Summary
El objetivo de este protocolo es para describir un deficitaria y ganancia de función que el método es aplicable para identificar neogenin como un receptor de la etapa específica que lleva a trophectoderm y diferenciación masa celular interna de embriones de preimplantación ratón.
Introduction
Preimplantación desarrollo embrionario se puede dividir en varias etapas distintas, desde el estadio de una célula a la mórula y blastocisto. Hay mucha evidencia que sugiere que la polaridad y señales posicionales juegan un papel en la determinación precoz del destino celular en el trophectoderm (TE) y la masa celular interna (ICM). Sin embargo, la naturaleza de las señales, la forma en que se transducen en señales celulares, y los contextos fisiológicos en el que dichas señales son capaces de iniciar la diferenciación de linaje de células no son conocidos. Estas células diferenciadas a continuación, se someten a la especialización, comenzando a asumir estructuras características y funciones necesarias para la formación del embrión propiamente dicho y el crecimiento de la placenta 1-3.
embriones de preimplantación son particularmente susceptibles a la manipulación por inyección directa de materiales genéticos modificados como siRNA o ADNc diana y por lo tanto pueden ser utilizados para estudiar moléculas diana específicas. Hay una creciente comprensión de que genéticaanálisis de los embriones de vertebrados es fundamental para avanzar en nuestra comprensión del desarrollo embrionario 4. introducción precisa de un gen de tipo salvaje o una forma mutante en un embrión en un contexto oportuna para llevar a cabo GAIN- o pérdida de la función del gen ha facilitado enormemente el estudio de los genes regulados por el desarrollo. Deficitaria y ganancia de función a través de la microinyección de materiales genéticos en embriones de mamíferos y no mamíferos primeros individuales es relativamente simple debido a su gran tamaño y gran receptividad 5. La microinyección se realiza típicamente usando vectores no virales. Particular se ha hecho uso de la facilidad de uso de vectores no virales sobre vectores virales y transgenes. Una deficitaria rápida o sistema de expresión de ganancia de función en embriones de ratón se ha desarrollado que nos permite diseccionar y entender las funciones de genes en la embriología de los vertebrados 6,7.
el marcaje fluorescente de embriones facilitaría en gran medida la selección de los microinjected o genéticamente embriones manipulados y al mismo tiempo conceder un medio para cuantificar indirectamente el nivel de expresión de siRNA o ADNc microinyección basada en la intensidad fluorescente 8. Para lograr esto etiquetado, ADNc de la proteína fluorescente, GFP o RFP, son co-inyectados ya sea como construcciones de fusión o por separado. La intensidad de fluorescencia de GFP o RFP revela el grado de expresión de siRNA o ADN extraño para asegurar que deficitarias o que se ha logrado ganancia de función.
A continuación, se presenta un protocolo para la micromanipulación técnica función deficitaria y la ganancia-de- que nos permitió identificar neogenin como un receptor que transmite señales extracelulares importantes en la diferenciación celular a principios de preimplantación de embriones de ratón.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos para la cría de animales y de los cuidados se llevaron a cabo de acuerdo con los reglamentos de la Universidad de Sahmyook IACUC, Seúl, Corea del Sur.
1. La superovulación, Cría y aislamiento Oviducto
- Mantener ratones C57BL / 6 endogámicos bajo las siguientes condiciones: 22 ± 3 ° C, ~ 60% de humedad, 12 horas de luz / oscuridad ciclo, y agua y alimento ad libitum.
- Inducir la superovulación de ratones hembra de 3-5 semanas de edad, mediante una inyección intraperitoneal de 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) a 0.1 ml / cabeza seguido 48 horas más tarde por una inyección intraperitoneal de 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) en 0,1 ml /cabeza.
- Inmediatamente después de la inyección de hCG, aparearse las hembras de superovulación inducida con machos sexualmente maduros de la misma cepa, manteniéndolos en la misma jaula durante la noche.
- A la mañana siguiente, confirman el éxito de apareamiento por la presencia de un conector macho de inserción o tapón vaginal en el tracto genital femenino.
- Sacrificar los ratones hembra embarazadapor CO 2 intoxicación seguido por dislocación cervical 18 a 20 horas después de la inyección de hCG.
- Abra la cavidad abdominal por el corte de la piel y luego la capa peritoneal con tijeras finas.
- Recoge los cuernos uterinos con unas pinzas finas y alejarse del útero, oviducto, ovario, y la almohadilla de grasa suavemente de la cavidad del cuerpo.
- Cortar el área entre el oviducto y el ovario con tijeras finas. Volver a colocar las pinzas y cortar el útero cerca del oviducto, dejando al menos 1 cm de la parte superior del útero adjunto.
- La transferencia de la ampolla del oviducto a una placa de Petri de 35 mm que contiene medio M16 a temperatura ambiente. Agrupar los oviductos de varios ratones en el mismo plato.
- Colocar las cápsulas en un estereomicroscopio para la recuperación de embriones.
2. Recuperación y Cultura de 2-pronuclear (2-PN) Los embriones
- Cortar el extremo de una aguja hipodérmica G 30 o 32, se muele en una punta roma, y utilizarlo como una aguja de lavado.
- Utilizarunas pinzas finas para deslizar el extremo del oviducto en la aguja de descarga. Presione suavemente la punta de la aguja de lavado contra el fondo del plato para mantenerlo en su lugar. Enjuague el oviducto con ~ 0,1 ml de medio M16 para liberar los embriones 2-PN en una placa de Petri.
- Recuperar los embriones 2-PN a lo largo de la zona de cúmulo masas del medio M16 enrojecida bajo el microscopio estereoscópico usando una pipeta de vidrio estéril y transferirlos a una nueva placa de Petri.
- Disociar las células del cumulus de los embriones de 2 PN por digestión enzimática con 1,0 ml de 0,1 hasta 0,5% de hialuronidasa en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a 37 ° C durante 5 a 10 min.
- Despojar a los embriones con la pipeta suavemente con una pipeta de vidrio y la eliminación física de las células del cúmulo.
- Lavar embriones denudadas tres veces con 30-50 ml de solución salina fresca tamponada con fosfato (PBS) por embrión.
- Incubar los embriones en una placa de Petri de plástico de 35 mm en los medios de comunicación M16 suplementado con 10 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA, Fraction V) a 37 ° C en 5% de CO 2 en una incubadora humidificada hasta que se realiza la microinyección, que es por lo general menos de 4 horas más tarde.
3. Embriones de transcripción reversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- Recoge al menos 10 embriones de cada etapa hasta la etapa de blastocisto y agruparlas en 4,0 l de 5x revertir disolución de la premezcla de la transcriptasa que contiene la transcriptasa inversa, inhibidor de RNasa, cebador oligo dT, 6mers azar, mezcla de dNTP, y el tampón de reacción en una tubo de PCR.
- Añadir agua destilada libre de RNasa 2 O hasta un volumen total de 20 l y sonicar los embriones agrupados durante 30 segundos a 200 W. iniciar la reacción de RT inmediatamente a 42 ° C durante 1 hora, seguido de 5 min de incubación a 95 ° C.
- Por cada 5,0 l de solución de ADNc generada, llevar a cabo la amplificación normal de PCR con cebadores para neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, secuencias de cebadores Oct3 / 4, o β-actina (dado en la tabla 1. PCR se compone de 40 ciclos de incubación de 15 segundos a 95 ° C, 30 segundos a temperatura de hibridación (se muestra en la Tabla 1), y 30 segundos a 72 ° C.
- Separar los productos de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 2% y visualizar el gel bajo luz UV después de la tinción con bromuro de etidio.
- Normalizar la expresión del gen diana contra los niveles de beta-actina.
4. La inmunocitoquímica de embriones
- Fijar embriones de cada etapa con 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a temperatura ambiente seguido de un breve lavado 3 veces con PBS que contenía 0,01% de BSA.
- membranas permeabilizar celular por incubación de 10 embriones en 1,0 ml de PBS que contenía 0,1% de Tween 20 y 0,1% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 10 min.
- Para bloquear la unión no específica incubar los embriones permeabilizadas en 1.0 ml de PBS suplementado con suero de cabra normal al 10% durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar el ingenio embriones bloqueadoh anticuerpos de conejo anti-neogenin en 1: 100 dilución en PBS que contenía 0,1% de BSA durante una noche a 4 ° C.
- Después de tres lavados de 30 segundos cada uno en gotas de PBS, se incuban los embriones ya sea con Alexa IgG de cabra anti-conejo 488-conjugado o Alexa 568 conjugada con IgG de cabra anti-conejo en una dilución 1: 500 en solución de PBS / BSA durante la noche a 4 ° C .
- Para visualizar los filamentos de actina, se incuban los embriones en 1 mg / ml faloidina en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Tinción de los núcleos mediante la adición de 5 ml de PBS que contenían 1 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro) por 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar los embriones tres veces brevemente con PBS.
- Transferir los embriones a un portaobjetos de vidrio y cubrirlas con una gota de aceite mineral.
- Tomar imágenes con un aumento de 1.000X con un microscopio confocal con una excitación de la longitud de onda apropiada.
5. Preparación de Neogenin-RFP y Neogenin-siRNA GFP plásmidos
- Subclon de ADNc que codifica neogenin ratón en una proteína roja fluorescente (RFP) que contienen vectores, lo que resulta en neogenin-bandera-RFP.
- Subclón pequeña horquilla de ARN de orientación neogenin en una proteína fluorescente verde esmeralda (EmGFP) que contienen vectores, lo que resulta en pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (que se muestra en la Figura 1).
- Amplificar tanto neogenin-bandera-RFP y plásmidos pcDNA-EmGFP-miR-neogenin y purificar por métodos convencionales.
- Ajustar las concentraciones finales de plásmidos a ~ 1,0 g / ml en tampón estéril Tris-EDTA (TE).
6. La microinyección de plásmidos en 2-PN embriones
- Se lavan las 2-PN embriones desnudos una vez, brevemente, con los medios de comunicación M16 frescas.
- Centrifugar los embriones 2-PN para 10 min a 1.000 xg en una centrífuga de mesa para permitir la observación de los pronúcleos.
- Incubar los embriones en una gota micro de 20 a 30 l de medio M16 por embrión bajo aceite mineral a 37 ° C en 5% de CO2 durante un additional 1-2 horas.
- Fabricación pipetas de inyección y pipetas que llevan a cabo tirando tubos capilares de borosilicato de vidrio (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) con un extractor mecánico.
- Fabricar pipetas de inyección de tener puntas romas y aberturas pulidas de <500 micras de longitud y el diámetro interior de punta punta micras 1-2 utilizando un microgrinder y un microforger.
- Fabrique la celebración de pipetas tal que tienen puntas romas y aberturas pulido con un diámetro interno de 20 micras y un diámetro exterior de 100 micras.
- pipetas de inyección de carga con una cantidad suficiente (> 200 nl) de solución de plásmido a 1,0 mg / l.
- Microinyectar ~ 10 pl de solución de plásmido para cada embrión 2-PN en uno de los pronúcleos utilizando un microinyector unido a un micromanipulador motorizado; durante este proceso, mantener los embriones en posición mediante la aplicación de presión negativa con una pipeta de sujeción.
- Después de la microinyección, lavar los embriones de 2 PN 3 veces con medio fresco para l M16ess de 1 minuto cada vez.
- La cultura de los embriones de 2 PN en una gota de medio M16 frescas en una placa de cultivo de plástico recubierto de una gota de aceite mineral para evitar la evaporación de los medios de comunicación.
- Observar los embriones a las 24 h en intervalos de un contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopio invertido con un aumento de 200X.
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Representative Results
Descubrimos que neogenin se expresa transitoriamente durante las etapas tempranas del desarrollo de embriones de preimplantación de ratón, que aparece tan pronto como en la etapa de 2 células y duradera hasta la mórula temprano, pero convertirse en deficiente en la tarde de mórula y blastocisto etapas (Figura 2A). Además, la distribución espacial de neogenin estaba restringida principalmente a células fuera. Los resultados del análisis RT-PCR fueron consistentes con la naturaleza temprana y transitoria de la expresión neogenin, alcanzando un máximo en la etapa de 4 células pero que carecen completamente en la fase de 16 células o posterior (Figura 2B). Por el contrario, F-actina no reveló un patrón tal transitoria y polarizada expresión.
A continuación se investigó si los niveles neogenin podrían ser manipulados por microinyección de vectores que neogenin cDNA (ganancia) neogenin o vectores que albergan shRNA orientación neogenin (neogenin loss) en el zigoto 2-PN. Para diferenciar visualmente ganancia neogenin de la pérdida neogenin, RFP y GFP se co-expresó como indicadores (Figura 3), y el resultante neogenin nivel de expresión se confirmó tanto por inmunofluorescencia y por inmunotransferencia (Figura 4).
La Figura 5 muestra imágenes representativas de los embriones en cada etapa después de recibir ya sea neogenin shRNA o neogenin ADNc en la etapa 2-PN. Aparentemente no hubo diferencias morfológicas entre la pérdida de neogenin y embriones de ganancia neogenin, y no hay diferencias de potencial de desarrollo al menos hasta el estadio de blastocisto (Tabla 2). De hecho, tanto el número de embriones que sobreviven en cada etapa y el número de embriones detenidos no fueron significativamente diferentes.
Sin embargo, el desarrollo ICM fue menos pronunciado en la pérdida de neogenin neogenin embriones de ganancia comose evidencia por una mayor expresión de ICM-específica Oct3 / 4 en los embriones de ganancia neogenin (Figura 6A) y mediante un mayor número de células ICM Oct3 / 4-positivos por blastocisto en la ganancia de neogenin que los embriones de pérdida de neogenin (Figura 6B). Además, el análisis RT-PCR reveló una fuerte correlación entre el nivel de expresión de los tres factores de transcripción y la de neogenin. En los blastocistos de pérdida de neogenin, poco Oct3 / 4, Sox2, y Nanog se detectaron, que está en agudo contraste con un aumento significativo en la expresión de los tres factores de transcripción en la ganancia de neogenin sobre los embriones de control (Figura 6C). Inesperadamente, los niveles de expresión de Cdx2 y Tead4, factores de transcripción implicados en la diferenciación TE / mantenimiento de 6,7, fueron menos influenciados por el nivel de expresión de neogenin, validando que la regulación de neogenin conduce a la activación de los reguladores transcripcionales específicos de ICM, pero no para el establecimiento de TE. Todos los datos que se muestran son m odified de referencia 9.
Figura 1: La estructura de pcDNA-EmGFP-miR-neogenin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Expresión de Neogenin Durante el desarrollo de embriones de ratón (A) Imágenes microscópicas confocales de expresión neogenin en la preimplantación de embriones en diferentes etapas de desarrollo. (B) La reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa de mRNA en neogenin preimplantación de embriones en diferentes etapas de desarrollo. β-actina se utilizó como control interno.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Proteína Verde Fluorescente (GFP) y la proteína roja fluorescente (RFP) Expresión como indicadores para Neogenin Pérdida y Neogenin ganancia, respectivamente, después de la microinyección de un vector shRNA neogenin de metas de albergar GFP conjugado o microinyección de un vector de ADNc neogenin albergar RFP en 2-PN cigotos, la expresión de GFP y RFP se visualizó con un microscopio de fluorescencia a las etapas 2 y 4 de las células en células. Panel izquierdo, imágenes de contraste de fase; paneles central y derecha, imágenes de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Expresión de Neogenin en un blastocisto después de la microinyección de cualquiera de shRNA orientación Neogenin o Neogenin ADNc (A) después de la microinyección de un vector shRNA neogenin-focalización en cigotos 2-PN, el nivel de expresión de neogenin en las células de blastocisto individuales se evaluó inmunotinción con anticuerpos anti-fLAG. En el panel izquierdo, revueltos neogenin shRNA vectores con microinyecciones (control). En el panel derecho, con microinyecciones shRNA vectores neogenin de metas. DAPI, DAPI (azul) se utilizó para teñir el núcleo; Anti-Flag, la visualización de la etiqueta de bandera en neogenin (rojo); GFP, proteína fluorescente verde (verde); fusionado, superposición de DAPI, anti-bandera, y GFP. (B) lisados de células enteras de blastocistos fueron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-flag. GFP se utilizó como control de carga. ShRNA revueltos, huevos revueltos neogenin inyección shRNA; Ng shRNA, neogenin de metas de injec shRNA ción. (C) Los vectores neogenin ADNc o los vectores shRNA neogenin de metas de microinyecciones en los cigotos 2-PN y los blastocistos resultantes se sometieron a inmunotinción con anticuerpos anti-neogenin para medir el nivel de expresión neogenin. En el panel superior, se inyectó neogenin de metas de shRNA. Los blastocistos fueron immunostained con anticuerpos anti-neogenin (rojo). GFP, proteína fluorescente verde (verde); Fusionado, superposición de DAPI, anti-neogenin, y GFP. En el panel inferior, con microinyecciones vectores de ADNc neogenin. Los blastocistos fueron immunostained con anticuerpos anti-neogenin (verde). tinción nuclear DAPI, DAPI (azul); RFP, proteína fluorescente de color rojo (rojo); Fusionado, superposición de DAPI, RFP, y anti-neogenin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5: Efectos de la pérdida o ganancia en Neogenin desarrollo embrionario. 2-PN embriones de ratón con microinyecciones ya sea con pequeños ARN de horquilla (shRNA) focalización neogenin (neogenin pérdida) o con vectores que albergan neogenin ADNc (ganancia neogenin) y se cultivaron hasta llegar a la etapa de blastocisto. Para diferenciar la pérdida neogenin a partir de embriones de ganancia neogenin, GFP y RFP se co-expresan, respectivamente. Fase de contraste de las imágenes de embriones en diferentes etapas de desarrollo se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La sobreexpresión de los favores Neogenin ICM Diferenciación de células (A) ICM en blastocistos fueron vistos por inmunotinción para Oct3 / 4.. DAPI se utilizó para staen el núcleo. (B) El número de células ICM / 4-positivo Oct3 en un blastocisto de control, la pérdida de neogenin, y embriones de ganancia neogenin se representan como la media ± SEM de tres experimentos independientes con al menos 10 embriones utilizados en cada experimento. * Diferencias significativas de control a P <0,05 por la prueba t de Student. Análisis (C) RT-PCR de Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2, y Tead4 ARNm a partir de blastocistos de pérdida neogenin, aumento neogenin, y los embriones de control. β-actina se utilizó como control interno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: secuencias de los cebadores y condiciones de PCR usados para la RT-PCR.
Tabla 2: El número de embriones de ratón Sobrevivir en cada etapa de desarrollo después de recibir Neogenin shRNA o Neogenin ADNc en la Etapa 2-PN.
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Discussion
En el presente protocolo, demostramos nuevos métodos de microinyección de materiales genéticos, ADNc o shRNA, en los embriones de 2 PN ratón para explorar el papel de neogenin en la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana del ratón. La modificación genética de preimplantación de embriones es una técnica de gran alcance en el descubrimiento de información clave sobre los mecanismos subyacentes moleculares para, por ejemplo, la primera determinación del linaje celular. La modificación genética es uno de los métodos más utilizados para determinar la función de genes. Con relativamente grande receptibilidad de los embriones 2-PN para materiales genéticos extranjeros y la viabilidad de la microinyección de cDNA y shRNA en los embriones 2-PN, esta técnica de la manipulación de embriones se puede implementar con una interrupción física mínima para el embrión, por no mencionar el intrínseca complementariedad asociada con esta manipulación genética.
Teniendo en cuenta que la inyección citoplásmica es más fácil y menos perjudicialpara la supervivencia de la inyección nuclear, pero, sin embargo, una mayor expresión de ADN extraño asociado con la inyección nuclear, una mejora que se debe destacar es el uso de centrifugación para posicionar los pronúcleos antes de la microinyección en el núcleo. El paso más técnicamente sofisticado y exigente es la microinyección de ADN extraño en el pronúcleo del óvulo fertilizado. Este paso es crítico y requiere una considerable habilidad técnica y una amplia formación para dominar el procedimiento de microinyección. Una vez que esta habilidad se adquiere sin embargo, la variabilidad técnica y se convierten en errores mínimos. La supervivencia de los embriones rutina de microinyección es entre el 80-90% en nuestras instalaciones.
A diferencia de este estudio, otros investigadores posicionados embriones mediante la celebración de la pipeta de manera que un pronúcleo cerca de la membrana plasmática estaba cerca de la microaguja. A continuación se introduce la micro-aguja en el pronúcleo 10,11. Hemos experimentado algunas dificultades para la visualización de la pronúcleo correctamente bajo el microscopio sin centrifugación. Obviamente, centrifugación trae el núcleo cerca de la membrana plasmática para una mejor identificación. Al mismo tiempo, debe haber algún margen de mejora para una mejor visualización de este modo un mejor posicionamiento del pronúcleo.
Contrariamente a la producción de ratones transgénicos, nuestro protocolo para la microinyección de plásmidos en embriones es una transfección transitoria por naturaleza, y por lo tanto adecuado para la disección de la función de genes durante el desarrollo embrionario de preimplantación. Por lo tanto, nuestro protocolo para una deficitaria y la técnica de ganancia de función se podrían generalizar aún más para identificar moléculas que participan en el desarrollo embrionario temprano de señalización.
Además, la señalización neogenin podría ser altamente beneficiosa para el desarrollo de líneas de células madre embrionarias, dado que neogenin y sus ligandos es probable que mejorar de células madre factores específicos de transcripción como Oct3 / 4, Sox2, y Nanog.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses en competencia de interés económico alguno.
Acknowledgments
Los autores también desean reconocer el grupo del Dr. Xiong en el Georgia Health Sciences University para la fabricación y distribución de los constructos de vectores de ADNc y neogenin shRNA. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Programa Básico de Investigación Científica (2013R1A1A4A01012572), financiado por la Fundación de Investigación de Corea y por una beca de investigación de la Universidad de Sahmyook.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
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