इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक नुकसान का वर्णन है और लाभ के समारोह तरीका है कि neogenin एक मंच-विशिष्ट रिसेप्टर ट्रोफेक्टोडर्म और preimplantation माउस भ्रूण में आंतरिक कोशिका द्रव्यमान भेदभाव की ओर जाता है कि के रूप में पहचान करने के लिए लागू होता है के लिए है।
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Preimplantation भ्रूण विकास morula और ब्लास्टोसिस्ट करने के लिए एक सेल मंच से कई अलग चरणों में विभाजित किया जा सकता है। ज्यादातर प्रमाण बताते हैं polarity और स्थितीय संकेतों ट्रोफेक्टोडर्म (ते) और आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) में जल्दी सेल भाग्य निर्धारण में एक भूमिका निभाते हैं। हालांकि, संकेत, कैसे वे सेलुलर संकेतों में transduced रहे हैं की प्रकृति, और शारीरिक संदर्भों में इस तरह के संकेत सेल वंश भेदभाव की शुरुआत नहीं जाना जाता है में सक्षम हैं। ये विभेदित कोशिकाओं तो विशेषज्ञता से गुजरना, विशेषता संरचनाओं और भ्रूण उचित गठन और नाल 1-3 के विकास के लिए आवश्यक कार्यों पर लेने के लिए शुरुआत।
पूर्व आरोपण भ्रूण विशेष रूप से siRNA या लक्ष्य सीडीएनए तरह संशोधित आनुवंशिक सामग्री के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी होते हैं और इस प्रकार विशिष्ट लक्ष्य अणुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वहाँ एक से बढ़ समझ है कि आनुवंशिक हैकशेरुकी भ्रूण के विश्लेषण भ्रूण विकास 4 के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। एक समय पर संदर्भ में एक भ्रूण में एक जंगली प्रकार के जीन या एक उत्परिवर्ती फार्म का सटीक परिचय पूरा करने के लिए gain- या हानि के समारोह के जीन की बहुत developmentally विनियमित जीन के अध्ययन में मदद की है। नुकसान और लाभ के समारोह व्यक्तिगत जल्दी गैर स्तनधारी और स्तनधारी भ्रूण में आनुवंशिक सामग्री के microinjection के माध्यम से अपने बड़े आकार और महान ग्रहणशीलता 5 की वजह से अपेक्षाकृत सरल है। Microinjection आम तौर पर गैर-वायरल वैक्टर का उपयोग किया जाता है। विशेष लाभ वायरल वैक्टर और ट्रांसजीन से अधिक गैर-वायरल वैक्टर का उपयोग में आसानी के लिए लिया गया है। एक तेजी से नुकसान या माउस भ्रूण में लाभ के समारोह अभिव्यक्ति प्रणाली विकसित किया गया है कि हमें काटना और कशेरुकी भ्रूण 6.7 में जीन कार्यों को समझने के लिए अनुमति देता है।
भ्रूण के फ्लोरोसेंट लेबलिंग बहुत माइकर के चयन की सुविधा होगीoinjected या आनुवंशिक रूप से चालाकी से भ्रूण और एक ही समय में एक साधन के परोक्ष रूप से फ्लोरोसेंट तीव्रता 8 पर आधारित microinjected siRNA या सीडीएनए की अभिव्यक्ति के स्तर यों की अनुदान। इस लेबलिंग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन सीडीएनए, GFP या आरएफपी को पूरा करने के लिए, सह इंजेक्शन या तो संलयन निर्माणों या अलग रूप में कर रहे हैं। GFP या आरएफपी के प्रतिदीप्ति तीव्रता siRNA या विदेशी डीएनए की अभिव्यक्ति की हद तक है कि नुकसान या लाभ सुनिश्चित करने के समारोह पूरा किया गया है पता चलता है।
यहाँ, हम नुकसान और लाभ के- समारोह तकनीक है कि हमें एक रिसेप्टर कि preimplantation माउस भ्रूण में जल्दी सेल भेदभाव में महत्वपूर्ण कोशिकी संकेतों रिले के रूप में neogenin की पहचान करने की अनुमति के लिए एक micromanipulation प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम माउस embryogenesis दौरान जल्दी सेल भेदभाव में neogenin की भूमिका का पता लगाने के लिए 2-पी.एन. माउस भ्रूण में आनुवंशिक सामग्री के microinjection के उपन्यास तरीकों, या तो सीडीएनए या shRNA, प्रदर्शित करता है।…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को भी विनिर्माण और सीडीएनए और shRNA वैक्टर neogenin के लिए निर्माणों को बांटने के लिए जॉर्जिया स्वास्थ्य विज्ञान विश्वविद्यालय में डॉ Xiong के समूह को स्वीकार करना होगा। इस अध्ययन में बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम (2013R1A1A4A01012572) कोरियाई रिसर्च फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित से अनुदान द्वारा और Sahmyook विश्वविद्यालय से शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
grinder | Narishige | EG400 | |
Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |