Summary
このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。
Introduction
着床前胚発生は、1細胞期から桑実胚および胚盤胞に、いくつかの別個の段階に分けることができます。多くの証拠は、極性および位置合図は栄養外胚葉（TE）および内部細胞塊（ICM）に初期の細胞運命の決意に役割を果たすことを示唆しています。しかしながら、それらはセルラ信号に導入されているかの手がかりの性質、および生理学的コンテキストとは、そのような信号は、知られていない細胞系譜の分化を開始することが可能です。これらの分化した細胞は、その後胎盤1-3の胚適切な形成と成長のために必要な特徴的な構造と機能を取るために始めて、専門を受けます。
着床前胚は、siRNAまたは標的cDNAのような修飾された遺伝物質の直接注射による操作に特に適しているので、特定の標的分子を研究するために利用することができます。その遺伝的成長の理解があります脊椎動物の胚の分析は、胚発生4の我々の理解を進めるために重要です。 gain-または機能喪失型遺伝子のを達成するためのタイムリーな文脈での胚への野生型遺伝子または変異形の正確な導入が大幅に発達調節される遺伝子の研究を容易にしました。 loss-がと機能獲得型遺伝物質の微量注入を介して、個々の早期非哺乳動物および哺乳動物の胚には、その大きなサイズと大きな受容5の比較的単純です。マイクロインジェクションは、典型的には、非ウイルスベクターを使用して実行されます。特定の利点は、ウイルスベクターおよびトランスジーン上に非ウイルスベクターを使用することの容易さからとられています。マウス胚の急速なloss-がまたは機能獲得型の発現系は、私たちは解剖し、脊椎動物の発生学6,7における遺伝子機能を理解することを可能にするように開発されました。
胚の蛍光標識が大きくMICRの選択を容易にしますoinjectedまたは遺伝的に胚を操作し、同時に、間接的に蛍光強度8に基づいて、マイクロインジェクションsiRNAまたはcDNAの発現レベルを定量化する手段を付与します。この標識、蛍光タンパク質のcDNAを達成するために、GFPまたはRFPは、別々に融合構築物またはいずれかと同時注入されます。 GFPまたはRFPの蛍光強度は、loss-がを保証または機能獲得なされたものに対するsiRNAまたは外来DNAの発現の程度を明らかにする。
ここで、我々は、私たちは、着床前のマウス胚における初期の細胞分化に重要な細胞外の手がかりを中継受容体としてネオゲニン同定することを可能にしたloss-が、ゲインオブファンクション技術のためのマイクロマニピュレーションプロトコルを提示します。
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Protocol
注：動物の飼育や心配事のためのすべての手順はSahmyook大学、ソウル、韓国のIACUCの規則に従って行いました。
1.過排卵、繁殖や卵管の単離
- 22±3℃、〜60％の湿度、12時間の明/暗サイクル、水と食料を自由摂取：以下の条件の下で、近交系C57BL / 6マウスを維持します。
- 誘導0.1ミリリットル/ヘッドで5 IU妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）の腹腔内注射によって3-5週齢の雌マウスの排卵は0.1ミリリットルで5 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の腹腔内注射によって後48時間続きます/頭。
- 直後のhCG注射後、同じケージに一晩でそれらを保つことによって、同じ株の性的に成熟した雄と過剰排卵誘発性の雌を交尾。
- 次の朝、女性の生殖管に嵌合プラグまたは膣栓の存在によって成功した交尾を確認。
- 妊娠中の雌マウスを生け贄に捧げますhCG注射後に頸椎脱臼18-20時間、続いてCO 2中毒によります。
- 皮膚、その後細かいハサミで腹膜層を切断することにより腹腔を開きます。
- 細かい鉗子で子宮角をピックアップし、優しく体腔から子宮、卵管、卵巣、および脂肪パッドを引き離します。
- 卵管と細かいハサミで卵巣の間の領域をカットします。添付子宮の上部の1cm以上を残して、鉗子を再配置し、卵管の近くに子宮を切りました。
- 室温でM16培地を含む35ミリメートルペトリ皿に卵管膨大部を転送します。同じ皿にいくつかのマウスから卵管をプール。
- 胚の検索用実体顕微鏡下皿を置きます。
2. 2-前核の検索と文化（2-PN）胚
- 、30または32 G皮下注射針の端をカット鈍い先端にそれを挽くし、フラッシング針として使用することができます。
- つかいますフラッシング針の上に卵管の端をスライドさせる細かい鉗子。静かな場所でそれを保持するために皿の底に対してフラッシング針の先端を押してください。ペトリ皿に2-PN胚を解放するためにM16培地〜0.1ミリリットルで卵管をフラッシュします。
- 滅菌ガラスピペットを用いて、実体顕微鏡下でフラッシュM16媒体から積雲塊を囲むとともに、2-PN胚を回復し、新しいペトリ皿に移します。
- 5〜10分間、37℃でダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で0.1から0.5パーセントのヒアルロニダーゼの1.0ミリリットルで酵素消化により2-PN胚からの卵丘細胞を解離します。
- 静かにガラスピペットおよび卵丘細胞を物理的に除去してピペッティングすることにより胚をはぎ取ります。
- 胚あたりの新鮮なリン酸緩衝生理食塩水（PBS）30〜50ミリリットルで裸に胚を3回洗浄します。
- 10 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA、FRACTを補充M16培地中で35mmのプラスチック製ペトリ皿中で胚をインキュベート以下4時間後に通常はマイクロインジェクションが行われるまで加湿インキュベーターで5％CO 2中37℃でイオンV）。
3.胚逆転写（RT）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
- 逆転写酵素、RNaseインヒビター、オリゴdTプライマー、ランダム6mers、のdNTP混合物、および反応バッファーを含む転写酵素プレ混合溶液を逆胚盤胞期までの各段階からの少なくとも10の胚を回収し、5倍の4.0μlのそれらをプールPCRチューブ。
- 20μlの総体積にRNaseフリーの蒸留H 2 Oを加え、200 W.で30秒間プール胚を超音波処理を95℃で5分間インキュベートし、続いて1時間42℃で直ちにRT反応を開始します。
- 生成されたcDNA溶液のそれぞれ5.0μlのために、ネオゲニンのためのプライマーを用いて通常のPCR増幅を行い、Cdx2の、Sox2の、Tead4、Nanogの、のOct3 / 4、またはβアクチンの表に示す（プライマー配列1。 PCRは、95℃で15秒のインキュベーションを40サイクル、（ 表1に示されている）アニーリング温度で30秒間、および72℃で30秒から成ります。
- 別個のPCR産物の電気泳動による2％アガロースゲル上でエチジウムブロマイドで染色した後、UV光下でゲルを視覚化します。
- βアクチンレベルに対する標的遺伝子の発現を正規化します。
胚の4免疫細胞化学
- 簡単な洗浄により、0.01％BSAを含むPBSで3回続いて室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドを用いて、各段階から胚を修正しました。
- 室温で10分間、0.1％のTween 20および0.1％トリトンX-100を含むPBS 1.0 ml中に10の胚をインキュベートすることによって透過処理細胞膜。
- PBSの1.0ミリリットルで透過化胚を培養する非特異的結合ブロックするには、室温で30分間、10％正常ヤギ血清を補充しました。
- ブロックされた胚のウィットをインキュベート時間ウサギ抗ネオゲニン抗体を1：4℃で一晩、0.1％BSAを含むPBS中で100倍希釈。
- PBSの滴で30秒間それぞれについて3回洗浄した後、1でアレクサ488結合ヤギ抗ウサギIgGまたはアレクサ568結合ヤギ抗ウサギIgGのいずれかで胚をインキュベートする：PBS / BSA溶液中で500希釈を4℃で一晩。
- アクチンフィラメントを可視化するために、室温で1時間、PBS中1μg/ mlのファロイジンで胚をインキュベートします。
- 室温で5分間に1μg/ mlのDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）を含む5 mlのPBSを添加することにより核を染色します。
- 洗浄は、PBSで3回簡単に胚。
- ガラススライドに胚を移し、鉱物油の滴でそれらをカバーしています。
- 適切な波長の励起との共焦点顕微鏡で1,000倍の倍率で画像を撮影します。
ネオゲニン-RFPおよびネオゲニン-siRNAのGFPプラスミドの5準備
- サブネオゲニンフラグ-RFPで得られたベクターを含有する赤色蛍光タンパク質（RFP）へのクローンをコードするcDNAマウスネオゲニン、。
- （ 図1参照）のpcDNA-EmGFP-MIR-ネオゲニン、その結果、ベクターを含有エメラルドグリーン蛍光タンパク質（EmGFP）にネオゲニン標的小ヘアピンRNAのサブクローニング。
- ネオゲニンフラグ-RFPとのpcDNA-EmGFP-のmiR-ネオゲニンプラスミドの両方を増幅し、従来の方法でそれらを浄化します。
- 無菌のTris-EDTA（TE）緩衝液中のプラスミドに〜1.0μgの/ mlの最終濃度を調整します。
2-PN胚へのプラスミドの6マイクロインジェクション
- 新鮮なM16培地で、簡単に、一度裸に2-PN胚を洗ってください。
- 前核の観察を可能にするためにテーブルトップ遠心機1,000×gで10分間、2-PN胚を遠心。
- additi、5％CO 2中37℃で鉱物油の下胚あたりのM16培地の20〜30μlに微小液滴で胚をインキュベートonal 1〜2時間。
- メカニカルプラーと、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（IDは= 0.94ミリメートルOD = 1.2ミリメートル）を引いて、注入ピペットと保持ピペットを製造しています。
- 鈍ヒントとmicrogrinderとmicroforgerを使用して、<500μmの先端の長さと1〜2μmの先端内径の研磨開口部を持つように注入ピペットを製作。
- 彼らが20μmと100μmの外径の内径と鈍ヒントや研磨の開口部を有するようにピペットを保持して製作してください。
- 1.0μgの/μlのでプラスミド溶液の十分な量の負荷注入ピペット（> 200 NL）。
- 顕微注入する〜電動式マイクロマニピュレータに取り付けられたマイクロインジェクターを用いて、前核の1つにそれぞれ2-PN胚のためのプラスミド溶液の10 PL;このプロセスの間に、保持ピペットで負圧を適用することによって所定の位置に胚を保ちます。
- マイクロインジェクション後、リットル用の新鮮なM16培地で2-PN胚を3回洗浄1分毎の時間よりESS。
- 培養培地の蒸発を防ぐためにミネラルオイル滴で覆われたプラスチック培養皿に新鮮なM16培地の滴中で2-PN胚。
- 200Xの倍率で微分干渉コントラスト（DIC）倒立顕微鏡下で24時間の間隔で胚を観察します。
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Representative Results
我々は、早ければ2細胞期でとして登場すると永続的な初期の桑実胚までは、後期桑実胚と胚盤胞段階（ 図2A）で欠損となって、ネオゲニンが一過着床前マウス胚の初期発生段階で発現していることを発見しました。また、ネオゲニンの空間分布は、主に細胞外に制限しました。 RT-PCR分析の結果は、4細胞期でピークに達するが、完全に16細胞期に欠く以降（ 図2B）、ネオゲニン発現の早期および一過性の性質と一致しました。対照的に、F-アクチンは、一過性と偏発現パターンを明らかにしませんでした。
私たちは、次のロスネオゲニン（ネオゲニンを標的とするshRNAを保有するネオゲニンレベルがネオゲニンのcDNAベクター（ネオゲニンゲイン）またはベクターのいずれかのマイクロインジェクションによって操作することができるかどうかを調べ2-PNの接合体への）。視覚的にネオゲニン損失、RFPおよびGFPからネオゲニン利得はインジケータ（ 図3）のように同時発現させた差別化、および発現レベルネオゲニンその結果に免疫蛍光法によっておよびイムノ（ 図4）の両方によって確認されました。
図5は、2-PN段階でネオゲニンのshRNAまたはネオゲニンcDNAのいずれかを受信した後、各段階の胚の代表的な画像を示しています。ネオゲニン損失とネオゲニンゲイン胚、および少なくとも胚盤胞段階までは発達電位差（ 表2）の間に明らかな肉眼形態学的な差は認められませんでした。実際には、各段階での胚の生存数と逮捕胚の数の両方は、有意差はなかったです。
しかし、ICMの開発はとしてゲイン胚をネオゲニンよりネオゲニン損失がそれほど顕著でしたネオゲニンゲイン胚（ 図6A）内のOct3 / 4 ICM固有のより高い発現によって、およびネオゲニン損失の胚（ 図6B）よりネオゲニンゲインの胚盤胞あたりのOct3 / 4陽性ICM細胞の高い数字で証明。また、RT-PCR分析は、三転写因子およびネオゲニンの発現レベルとの間の強い相関関係を明らかにしました。ネオゲニン損失胚盤胞、少しのOct3 / 4、Sox2及びNanogのではコントロール胚（ 図6C）を超えるネオゲニンゲインのすべての3つの転写因子の発現の有意な増加と対 照的である、検出されました。意外にも、Cdx2のとTead4の発現レベルは、TE分化/メンテナンス6,7に関与する転写因子は、以下ネオゲニンの発現レベルによって影響を受けた、アップレギュレーションネオゲニンのは、ICMのための特定の転写調節因子の活性化につながることを検証するが、ないTEを確立するため。示されているすべてのデータは、mは参照9からodified。
図1：の構造をpcDNA-EmGFP-のmiR-ネオゲニン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：マウス胚発生の間ネオゲニンの式 （A）異なる発生段階での着床前胚におけるネオゲニン式の共焦点顕微鏡画像。 （B）異なる発達段階での着床前胚におけるネオゲニンmRNAの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。 βアクチンを内部対照として使用しました。96fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： 緑色蛍光タンパク質（GFP）および赤色蛍光タンパク質（RFP）をそれぞれネオゲニン損失およびネオゲニンゲイン、のための指標としての表現にRFPを保有ネオゲニンcDNAベクターの共役GFPまたはマイクロインジェクションを保有ネオゲニンターゲティングshRNAベクターのマイクロインジェクション後2-PN接合体、GFP及びRFPの発現は、2細胞、4細胞期で、蛍光顕微鏡下で可視化しました。左側のパネル、位相コントラスト像。真ん中と右のパネル、蛍光画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：2-PN接合体へのネオゲニンターゲティングshRNAベクターのマイクロインジェクション後、個々の胚盤胞細胞におけるネオゲニンの発現レベルはによってネオゲニンまたはネオゲニンのcDNAを標的とするshRNAのいずれか （A） のマイクロインジェクション後胚盤胞におけるネオゲニンの発現を評価しました。抗FLAG抗体による免疫染色。左側のパネルで、shRNAのベクトルは（コントロール）をマイクロインジェクションしたネオゲニンスクランブル。右側のパネルで、ネオゲニンを標的とするshRNAベクターをマイクロインジェクションしました。 DAPIは、DAPI（青色）は核を染色するために使用されました。アンチフラグ、ネオゲニン上のフラグタグの可視化（赤）; GFP、緑色蛍光タンパク質（緑）合併し、DAPI、抗フラグ、およびGFPの重畳。 （B）胚盤胞の全細胞溶解物を抗FLAG抗体で免疫ブロットしました。 GFPは、ローディングコントロールとして使用しました。 shRNAのスクランブル、shRNAを注入ネオゲニンスクランブル。呉のshRNA、ネオゲニンを標的とするshRNA injecる。 （C）ネオゲニンのcDNAベクターまたはネオゲニンターゲティングするshRNAベクターは、2-PN接合体にマイクロインジェクションし、得られた胚盤胞は、ネオゲニン発現レベルを測定するために、抗ネオゲニン抗体で免疫染色を行いました。上のパネルでは、ネオゲニンを標的とするshRNAを注入しました。胚盤胞は、抗ネオゲニン抗体（赤）で免疫染色しました。 GFP、緑色蛍光タンパク質（緑） DAPI、抗ネオゲニン、およびGFPのマージされ、重畳。下のパネルでは、ネオゲニンのcDNAベクターは、マイクロインジェクションされました。胚盤胞は、抗ネオゲニン抗体（緑）で免疫染色しました。 DAPI、DAPI核染色（青）。 RFP、赤色蛍光タンパク質（赤色）合併し、DAPI、RFP、および抗ネオゲニンの重畳。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5：胚発生にネオゲニン損失または利得の影響 。 2-PNマウス胚は、小ヘアピンRNA（shRNAを）を標的ネオゲニン（ネオゲニン損失）でまたはcDNA（ネオゲニンゲイン）ネオゲニン有するベクターのいずれかでマイクロインジェクションし、胚盤胞期に達するまで培養しました。ネオゲニンゲイン胚からのネオゲニン損失を区別するために、GFPおよびRFPはそれぞれ、共発現しました。異なる発生段階の胚の位相コントラスト像が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：ネオゲニン過剰発現は、ICM分化胚盤胞における（A）ICM細胞はのOct3 / 4の免疫染色により観察した好意 。 DAPIは、STAに使用されました核インチ平均値は、各実験で使用される少なくとも10の胚を有する3つの独立した実験からのSEMを±として（B）のOct3 /コントロールの胚盤胞4陽性ICM細胞、ネオゲニン損失、及びネオゲニンゲイン胚の数が示されています。 * スチューデントのt検定によりp <0.05で対照からの有意差。 （C）ネオゲニン損失、ネオゲニン利得、及び制御の胚の胚盤胞からのOct3 / 4、Sox2の、Nanogの、Cdx2の、及びTead4 mRNAのRT-PCR分析。 βアクチンを内部対照として使用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：RT-PCRに用いたプライマーおよびPCR条件の配列。
表2：2-PNステージでネオゲニンのshRNAまたはネオゲニンのcDNAを受けた後、各発達段階でのマウス胚の生存数。
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Discussion
現在のプロトコルでは、我々は、マウスの胚発生の初期に細胞分化におけるネオゲニンの役割を探求する2-PNのマウス胚に、cDNAまたはshRNAのいずれかで、遺伝物質のマイクロインジェクションの新規な方法を示しています。着床前胚の遺伝子改変は、例えばのための基礎となる分子メカニズムに関する重要な情報を暴くための強力な技術は、最初の細胞系譜の決意です。遺伝子改変は、遺伝子機能を確認するための最も一般的に使用される方法の一つです。外来遺伝物質のための2-PNの胚および2-PN胚へのcDNAおよびshRNAのマイクロインジェクションの可能性の比較的大きなreceptibilityでは、この胚操作技術は、真性はもちろんのこと、胚に最小限の物理的破壊で実現することができますこの遺伝子操作に関連した相補性。
細胞質の注入が容易になり、あまり有害であることを考慮すると、核注入よりも生存するが、それにもかかわらず、核注入に関連した外来DNAのより高い発現に、強調されるべきである1改善が核内にマイクロインジェクション前に前核を配置するために遠心分離を使用することです。最も技術的に洗練された要求の厳しいステップは、受精卵の前核への外来DNAのマイクロインジェクションです。このステップは重要であり、かなりの技術的技能およびマイクロインジェクションの手順を習得する広範囲の訓練を必要とします。このスキルは、しかし、取得されると、技術的なばらつきや誤差が最小限になります。マイクロインジェクション胚のルーチン生存は、私たちの施設内の百分の80から90の間です。
本研究とは異なり、他の研究者は、原形質膜近く前核は、マイクロニードルに近かったように、ピペットを保持することによって胚を位置付け。マイクロニードルは、その後、前核10,11に挿入されています。私たちはプロを可視化するいくつかの困難を経験しました遠心分離せずに顕微鏡下で核正しく。明らかに、遠心分離を識別しやすくするために、原形質膜に近い核をもたらします。同時に、前核のより良い視覚化より良好な位置決めのための改善の余地があるはずです。
トランスジェニックマウスの生産に反して、胚へのプラスミドのマイクロインジェクションのための我々のプロトコルは、本質的に一過性トランスフェクションされ、着床前胚発生の間の遺伝子の機能を解剖するのに適し。したがって、私たちのloss-がためのプロトコルおよび機能獲得型技術は、さらに初期胚発生に関与するシグナル伝達分子を同定するために一般化することができました。
ネオゲニン及びそのリガンドは、のOct3 / 4、Sox2及びNanogのような幹細胞特異的転写因子を増強する可能性が高いことに加えて、ネオゲニンシグナリングは、所与の胚性幹細胞株の開発に非常に有益であり得ます。
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Disclosures
著者らは、開示することは一切競合する金融利害関係を持っていません。
Acknowledgments
著者らはまた、製造およびcDNAとのshRNAベクターをネオゲニンための構造を共有するためのジョージア健康科学大学の博士熊のグループを承認したいと思います。この研究は、韓国研究財団によっておよびSahmyook大学からの研究助成金によって賄わ基礎科学研究開発プログラム（2013R1A1A4A01012572）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
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