт- и усиления посещающих функции методики, которая позволила нам идентифицировать neogenin как рецептор, который передает внеклеточные сигналы важные в начале дифференцировки клеток у эмбрионов предимплантационной мыши.

Protocol

Примечание: Все процедуры для животноводства и заботами были проведены в соответствии с правилами IACUC из Sahmyook университета, Сеул, Южная Корея. 1. суперовуляции, Селекция и Яйцевод Изоляция Поддерживать инбредных мышей C57BL / 6 при следующих условиях: 22 ± 3 ° C, ~ 60% влажности, 12 ч цик?…

Representative Results

Мы обнаружили , что neogenin временно экспрессируется на ранних стадиях развития эмбрионов предимплантационной мыши, появляются уже на стадии 2-клеточного и прочного до начала морулы , но становится дефицитом на поздней морулы и бластоцисты этапов (рис 2А). Кроме ?…

Discussion

В настоящем протоколе, мы демонстрируем новые способы микроинъекции генетических материалов, либо кДНК или shRNA, в эмбрионах 2-ПН мыши, чтобы исследовать роль neogenin в ранней дифференцировки клеток во время эмбриогенеза мыши. Генетическая модификация предимплантационной эмбрионов являе?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы также хотели бы отметить группу доктора Сюна в Грузии медицинских наук университета для производства и обмена конструкций для neogenin кДНК и shRNA векторов. Это исследование было поддержано грантами Программы фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A4A01012572), финансируемого Фондом Корейского научно-исследовательского и научно-исследовательского гранта от Sahmyook университета.

Materials

M16 medium, Gibco BRL (Grand Island, NY) M7292 LOT# 11A832
Goat serum,  Dako (Glostrup, Denmark) X0907
PMSG Folligon, Intervet, Holland G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Mineral olie Sigma Aldrich CG5-1VL LOT# SLBC6783V
human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin  (Intervet, Holland) (invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Reverse Transcriptase lifetechnologies 18080-044
PCR pre mixture  (Bioneer, Daejon, S. Korea) GenDEPOT , A0224-050
Agarose (molecular grade) BioRad 161-3101
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Affymetrix USA 19943
polyclonal rabbit anti-neogenin antibody Santa Cruz Biotechnology, US SC-15337
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-11094
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-21428
Alexa Fluor® 555 Phalloidin Molecular Probes (Invitrogen, USA) A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen, USA D1306
Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin R&D systems 3720-RG
all plasmid constructs  Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). the present studies were kindly provided by 
Neon®  Transfection System lifetech MPK10096
Stereo Microscrope Nikon SMZ1000
Micromainpulation system with Nikon Nikon Narishige ONM-1
MicroInjector Nikon Narishige GASTIGHT #1750
Holder Nikon Narishige Narishige IM 16
Microfoge Nikon Narishige Narishige MF-900
grinder Narishige EG400
Puller Sutter Instrumnet company P-97
CO2 incubator Thermo Scientific Forma EW-39320-16
Veriti® 384-Well Thermal Cycler  lifetechnologies 4388444

References

  1. Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
  2. Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
  3. Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
  4. Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
  5. Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
  6. Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
  7. Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
  8. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
  9. Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
  10. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  11. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).

Play Video

Cite This Article
Lee, J. H., Cho, Y. I., Choi, S. S., Kim, H., Min, C. K., Lee, S. J. Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (112), e53696, doi:10.3791/53696 (2016).

View Video